李粟琳，張翔宇，王洋，郭宇瑛，姜國正，周瑞，王昱升，李濤

1(北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京，100029)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214063) 3(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

可發(fā)酵三七等中藥材的食用菌種篩選和皂苷生物轉化產物的分析

李粟琳1，張翔宇1，王洋1，郭宇瑛1，姜國正1，周瑞1，王昱升2，李濤3

1(北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京，100029)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214063) 3(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

研究了保加利亞乳桿菌、凝結芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和冠突散囊菌等食品工業(yè)中常用的微生物菌種對三七之類的中藥原料的生物轉化，利用HPLC分析了不同菌種直接發(fā)酵對人參皂苷組成的影響。通過不同微生物菌種的發(fā)酵，三七、人參和西洋參所含的Rb1、Re等常見人參皂苷會分別轉化為Rh1、C-K和Rd等稀有人參皂苷，產物中沒有檢測到Rh2等人參皂苷，說明菌種產生的糖苷酶具有相當的專一性，為進一步對特殊目標皂苷的開發(fā)利用提供了基礎。

三七；皂苷；生物轉化

三七是五加科人參屬植物三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen)的宿根，是我國名貴中藥材，也是云南獨具特色的中藥材資源，具有止血、活血化瘀等功效?，F(xiàn)代藥理學研究證明，人參皂苷為三七的主要有效成分之一，具有止血、調血脂、抗血栓、增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化等作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷PNS中的人參皂苷Rg1、 Rb1在抗細胞增殖和抗腫瘤等方面均顯示出一定的藥理作用[1-7]。另有人參稀有皂苷如Rb3、Rh2、Rh3、Rh1、Rg，具有高抗腫瘤作用，但由于含量較低，這種有很高活性的稀有皂苷不易在自然界直接獲得[8-9]。因此，開發(fā)人參屬稀有皂苷具有極高的價值和前景。

國際上有很多的研究者開展了包括利用土壤微生物在內的特定菌種和酶制劑進行皂苷轉化的研究，在這些研究中，利用專一性的糖苷酶的水解作用，使得高級皂苷分子上的特殊糖苷鍵發(fā)生選擇性的水解，可產生低糖苷取代的稀有的次級皂苷。由于這些研究中多利用提純后的皂苷和酶制劑進行皂苷生物轉化工藝復雜，成本高，同時很多菌種為植物腐敗菌，缺乏安全性評價。為了提高諸如飲片之類的中藥重要劑型的效力，有必要開發(fā)安全可靠的三七發(fā)酵炮制工藝。本研究擬利用食品加工中公認安全的食用菌種對三七之類的中藥原藥在相對特殊的條件下進行直接皂苷生物轉化，考察不同發(fā)酵過程中皂苷成分的變化情況，以發(fā)現(xiàn)更多的可用于皂苷轉化的新菌種和轉化體系，進而為開發(fā)不同功能的臨床重要制劑和藥膳等方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

原料與試劑：三七，產自云南省文山；西洋參，產自美國威斯康辛州；人參，產自吉林省白山市；人參皂苷標準樣品R1、Rg1、Rb1、Re、Rh、C-K、Rd、Rg3，純度均為98%以上，葉源科技公司產品；無水乙醇，北京化工廠產，分析純；乙腈，F(xiàn)isher產品，色譜純。

菌種：保加利亞乳桿菌、凝結芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌、冠突散囊菌、高溫厭氧球菌，由天然食材中分離得到。

表1 實驗菌種Table 1 Experimental stains

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物轉化三七等植物原料的方法

1.2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

用植物粉碎機將三七、人參、西洋參塊根粉碎，過篩，收集粒度為40目以上的粉末。加蒸餾水配置成3 g/L的懸浮液，250 mL三角瓶分裝100 mL。在115 ℃下滅菌30 min。

1.2.1.2 菌種的活化和發(fā)酵

取各菌種的冷凍甘油管1管，約1 mL，在無菌條件下接種到含質量分數為5%葡萄糖的5 mL YPG培養(yǎng)基中，在37 ℃下活化培養(yǎng)24 h。將活化培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物1 mL接種到YPG培養(yǎng)基中進行二次活化。培養(yǎng)24 h后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵。其中，GS、H-20、P-Lac、B-548、C19-14在51℃靜置發(fā)酵，霉菌GT在31 ℃下?lián)u瓶發(fā)酵。

1.2.2 樣品的制備

發(fā)酵培養(yǎng)6 d后，進行滅酶處理。后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩７謩e取2 mL發(fā)酵后的樣品加入8 mL無水乙醇超聲浸泡1 h。離心取上清液，經0.22 μm膜過濾后即得HPLC分析樣品。

1.2.3 采用HPLC法分析發(fā)酵對人參皂苷組成的影響

色譜條件：色譜柱：C18柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)；流速：0.6 mL/min；梯度： 0～15 min，19%A等度；15～25 min，19%A～29%A線性梯度；25～35 min，29%A～40%A線性梯度；35～55 min，40%A～100%A線性梯度；進樣量，10 μL；柱溫，35 ℃；檢測波長：203 nm。

2 結果

2.1 微生物菌種發(fā)酵三七等原料

在本研究中，除了冠突散囊菌為常溫條件下的有氧發(fā)酵外，其余的菌種都可以在高溫下利用三七等底物進行厭氧高溫乳酸發(fā)酵(50 ℃以上)，生長情況以凝結芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌較好，而鼠李糖乳桿菌等較差。GT菌的淀粉水解情況較好，產生的色素較多。其余的菌種在高溫發(fā)酵下并沒有顯著的色素產生，發(fā)酵6 d后,發(fā)酵液中積累的乳酸約為20～ 40 mmol/L。

2.2 人參皂苷的HPLC測定

利用HPLC方法對三七等五加科植物皂苷含量進行測定的方法已有很多，但存在分析時間過長(90 min以上)，或者分離度不高的情況。本研究通過對色譜條件的優(yōu)化實現(xiàn)了在較短時間內利用C18色譜柱的皂苷的高效組分分離和分析。圖1是在優(yōu)化的色譜條件下對皂苷標準品的HPLC分析的色譜圖，從分離和分析效果看所選定的分析方法可以滿足對三七等植物樣品微生物發(fā)酵過程的皂苷成分的分析。從色譜圖的出峰順序上看，各種皂苷分子上的糖苷取代程度和位置與保留時間的長短沒有明顯的對應關系，說明無論是三醇型還是二醇型的人參皂苷的近乎平面構型的苷元部分似乎更能決定其在固定相上的保留行為。

圖1 人參皂苷標準品進行分析的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC map of standard ginsenoside samples

2.3 微生物發(fā)酵對三七總皂苷組成變化的影響

由于微生物沒有合成人參皂苷的能力，所以三七等原料在菌種發(fā)酵前后的變化可以反映出培養(yǎng)過程中微生物所產的各種糖苷酶對皂苷上不同的糖苷鍵的水解程度的差別。從對照組的三七皂苷的HPLC圖譜中可見，其中的主要皂苷為R1、Rg1和Rb1等高糖基取代的高級皂苷，而保留時間較長的低糖基取代的次級皂苷含量較少(見圖2)。

圖2 未經微生物作用的三七總皂苷的HPLC譜圖Fig.2 HPLC map of control Panax notoginsen ginsenoside sample

在篩選菌種的實驗中，基本上不轉化這些主要皂苷的微生物菌種有Q、B-548等菌種(圖3、圖4)。

圖3 對三七皂苷轉化能力較弱的菌種—Q的HPLC譜圖Fig.3 HPLC map of a weak Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-strain Q

圖4 對三七皂苷轉化能力很弱的菌種B-548的HPLC譜圖Fig.4 HPLC map of a weak Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-strain B-548

其中對三七總皂苷中的Rg1、Rb1和R1轉化能力較強的菌種有GS和D-Lac等乳酸菌，主要的產物為Rh1等皂苷物質(圖5、圖6)。

圖5 對三七皂苷有較強轉化能力的菌種GS的HPLC譜圖Fig.5 HPLC map of a strong Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-strain GS

圖6 對三七皂苷有較強轉化能力的菌種D-Lac的HPLC譜圖Fig.6 HPLC map of a strong Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-stranin D-Lac

2.4 微生物發(fā)酵對西洋參、高麗參總皂苷組成變化的影響

通過HPLC分析，西洋參的總皂苷組成以Re和Rb1為主要的皂苷成分(見圖7)。

圖7 西洋參總皂苷的HPLC譜圖Fig.7 HPLC map of total ginsenosides of the American ginseng

經過微生物發(fā)酵，總皂苷會發(fā)生一系列變化，如菌種C-19可以將Rb1轉化為C-K，它是一種重要的功能性皂苷(見圖8)。

圖8 經菌種C-19轉化后的西洋參皂苷組成的HPLC譜圖Fig.8 HPLC map of total American ginseng ginsenosides after the treatment of strain C-19

冠突散囊菌是一種絲狀真菌，該菌種的顯著特征是可以將其他的皂苷成分轉化為人參皂苷Rd，以及多種未知結構的高保留性的皂苷產物(見圖9)。

圖9 冠突散囊菌GT轉化西洋參的HPLC譜圖Fig.9 HPLC map of total American ginseng ginsenosides after the treatment of strain GT

高麗參的總皂苷組成以Re和Rb1為主要的皂苷成分，可能是因為原料質量的原因，總的皂苷含量偏低，見圖10。

圖10 高麗參總皂苷的HPLC譜圖Fig.10 HPLC map of total ginsenosides of the American Panax ginseng

經過微生物發(fā)酵，僅在冠突散囊菌GT發(fā)酵的樣品中可見皂苷Rd含量的變化(圖11)。

圖11 高麗參經冠突散囊菌GT轉化后的皂苷組成的HPLC譜圖Fig.11 HPLC map of total Panax ginseng ginsenosides after the treatment of strain GT

3 討論

五加科植物體內所含的二醇型人參皂苷都具有圖11的結構，由于R2為非糖基可取代的H，故只在環(huán)上C-3位置的R1和側鏈C-20位置的R3的OH上結合了不同的糖(鏈)，產生了多種皂苷系列化合物。

不同的微生物由于所產生的糖苷酶的種類和選擇性不同，對R1、R3位置上的取代糖基的水解能力不同，所以其產物皂苷的組成也不同。從我們所做的菌種篩選的結果的發(fā)酵前后的總皂苷組成的HPLC分析結果來看，基本可以確定不同菌種的皂苷轉化的途徑。

圖12 二醇型人參皂苷的結構關系Fig.12 Sructures of PPD-type saponins

在本研究的微生物轉化過程中，微生物可以顯著地水解高級皂苷上的不同的糖苷鍵，使次級皂苷如Rd、C-K和Rg3等功能性皂苷的量增加，但沒有檢測到Rh2等皂苷，說明這些微生物水解β-(1-2)糖苷鍵的能力較低而水解β-(1-6)糖苷鍵的能力較強。

對三七中含量較高的三醇型人參皂苷，如Re和Rg1等，某些乳酸菌可以在高溫下將其側鏈C-20上的葡萄糖苷鍵水解掉，得到Rh1等次級皂苷，其可能的轉化途徑見圖13。

圖13 三醇型人參皂苷的轉化途徑Fig.13 Transformation pathway of PPT-type saponins

微生物發(fā)酵轉化五加科皂苷的研究目前已經比較廣泛了，本研究利用食用微生物菌種，在較高的轉化溫度下直接對植物的藥用部分進行發(fā)酵轉化，具有比采用常溫發(fā)酵微生物更高的轉化便利性和可操作性，從測試的菌種中找到可以將Rb1等常見人參皂苷轉化為功能性更強的Rd、C-K和Rh1等稀有皂苷的候選菌種，為今后進一步進行轉化菌種的選育和轉化條件的優(yōu)化創(chuàng)造了條件。

我國是三七等五加科藥用植物生產和應用的大國。如三七在云南省的栽培生產量非常巨大，由于沒有新的合適的轉化和深加工技術，原藥的供應遠超實際需求，近年來的售價出現(xiàn)連續(xù)暴跌，嚴重損害了產業(yè)的發(fā)展。隨著國內對五加科植物在食品和餐飲行業(yè)應用限制的放開，市場上對于功效更強的人參產品的需求也更加迫切，利用食用菌對原料進行深度加工具有廣闊的應用前景，尤其是在藥膳和酵素用途的和稀有人參皂苷的大批量生產上。

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ScreeningofediblefungiforfermentationofPanaxnotoginsengChinesemedicinalherbsandanalysisofbiotransformationproductsofsaponins

LI Su-lin1,ZHANG Xiang-yu1,WANG Yang1,GUO Yu-ying1,JAING Guo-zheng1,ZHOU Rui1,WANG Yu-sheng2,LI Tao3

1(Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,100029) 2(School of Biotechnology,Jiangsu University,Wuxi 214122,China) 3(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

The cultivation and application of the medicinal plants ofPanaxginsengin China,includingPanaxnotoginsenghas a long history and it is of great significance to the development of these precious resources by fermentation.In this paper,we studied the fermentation processes of these raw materials with microbial strains belong toLactobacillusbulgaricus,Bacilluscoagulans,LactobacillusrhamnosusandEurotiumcristatumetc.which commonly used in food industry.HPLC was used to analyze the changes of ginsenoside compositon after different fermentaion.Through the fermentation with different microbial strains,Rb1,Re and other common ginsenoside which contained inPanaxnotoginseng,ginseng and American ginseng were biotransformed respectively into Rh1,C-K and Rd,while ginsenoside Rh2 was not detected in the product.The results suggested that the glycosidases from these strains were very specific and provided a basis for the biotransformation and utilization of special target saponins .

Panaxnotoginseng; saponin,biotransformation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014156

碩士研究生。

2017-02-26，改回日期：2017-05-12