郝俊光,周月南,尹花,余俊紅,董建軍

1(青島啤酒股份有限公司,啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東 青島， 266100) 2 (欽州學(xué)院 食品工程學(xué)院，廣西 欽州，535011)

啤酒中源自酒花α-酸的苦味物質(zhì)研究進(jìn)展

郝俊光1，2,周月南1,尹花1,余俊紅1,董建軍1

1(青島啤酒股份有限公司,啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東 青島， 266100) 2 (欽州學(xué)院 食品工程學(xué)院，廣西 欽州，535011)

提升啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性是當(dāng)前啤酒界公認(rèn)的技術(shù)難點與研究熱點。貯存過程中啤酒苦味強(qiáng)度的下降、苦感由舒服的苦感向粗糙和后苦的苦感轉(zhuǎn)化，是啤酒風(fēng)味老化的重要表現(xiàn)。隨著分離純化以及鑒定檢測水平的提升，國外同行對可能引起啤酒苦味粗糙與后苦的物質(zhì)和反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，取得了突破性的進(jìn)展。文中對啤酒釀造中源自酒花α酸的苦味物質(zhì)，尤其是引起啤酒后苦與粗糙的三環(huán)和四環(huán)異α-酸降解產(chǎn)物的特性及產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)的介紹，旨在提升國內(nèi)同行對啤酒苦味質(zhì)量的認(rèn)知。

啤酒；酒花；苦味物質(zhì)；后苦；粗糙；三環(huán)；四環(huán)；綜述

啤酒作為一種傳承久遠(yuǎn)的飲料，其宜人的香味、舒服的苦味是吸引消費者的主要因素。提升啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性、延緩啤酒的老化是當(dāng)前啤酒行業(yè)的研究熱點和難點[1-4]。啤酒老化可分為氣味劣化和味覺劣化兩方面[4-7]。啤酒氣味劣化表現(xiàn)為啤酒的典型風(fēng)味如醇酯等濃度的下降和老化醛(如反-2-壬烯醛)等高風(fēng)味活性揮發(fā)性老化物質(zhì)的增加[1-4]；味覺的劣化則表現(xiàn)為甜味的增加、苦味強(qiáng)度的降低以及苦感由舒服向粗糙、后苦的劣變[4-7]。

延緩啤酒味覺與氣味的劣化對提升啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性有著同等重要的作用。人們對于引起啤酒老化氣味的原因研究較多，長久以來，由于檢測鑒定技術(shù)的落后限制了人們對引起苦感劣變的微量成分的認(rèn)知，只能通過跟蹤α-酸、異α-酸等主成分的衰減推測可能是源自它們的氧化或降解反應(yīng)新產(chǎn)物改變了啤酒的苦味強(qiáng)度和苦味質(zhì)量[8-10]。近十余年來，國外研究者借助高精度核磁共振及高分辨質(zhì)譜HPLC MSMS等技術(shù)，開始對啤酒釀造和貯存過程源自α-酸的微量苦味衍生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并對其變化規(guī)律和反應(yīng)機(jī)理和特性進(jìn)行了探討[11-21]。

1 啤酒苦味的復(fù)雜性

啤酒的苦味來源非常復(fù)雜，除源自酒花苦味酸的成分外，還有來自釀造過程的苦味肽、氨基酸、多酚等成分[8]。生產(chǎn)實踐過程中，人們認(rèn)識到啤酒苦味質(zhì)量與酒花品種、酒花添加方式和工藝、啤酒生產(chǎn)實踐、貯存條件等有關(guān)[22-28]。

源自酒花的啤酒苦味物質(zhì)很多，包括聚酮類物質(zhì)(如α、β酸)、 聚查爾酮類物質(zhì)(如黃腐酚)以及麥汁煮沸過程中相關(guān)轉(zhuǎn)化物(如異α-酸、葎草靈酮、希魯酮、異黃腐酚等)、異α-酸的還原制品等[11-21]。不同酒花苦味物質(zhì)的苦味強(qiáng)度和質(zhì)量不同，而異α-酸對啤酒苦味貢獻(xiàn)最大。RIGBY等[29]認(rèn)為異合葎草酮比例高會引起粗糙且強(qiáng)烈的苦感[22-28]，而WACKERBAUER等[30]、 KUSCHE等[31]則提出相反的觀點。不過，在當(dāng)前的釀造實踐中很多釀酒師仍堅持將降低啤酒的異合葎草酮比例作為提升啤酒苦味質(zhì)量的一個有效途徑。

苦感不僅與苦味物質(zhì)組成有關(guān)，還受到啤酒基體物質(zhì)的影響。OLADOKUN等[32-33]報道啤酒中過量多酚的存在會促使酒花苦味酸含量高的啤酒產(chǎn)生粗糙和后苦味，酒花香氣的組成和強(qiáng)度明顯影響人們對啤酒的苦味強(qiáng)度和質(zhì)量的評價。

長久以來，人們一直試圖對啤酒在釀造和貯存過程中苦味強(qiáng)度和質(zhì)量的變化實質(zhì)進(jìn)行探討，但由于檢測鑒定技術(shù)的落后，制約了啤酒貯存過程中苦味質(zhì)量由舒服的苦感向粗糙和后苦苦感轉(zhuǎn)變的內(nèi)在認(rèn)知。很明顯，酒花中的苦味物質(zhì)(軟樹脂如α、β酸、硬樹脂如黃腐酚)及其衍生物是啤酒苦味的主要來源物質(zhì)。最近10年，高分辨質(zhì)譜HPLC MSMS等技術(shù)的應(yīng)用，人們對α-酸、β酸的衍生物及硬脂酸的組成取得了突破性的進(jìn)展[11-21]。為系統(tǒng)介紹國外在酒花苦味物質(zhì)及其衍生物在啤酒釀造和貯存過程的組成變化和特性等方面的認(rèn)知，本團(tuán)隊將分別對源自酒花α-酸的苦味物質(zhì)和源自β酸及硬脂酸的苦味物質(zhì)進(jìn)行綜述。

2 源自酒花α-酸的苦味物質(zhì)的特性和生成機(jī)理

2.1 α-酸

酒花中α-酸是啤酒苦味的主要來源，最高可占酒花干物質(zhì)的17%以上，由6種含不同?；鶄?cè)鏈的同系物構(gòu)成[34]。其中合葎草酮、葎草酮和加葎草酮占α-酸的98%，而后葎草酮、前葎草酮、加前葎草酮只占不到2%，6者的側(cè)鏈分別是甲基乙基、2-甲基丙基、1-甲基丙基、乙基、甲基丁基、戊基。由于后3者含量甚微，下文不做討論。盡管α-酸具有一定的苦味，但由于其相對疏水性高、釀造損失大等原因，決定了α-酸自身對Lager啤酒苦味貢獻(xiàn)較少[35]。

α-酸對釀酒的重要意義是在加熱條件下異構(gòu)化生成啤酒苦味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)-異α-酸。隨著科技的進(jìn)步，人們認(rèn)識到由α-酸衍生出的苦味物質(zhì)遠(yuǎn)不止異α-酸。圖1列出了目前已確認(rèn)的源自α-酸的所有苦味物質(zhì)，分別α-酸(1)、異α-酸(2、3)、葎草靈酮(4)、三環(huán)和四環(huán)異α-酸降解產(chǎn)物(5-9)、葎草酸(10、11)、同異α-酸(12、13)及其過氧化物(14、15)和羥基化物(16、17)、三環(huán)葎草乳醇(18)、天蝎葎草酮(19)、同葎草靈酮的過氧化物(20)和羥基化物(21)。

注：1a-c、葎草酮；2a-c、反式異葎草酮；3a-c、順式異葎草酮；4a-c、葎草靈酮；5a-c、三環(huán)葎草醇；6a-c、三環(huán)葎草烯；7a-c、異三環(huán)葎草烯；8a-c、四環(huán)葎草醇；9a-c、差向異構(gòu)四環(huán)葎草醇；10a-c、反式葎草酸；11a-c、順式葎草酸；12a-c、反式同異葎草酮；13a-c、順式同異葎草酮；14a-c、氫過氧化-反式同異葎草酮；15a-c、氫過氧化-順式同異葎草酮；16a-c、羥基-反式同異葎草酮；17a-c、羥基-順式同異葎草酮；18a-c、三環(huán)葎草乳醇；19a-c、天蝎葎草酮；20a-c、4′-氫過氧化-同葎草靈酮；21a-c、4′-羥基-同葎草靈酮。注側(cè)鏈 R是 -CH(CH3)2的為a，合；側(cè)鏈 R是-CH2CH(CH3)2的為b，/；側(cè)鏈 R是-CH(CH3)CH2CH3的為c、加。如1a、合葎草酮；1b、葎草酮；1c、加葎草酮；依次類推。圖1 源自酒花α-酸的苦味衍生物質(zhì)[14,16-17]Fig.1 Bitter compounds in beer originated from hop α-acids

2.2 異α-酸

在麥汁煮沸過程中，α-酸會發(fā)生重排、環(huán)化、氧化等多種反應(yīng)[36]，而異構(gòu)化成異α-酸是酒花在啤酒釀造過程中最主要的反應(yīng)。異α-酸的形成機(jī)理是α-酸通過經(jīng)質(zhì)子化和酮醇重排，形成了五環(huán)上有兩個手性碳原子的順反異α-酸混合物[36-37]。每種異α-酸有順式和反式兩種異構(gòu)體，順式是指4位碳原子上羥基和5位碳原子的異戊烯基在-五環(huán)結(jié)構(gòu)同一側(cè)，反式則相反。-α-酸異構(gòu)化成順式和反式異α-酸的反應(yīng)活化性能不同，順式較反式高9 kJ/mol,因而順式異α-酸的熱穩(wěn)定更強(qiáng)[38]。

傳統(tǒng)的酒花添加方式下麥汁煮沸過程α-酸異構(gòu)化率約為50%～60%，而最終啤酒的α-酸利用率僅約35%～40%[9-10,38]。煮沸的工藝、酒花添加的形式、煮沸強(qiáng)度、麥汁濃度以及酒花品種等均可影響啤酒的異構(gòu)化率[9,38]。而發(fā)酵過程中酵母的吸附、二氧化碳溢出、過濾介質(zhì)的阻擋等均會造成異α-酸的損失，從而降低酒花α-酸的最終利用率[10,37]。ONO等[39]和IRWIN等[40]證實煮沸過程中合葎草酮的異構(gòu)化率明顯高于葎草酮和加葎草酮。HUGHES等[41]證實異合葎草酮親水性較強(qiáng)、在發(fā)酵中的損失相對少，導(dǎo)致其在成品啤酒異α-酸中的占比提高[41]。Lager啤酒22 ℃貯存9個月，啤酒的順反異α-酸比(T/C)可由原來的0.4降至0.15左右，降幅明顯，T/C可用于指示啤酒老化程度[10]。

異α-酸的閾值為5 mg/L，但不同的異α-酸同系物的苦味強(qiáng)度不同。KAPPLER等[42]發(fā)現(xiàn)順反異構(gòu)異葎草酮混合物比單純的反式異葎草酮更苦。HUGHES等[43]發(fā)現(xiàn)順式異α-酸比對應(yīng)的反式異α-酸苦、異葎草酮比異合葎草酮更苦。

2.3 葎草靈酮

酒花貯存和麥汁煮沸過程中均會生成葎草靈酮。葎草靈酮較對應(yīng)的異α-酸在五環(huán)上多了一個羥基，且只存在反式結(jié)構(gòu)，反應(yīng)機(jī)理尚不完全清楚[15-16,36]。ALGAZZALI等[44]將純化的葎草靈酮與異α-酸進(jìn)行苦味強(qiáng)度對比，得出葎草靈酮的苦味是異α-酸的66%，且苦感柔和。麥汁煮沸過程中有不到10%的α-酸轉(zhuǎn)化成葎草靈酮，葎草靈酮對Lager啤酒的酒花苦味影響較少，但該物質(zhì)對大量干加酒花的IPA啤酒的作用不能被忽略[22,36]。MAYE等[22]發(fā)現(xiàn)在干加啤酒中葎草靈酮的含量可高達(dá)24 ppm，且過高含量的葎草靈酮會加劇釀造過程異α-酸的損失。

2.4 三環(huán)和四環(huán)異α-酸降解產(chǎn)物

麥汁煮沸、啤酒發(fā)酵和貯存過程中異α-酸會發(fā)生降解反應(yīng)。INTELMANN等[11-12]利用NMR和LC MS證實了反式異α降解成三環(huán)葎草醇、三環(huán)葎草烯、異三環(huán)葎草烯、四環(huán)葎草醇及異四環(huán)葎草醇的存在，且證實它們是引起啤酒的后苦和苦味劣化的主要原因。三四環(huán)異α-酸降解產(chǎn)物生成的機(jī)理[11](見圖2)是反式異α-酸異己烯酰側(cè)鏈的碳離子質(zhì)子化后形成中間態(tài)正碳離子A，被另一異戊二烯側(cè)鏈上的次甲基碳原子的π-電子云攻擊從而環(huán)化形成過渡態(tài)正碳離子B。B受異戊二烯側(cè)鏈上烯碳離子的攻擊形成過渡態(tài)正碳離子C，C可經(jīng)水分子親核加合生成三環(huán)葎草醇(5)或失掉不同位置的一個氫離子生成兩種不飽和的三環(huán)葎草烯(6、7)。而正碳離子B與水分子結(jié)合后生成過渡態(tài)醇D，其?；鶄?cè)鏈上羰基質(zhì)子化后誘發(fā)了異戊烯側(cè)鏈和羰基側(cè)鏈的分子間環(huán)化，從而形成構(gòu)像不同的四環(huán)物質(zhì)(8，9)[11]。

圖2 異α-酸的三環(huán)(5-7)和四環(huán)(8、9)降解反應(yīng)途徑 Fig.2 Proposed degradation pathway for tri- and tetra-cyclic compounds originated from iso α-acids

2.5 葎草酸

葎草酸由異α-酸在有氧條件下的自氧化產(chǎn)生[16,45]，反應(yīng)途徑見圖3。由于空間阻隔的原因，反式-異葎草酮不能直接轉(zhuǎn)化成葎草酸。反式-異葎草酮須先轉(zhuǎn)化成葎草酮，再轉(zhuǎn)變成順式-異葎草酮，然后由順式-異葎草酮轉(zhuǎn)化成葎草酸；而順式-異葎草酮可直接轉(zhuǎn)換成反式葎草酸，也或先生成順式葎草酸，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成反式葎草酸[16,45]。

圖3 形成順式-異葎草酸(10)、反式-異葎草酸(11)的反應(yīng)途徑[16,45]Fig.3 Proposed reaction pathway for the formation of trans- and cis-humulinic acids

2.6 葎草靈酮的過氧化物和羥基化物

氫過氧化異α-酸和羥基異α-酸會由順反異α-酸產(chǎn)生[14]，能在貯存的啤酒中檢測出來。反應(yīng)機(jī)理(見圖4)跟脂肪酸自氧化相似[14]。首先異α-酸上的一個氫原子被起始自由基奪走從而在異己烯?；膫?cè)鏈上形成共振穩(wěn)定的自由基。該自由基跟活性氧結(jié)合形成過氧化自由基，而該自由基又可以作為起始自由基作用于其他異α-酸上引起鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而形成氫過氧化物異α-酸。氫過氧化物異α-酸在過渡粒子如Fe2+或光的作用下，裂解成烷氧基自由基，并從氫供體得到一個氫便生成了羥基異α-酸[14]。

圖4 形成同異葎草酮的過氧化物(14、15)和羥基化物(16、17)的反應(yīng)途徑Fig.4 Proposed reaction pathway for the formation of cis- and tran-hydroperoxy-alloisohumulones & hydroxyl-alloisohumulones

2.7 三環(huán)合葎草乳醇與天蝎葎草酮

INTELMANN等[16]首次在用NMR和LC MS技術(shù)證實了三環(huán)合葎草乳醇與天蝎葎草酮的存在，推測反應(yīng)機(jī)理(見圖5)是：反式異α-酸(2)自氧化生成氫過氧化-反式同異葎草酮(14)，再經(jīng)FENTON降解生成烷氧自由基a，進(jìn)而生成羥基-反-同異葎草酮(16)。 烷氧-自由基a生成環(huán)氧中間物b，發(fā)生與脂肪酸自氧化一樣的重排、過氧化反應(yīng)，生成半縮酮c。c釋放出一個丙酮酸，然后烯醇化，生成含氧醛d，再經(jīng)類似由異α-酸變成三環(huán)苦味物質(zhì)生成的質(zhì)子催化的環(huán)化反應(yīng)，生成正態(tài)碳原子e。e經(jīng)結(jié)合一個分子的水后環(huán)化閉合，生成了半縮醛三環(huán)葎草乳醇(18)。羥基-反-同異葎草酮(16)生成天蝎葎草酮的過程，類似由異α-酸變成三環(huán)苦味物質(zhì)生成的質(zhì)子催化的環(huán)化反應(yīng)。起始的環(huán)化是將己烯基鏈上的酮轉(zhuǎn)化成羥基，進(jìn)而生成正碳離子f，而后結(jié)合一個水分子，形成叔丁醇g。烯丙基經(jīng)質(zhì)子催化脫水后與叔丁醇發(fā)生親核反應(yīng)，從而環(huán)化成天蝎合葎草酮(19)[16]。

2.8 同α-酸及其過氧化物和羥基化物

TANIGUCHI等[17]首次報道了4′-羥基同葎草靈酮在酒花貯存過程中的存在。4′-羥基同葎草靈酮是葎草靈酮的氧化產(chǎn)物[17]，生成路徑與INTELMANN等[17]建議的異α-酸生成羥基同合葎草酮的路徑相同[16-17](見圖6)。

圖5 形成三環(huán)葎草乳醇(18)和天蝎葎草酮(19)的反應(yīng)途徑Fig.5 Proposed reaction pathway for the formation of tricyclochumulactols(18)，scorpiohumols(19)

圖6 形成4′-氫過氧化-同葎草靈酮(20)、4′-羥基-同葎草靈酮(21)的反應(yīng)途徑Fig.6 Proposed reaction pathway for the formation of 4′-hydroperoxy-allohumulinones(20)，4′-hydroxy-allohumulinones(21)

3 α-酸、異α-酸及衍生物在釀造、貯存過程的變化

INTELMANN等[12]首次發(fā)現(xiàn)啤酒貯存過程中反式異α-酸(2)在貯存條件下降解生成三和四環(huán)降解產(chǎn)物[12]，并通過純化和反添加試驗證實這些降解產(chǎn)物是啤酒貯存過程中引起后苦和苦味粗糙的直接原因。他們通過三杯法確定出5%pH4.4水溶液中這些物質(zhì)的閾值(見表1)[12]，發(fā)現(xiàn)三環(huán)合葎草烯和異三環(huán)合葎草烯的閾值較低，分別是5和10 μmol/L，比前驅(qū)體反式異合葎草酮的閾值還低。三環(huán)葎草醇和四環(huán)葎草醇、差向異構(gòu)四環(huán)葎草醇的閾值則相對較高[12]。由于苦味質(zhì)是基于275 nm波長下吸光值的參數(shù)，α-酸、異α-酸的衍生物在此波長下多有吸收[5,9]。根據(jù)筆者的經(jīng)驗，苦味質(zhì)在啤酒貯存過程中波動極小，故用傳統(tǒng)的苦味質(zhì)檢測方法很難表征出苦味物質(zhì)的變化。由于檢測三元和四元環(huán)等降解產(chǎn)物需要高精度HPLC-MS-MS等成本昂貴的設(shè)備，所以目前此類物質(zhì)在釀造和貯存過程的變化的研究仍局限在INTELMANN等人的實驗室。目前α-酸相關(guān)衍生產(chǎn)物在貯存和釀造過程中的變化情況跟蹤是片面和碎片化的，尚未形成系統(tǒng)的認(rèn)識，本文按啤酒釀造、啤酒貯存和酒花貯存過程的變化情況進(jìn)行總結(jié)。

表1 反式異葎草酮及其降解產(chǎn)物的閾值Table 1 Threshold concentrations of trans-isocohumulone and its tri- and tetra-cyclic degradation compounds

3.1 釀造過程的變化

HASELEU等[15]跟蹤了麥汁煮沸和發(fā)酵過程中α-酸(1)、異α-酸(2、3)、葎草靈酮(4)、三環(huán)葎草酮(5)、葎草酸(10、11)、羥基同異葎草酮(14、15)、羥基同異葎草酮(16、17)苦味物質(zhì)的變化，比較了麥汁和成品啤酒苦味物質(zhì)的差異。麥汁、不同時期的發(fā)酵液1-6、啤酒為同一釀造過程的樣品。α-酸(1)在麥汁中含量很高，但在啤酒中含量非常少，麥汁中1a、1b、1c含量分別是啤酒中8、17、25 倍。同時，麥汁中的異α-酸濃度高于對應(yīng)的啤酒，且無論順式還是反式，異合葎草酮(2a、3a)的利用率和異構(gòu)化率均高于對應(yīng)的異葎草酮(2b、3b)。煮沸過程中，α-酸(1)除了異構(gòu)化外，還有約10%轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的葎草靈酮(4)，在啤酒釀造過程略有下降， 4a、4b、4c在啤酒中的含量分別占初始α-酸的6%、6.6%、7.4%。葎草酸(10、11)、羥基同異葎草酮(14、15)、羥基同異葎草酮(16、17)等異α-酸氧化產(chǎn)物在麥汁中就已存在，三者總和約占初始α-酸的4.1%，其中7b、15b、16b的含量相對較高。三環(huán)葎草酮(5)在麥汁中無檢出，但在發(fā)酵液和成品啤酒中有檢出，或許與啤酒發(fā)酵過程中pH降低相關(guān)[15]。

3.2 啤酒貯存過程的變化

INTELMANN等[12]通過對不同貯存條件下啤酒的苦味物質(zhì)進(jìn)行跟蹤比對，發(fā)現(xiàn)貯存溫度越高、貯存時間越長、啤酒pH越低，越能加速生成反式異α-酸的降解成三環(huán)葎草酮(5)、三環(huán)合葎草烯(6)、異三環(huán)合葎草烯(7)、四環(huán)葎草醇(8)、差向異構(gòu)四環(huán)葎草醇(9)。INTELMANN等[14]對新鮮啤酒(啤酒1)、28 ℃貯存8個月(啤酒2)、玻璃瓶裝室溫放置4年的啤酒(啤酒3)、室溫放置10年的啤酒(啤酒4)、室溫放置4年的PET瓶裝啤酒(啤酒5)、新鮮啤酒22 ℃條件下與氧接觸24 h后的酒樣(啤酒6)的異α-酸(2、3)、三環(huán)葎草酮(5)、氫過氧化同異葎草酮(14、15)、羥基同異葎草酮(16、17)進(jìn)行了跟蹤檢測。發(fā)現(xiàn)新鮮啤酒中就已經(jīng)存在異α-酸降解產(chǎn)物三環(huán)葎草酮(5)，在玻璃瓶裝4年、PET瓶裝的4年啤酒中含量更高。反式異α-酸在貯存4年的兩種瓶裝形式啤酒中的含量都極低，但不同的是，順式異α-酸(3)在PET瓶中含量甚微，在玻璃瓶裝的啤酒中卻大量存在?？赡艿慕忉屖?PET瓶能夠滲入較多的空氣,而順式異α-酸被滲入的氧氣氧化掉了，但有意思的是在PET瓶裝4年啤酒的氫過氧化同異葎草酮(14、15)、羥基同異葎草酮(16、17)含量卻甚微。為了解釋這一現(xiàn)象，INTELMANN等[14]做了驗證實驗。將啤酒在有氧條件下室溫反應(yīng)24 h進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)啤酒中順式異α-酸(3)含量下降，而羥基同異葎草酮(14、15)、羥基同異葎草酮(16、17)明顯呈現(xiàn)上升趨勢，而氫過氧化同異葎草酮(14b、15a、15b)、羥基同異葎草酮(16b、17a)增加顯著。據(jù)此，INTELMANN等[14]認(rèn)為羥基同異葎草酮(16、17)雖在有氧條件下可以迅速產(chǎn)生，但這類物質(zhì)也不穩(wěn)定，會逐漸轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，不能作為啤酒氧化的指示劑[14]。

INTELMANN等[16]雖然在溶液模型中鑒定出三環(huán)葎草乳醇(18)、天蝎合葎草酮(19)，并對其形成機(jī)理進(jìn)行了推測，但并未在啤酒實際樣品中檢出這些物質(zhì)。為確認(rèn)貯存時間對玻璃瓶裝啤酒的α-酸衍生產(chǎn)物含量的影響，INTELMANN等[16]對市售啤酒在28 ℃暗處貯存582 d的啤酒每隔兩周取樣檢測α-酸(1)、異α-酸(2、3)、葎草靈酮(4)、三環(huán)葎草酮(5)、三環(huán)合葎草烯(6)、異三環(huán)合葎草烯(7)、四環(huán)葎草醇(8)、差向異構(gòu)四環(huán)葎草醇(9)、葎草酸(10、11)、氫過氧化同異葎草酮(14、15)、羥基同異葎草酮(16、17)的含量，結(jié)果見圖7。很明顯，α-酸(1)、反式異α-酸(2)和葎草靈酮(4)在貯存過程中降幅明顯，而順式異α-酸(3)在長期貯存過程中略有下降。據(jù)此，INTELMANN等[16]推斷合葎草酮的半衰期是100 d、葎草靈酮(4b)和反式異合葎草酮(2a)半衰期均為140天左右。貯存過程中，葎草酸(10、11)增加明顯，甚至在反式異α-酸完全消耗殆盡后仍有增加，可能與順反葎草酮可由順式異α-酸反應(yīng)而來有關(guān)。三環(huán)葎草酮(5)、三環(huán)合葎草烯(6)、異三環(huán)合葎草烯(7)、四環(huán)葎草醇(8)、差向異構(gòu)四環(huán)葎草醇(9)，作為反式異α-酸(2)的質(zhì)子催化的降解產(chǎn)物，在貯存過程中一直增加，達(dá)到峰值后并無降低趨勢，可以推測這些物質(zhì)是降解反應(yīng)的穩(wěn)定終產(chǎn)物[16]。反式氫過氧化同異葎草酮(14)在貯存過程中呈下降趨勢，而順式氫過氧化同異葎草酮(15)呈上升趨勢。反式羥基同異葎草酮(16)呈先升后降的趨勢，而順式羥基同異葎草酮(17)呈上升趨勢。

INTELMANN等[16]進(jìn)一步對市售啤酒的pH、貯存溫度進(jìn)行研究，提出降低pH、降低貯存溫度和縮短貯存時間對抑制反式異α-酸降解成三環(huán)葎草酮(5)、三環(huán)合葎草烯(6)、異三環(huán)合葎草烯(7)、四環(huán)葎草醇(8)、差向異構(gòu)四環(huán)葎草醇(9)等粗糙和后苦物質(zhì)的生成是提高苦味穩(wěn)定性的有效方式。

圖7 貯存時間對啤酒中源自酒花α-酸的苦味物質(zhì)的影響Fig.7 Influence of time on the concentrations of bitter compounds in beer originated from hop α-acids during storage of beer at 28 ℃

3.3 酒花貯存過程的變化

TANIGUCHI等證實4′-氫過氧化-同葎草靈酮(20)、4′-羥基-同葎草靈酮(21)由酒花α-酸的氧化產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化而來，并發(fā)現(xiàn)葎草靈酮不穩(wěn)定，很容易轉(zhuǎn)變成4′-羥基-同葎草靈酮(21)。酒花20 ℃條件下貯存4周后，α-酸濃度由初始的86.9 μmol/g降至37.0 μmol/g，而葎草靈酮和4′-羥基-同葎草靈酮升為32.3和27.0 μmol/g，分別是初始值的17% 和 14%。酒花40 ℃貯存8個周后，α-酸僅為初始值的5%。葎草靈酮在前3周達(dá)到峰值33.2 μmol/g，隨后急劇下降；而4′-羥基-同葎草靈酮在前2-5周增幅明顯，而6周后增幅變緩直至11周時達(dá)到峰值51.3 μmol/g，占α-酸初始值的27%。據(jù)此，可以肯定4′-羥基-同葎草靈酮是由葎草靈酮降解而來的。酒花60 ℃貯存時相關(guān)物質(zhì)的變化曲線與40 ℃的相似，只不過反應(yīng)速度高了10倍。α-酸只用72 h降為初始值的5%，而葎草靈酮在48 h達(dá)到峰值后迅速降解，而4′-羥基-同葎草靈酮在144 h達(dá)到峰值后緩慢下降。目前尚未在啤酒中鑒定出4′-羥基-同葎草靈酮[17]。

4 展望

α-酸相關(guān)衍生產(chǎn)物的形成機(jī)理和檢測技術(shù)的有益探討為人們認(rèn)知啤酒的苦味質(zhì)量、提高啤酒苦味穩(wěn)定性提供了技術(shù)支撐。如何降低三環(huán)和四環(huán)降解產(chǎn)物的含量，無疑是啤酒釀造行業(yè)降低后苦粗糙的努力方向之一。降低貯存溫度和適當(dāng)提高酒液pH是目前簡單可行的提升苦味穩(wěn)定性的策略。而隨著科技的進(jìn)步，或許有更多的含量甚微卻對苦感影響大的苦味物質(zhì)被鑒定出來，進(jìn)一步完善人們對啤酒苦味控制的認(rèn)知。長遠(yuǎn)而言,如能實現(xiàn)在啤酒釀造中使用純品順式異α-酸，或許是從根本上解決啤酒苦味穩(wěn)定性問題的理想手段。國內(nèi)相關(guān)研究機(jī)構(gòu)，如能積極開發(fā)酒花(異)α-酸相關(guān)衍生產(chǎn)物的檢測能力，結(jié)合國產(chǎn)主流淡爽性啤酒的特點探討其變化規(guī)律，必將為國內(nèi)啤酒行業(yè)提高苦味質(zhì)量的整體控制提供技術(shù)支持。

[1] VANDERHAEGEN B,NEVEN H,COGHE S,et al.Evolution of chemical and sensory properties during aging of top-fermented beer[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51:6 782-6 790.

[2] VANDERHAEGEN B,DELVAUX F,DAENEN L,et al.Aging characteristics of different beer types [J].Food Chemistry,2007,103:404-412.

[3] SCHIEBERLE P.Primary odorants of pale lager beer.Differences to other beers and changes during storage [J].Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung,1991,193:558-565.

[4] VANDERHAEGEN B,NEVEN H,VERACHTERT H,et al.The chemistry of beer aging - a critical review [J].Food Chemistry,2006,95:357-381.

[5] CABALLERO I,BLANCO A,PORRASISO M.Iso-α-acids,bitterness and loss of beer quality during storage [J].Trends in Food Science and Technology,2012,26:21-30.

[6] SCHONBERGER C,KOSTELECKY T.125th Anniversary review:the role of hops in brewing [J].Journal of the Institute of Brewing,2011,117(3):259-267.

[7] STEENACHERS B,COOMAN L D,VOS D D.Chemical transformations of characteristic hop secondary metabolites，in relation to beer properties and the brewing process:A review [J].Food Chemistry,2015,172:742-756.

[8] MEILGAARD M.Hop analysis,cohumulone factor and the bitterness of beer:review and critical evaluation [J].Journal of the Institute of Brewing,1960,66(1):35-50.

[9] KAPPLER S,KRAHL M,GEISSINGER G.Degradation ofiso-α-acids during wort boiling[J] .Journal of the Institute of Brewing,2010,116(4):332-338.

[10] ARKI S,TAKASHIO M,SHINOTSUKA K.A new parameter for determination of the extent of staling in beer [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,2002,60(1):26-30.

[11] INTELMANN D,DEMMER O,DESMER N.18O stable isotope labeling,quantitative model experiments,and molecular dynamics simulation studies on thetrans-specific degradation of the bitter tastingiso-α-acids of beer [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009，57(22):11 014-11 023.

[12] INTELMANN D,KUMMERLOWE G,HASELEU G,et al.Structures of storage induced transformation products of the beer’s bitter principles,revealed by sophisticated NMR spectroscopic and LC/MS techniques [J].Chemistry:A European Journal,2009,15:13 047-13 058.

[13] INTELMANN D,HASELEU G,HOFMAN T.LC-MS/MS quantitation of hop-derived bitter compounds in beer using the ECHO technique [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(4):1 172-1 182.

[14] INTELMANN D,HOFMAN T.On the autoxidation of bitter tastingiso-α-acids in beer [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58:5 059-5 067.

[15] HASELEU G,LAGEMANN A,STEPHAN A,et al，Quantitative sensomics profiling of hop-derived bitter compounds throughout a full-scale beer manufacturing process[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58:7 930-7 939.

[16] INTELMANN D,HASELEU G,DUNKEL A,et al,Comprehensive sensomics analysis of hop-derived bitter compounds during storage of beer[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59:1 939-1 953.

[17] TANIGUCHI Y,MATSUKURA Y,OZAKI H,et al，Identification and quantification of the oxidation products derived from α-acids and β-acids during storage of hops (HumuluslupulusL.) [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61:3 121-3 130.

[18] Martin DUSEK M,OLSOVSKA J,KROFTA K,et al.Qualitative determination of β-acids and their transformation products in beer and hop using HR/AM-LC-MS/MS [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry 2014,62:7 690-7 697.

[19] DRSEL M,DUNKEL A,HOFMANN T，Sensomics analysis of key bitter compounds in the hard resin of hops (HumuluslupulusL.) and their contribution to the bitter profile of pilsner-type beer [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63:3 402-3 418.

[20] TANIGUCHI Y ,YAMADA M,TANINGUCHI H,et al.Chemical characterization of beer aging products derived from hard resin components in hops (HumuluslupulusL.) [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63:10 181-10 191.

[21] DRSEL M,VOGT C,DUNKEL A,et al,The bitter chemodiversity of hops (HumuluslupulusL.) [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64:7 789-7 799.

[22] MAYE J P,SMITH R,LEKER R,Humulinone formation in hops and hop pellets and its implications for dry hopped beers[J].Technical Quarterly-Master Brewers Association of the Americas,2016,53(1):23-27.

[23] GOIRIS B J,AERTS G,COOMAN L D.Hop α-acids isomerisation and utilisation:an experimental review [J].Cerevisia,2010,35:57-70.

[24] FRITSCH A,SHELLHAMMER T H.Relative bitterness of reduced and nonreducediso-α-acids in lager beer [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,2008,66(2):88-93.

[25] CESLOVA L,HOLCAPEK M,FIDLER M,et al.Characterization of prenylflavonoids and hop bitter acids in various classes of Czech beers and hop extracts using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A,2009,1216(43):7 249-7 257.

[26] MAYTE J P,SMITH R.Dry hopping and its effects on international bitterness unit test and beer bitterness [J].Technical Quarterly-Master Brewers Association of the Americas,2 016,53,(1):134-136.

[27] IGLESIAS C A,BLANCO C A,BLANCO J,et al.Mass spectrometry-based metabolomics approach to determine differential metabolites between regular and non-alcohol beers [J].Food Chemistry,2014,157:205-212.

[28] MALFLIET S,OPSTAELE F,CLIPPELEER J D,et al.Flavor instability of pale lager beers:determination of analytical markers in relation to sensory ageing [J].Journal of the Institute of Brewing,2008,114(2):180-192.

[29] RIGBY F L.A theory on the hop flavor of beer[C].Proceedings of the American Society of Brewing Chemists,1972:46-50.

[30] WACKERBAUER K,BALZER U.Hop bitter compounds in beer.Part II:The influence of cohumulone on beer quality [J].Brewing International,1993,11:116-118.

[31] KUSCHE M,STETTNER G,STEPHAN A,et al.Influence of the new high alpha hop variety Herkules on beer quality [C].Proceedings of the European Brewery Convention Congress Venice,2007,Fachverlag Hans Carl:Nürnberg,Germany,CD ROM 2007,Contribution 24.

[32] OLADOKUN O,TARREGA A,JAMES S,et al.The impact of hop bitter acid and polyphenol profiles on the perceived bitterness of beer [J].Food Chemistry,2016,205:212-220.

[33] OLADOKUN O,TARREGA A,JAMES S,et al.Modification of perceived beer bitterness intensity,character and temporal profile by hop aroma extract [J].Food Research International,2016,86:104-111.

[34] HELMJA K,VAHER M,PUSSA T,et al.Bioactive components of the hop strobilus:comparison of different extraction methods by capillary electrophoretic and chromatographic methods [J].Journal of Chromatography A,2007,222-229.

[35] FRITSCH A,SHELLHAMMER H.Alphα-acids do not contribute bitterness to lager beer [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,2007,65(1):26-28.

[36] KEUKELEIRE S D.Oxidation products of hop α-acids and iso-αacids [J].Cerevisia,1981,2:73-80.

[37] VERZELE M,DEWAELE C，KEUKELEIRE M.Analysis of beeriso-α-acids by high-performance liquid chromatography without sample pre-treatment [J].Journal of Chromatography A,1982,244：321-326.

[38] JASKULA B， KAFARSKI P， AERTS G，et al.A kinetic study on the isomerization of hop α-acids [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56 (15) :6 408-6 415.

[39] ONO M,KAKUDO Y,YAMAMOTO Y,et al.Quantitative analysis of hop bittering components and its application to hop evaluation [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,1984,42(4):167-172.

[40] IRWIN A J,Murray C,THOMPSON D.An investigation of the relationship between hopping rating,time of boil and individual alpha acid utilization [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,1985,43(3):145-152.

[41] HUGHES P S,MARINOVA G.Variations in iso-alpha-acids distribution and behavior of different products [J].Brewer’s Guardian,1997,126(83):26-29.

[42] KAPPLER S,SCHONERGER C,KROTTENTHALER M,et al.Isohumulone- a review [J].Brewing Science,2010,63:105-111.

[43] HUGHES P S.The significance of iso-alpha acid for beer quality-cambridge prize paper [J].Journal of the Institute of Brewing,2000,106(5):271-276.

[44] ALGAZZALI V,SHELLHAMMER T.Bitterness intensity of oxidized hop acids:bitterness intensity of oxidized hop acids:humulinones and hulupones [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,2016,74(1):36-43.

[45] SCHULZE W G，TING P L,HENCKEL L A,et al.Separation of humulinic acids by reverse-phase high performance liquid chromatography [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,1980,38(1):12-15.

Studyonbittercompoundsinbeeroriginatedfromhopαacid

HAO Jun-guang1,2,ZHOU Yue-nan1,YIN Hua1,YU Jun-hong1,DONG Jian-jun1

1 (Qingdao Brewing Company,State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer,Qingdao 266100,China) 2 (School of Food Science and technology,Qinzhou University,Qinzhou 535011,China)

It is a common limiting technological problem and research focus for brewing industry worldwide to improve the flavor stability to keep refreshing character of beer in the shelf life of beer as long as possible to attract consumers.A decrease of the bitterness intensity accompanied by a shift of the taste profile toward harsh and long lingering bitter is well known phenomena observed during aging of beer.Using modern purification technologies,such as nuclear magnetic resonance spectroscopy and high resolution HPLC MS,the overseas researchers had took some breakthroughs in study on identification of the compounds responsible for harsh and lingering bitterness during brewing and storage process of beer as well as their possible transformation routes.In this paper,the bitter compounds newly identified from hop a-acid were reviewed in detail.Especially the formation mechanism,thresholds and elution of newly found tri-and tetra-cyclic molecules,namely main iso-α acids degraded compounds,during brewing and storage were introduced.

beer; hop; bitter compounds; harsh; lingering; review

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015341

博士，教授。

青島創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃項目：低碳釀造技術(shù)及裝備的開發(fā)與應(yīng)用(項目編號：13-CX-15)

2017-07-31，改回日期：2017-09-27