陳曉龍，李耀，陳光靜，金新開，闞建全,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715) 3(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)

花椒麻味物質(zhì)分子印跡固相萃取柱的制備及其應(yīng)用

陳曉龍1，李耀1，陳光靜1，金新開3，闞建全1,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715) 3(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)

以α-(羥基)-山椒素分子結(jié)構(gòu)類似物為模板分子、2-乙烯基吡啶(2-vinylpyridine,2-Vpy)為功能單體、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycol dimethacrylate,EDMA)為交聯(lián)劑,按1∶4∶20的摩爾比合成了花椒麻味物質(zhì)硅膠表面分子印跡聚合物，并以合成的硅膠表面分子印跡聚合物為固相萃取柱填料，制備了花椒麻味物質(zhì)分子印跡固相萃取柱，確定了該固相萃取柱的最佳上樣溶劑、淋洗溶劑及洗脫溶劑，用此固相萃取柱對(duì)花椒油樹脂中的花椒麻味物質(zhì)進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明，該固相萃取柱對(duì)花椒麻味物質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性吸附效果，可以分離純化出相對(duì)純度為93.66 %的花椒麻味物質(zhì)。

花椒；分子印跡聚合物；分子印跡固相萃取柱；高效液相色譜；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀

花椒(ZanthoxylumL.)是蕓香科花椒屬植物，又稱為大椒、秦椒、蜀椒、川椒或山椒。在我國(guó)分布廣泛，北起東北南部，南至五嶺北坡，東南至江浙沿海，西南至西藏東南部，從平原至海拔較高的山地均有栽種[1]?；ń肥且环N特色的，有2 000多年歷史的香辛料和中藥材，被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一，具有溫中祛寒、殺蟲止痛、健胃止瀉、祛濕等功效[2]?；ń分泻卸喾N化學(xué)成分，如揮發(fā)油、生物堿、酰胺、香豆素、甾醇和三萜類等[3]，其中酰胺類物質(zhì)是花椒中具有麻味作用的主要成分，具有鎮(zhèn)痛[4]、麻醉[5]、殺蟲抑菌[6]、抗腫瘤[7-8]等藥理作用。目前對(duì)花椒麻味物質(zhì)的分離提純方法主要有水提法[9]、有機(jī)溶劑提取法[10-11]、超臨界CO2萃取法[12-13]、逆流干柱層析法[14]、制備型液相色譜法[15]等，但這些分離提純方法存在一定缺陷，如水提法、有機(jī)溶劑提取法提取效率低、雜質(zhì)含量高，超臨界CO2萃取法、逆流干柱層析法、制備型液相色譜法等提取步驟繁瑣。

分子印跡固相萃取柱(molecularly imprinted solid-phase extraction,MISPE)是以具有高選擇性的分子印跡聚合物為吸附劑，能選擇性分離富集復(fù)雜樣品中痕量分析物，有效去除雜質(zhì)干擾，進(jìn)而提高分析的準(zhǔn)確度和靈敏度[16]。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，分子印跡固相萃取克服了試樣體系復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣等不利因素，提高了分析準(zhǔn)確性[17]。目前，分子印跡固相萃取柱在藥物、食品、環(huán)境以及生物等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用[18]。

本實(shí)驗(yàn)以α-(羥基)-山椒素分子結(jié)構(gòu)類似物(分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)為模板分子、2-Vpy為功能單體、EDMA為交聯(lián)劑合成了花椒麻味物質(zhì)硅膠表面分子印跡聚合物，并以合成的硅膠表面分子印跡聚合物為固相萃取柱填料，制備了花椒麻味物質(zhì)分子印跡固相萃取(HJMS-MISPE)，為花椒中花椒麻味物質(zhì)的分離、提純提供了更加快速、經(jīng)濟(jì)、高效的方法。

圖1 α-(羥基)-山椒素分子結(jié)構(gòu)類似物Fig.1 Molecular structure of the α-(OH)-sanshool

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-(羥基)-山椒素分子結(jié)構(gòu)類似物：實(shí)驗(yàn)室自備，純度(95%)；硅膠(100目)，青島海洋化工有限公司；γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，阿拉丁試劑；丙烯酰氯，阿拉丁試劑；三乙胺，成都市科龍化工試劑廠；二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，上海國(guó)藥集團(tuán)；偶氮二異丁腈(AIBN)，成都市科龍化工試劑廠；2-乙烯基吡啶(2-Vpy)，上海國(guó)藥集團(tuán)；甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚(沸程30～60 ℃)、二氯甲烷、甲苯均為分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

真空干燥箱(DZF-6020)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-215)，瑞士步琦公司；高效液相色譜(Aligent-1260)，安捷倫公司；氮吹儀(UGC-12C)，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；恒流泵(HL-1B)，上海滬西分析儀器廠有限公司；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，日本島津。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 表面分子印跡聚合物的制備

硅膠的活化[19]：稱取硅膠10 g，置于500 mL平底燒瓶中，加入6 mol/L的HCl溶液300 mL，常溫磁力攪拌 24 h后過(guò)濾并用大量的去離子水洗滌硅膠直至中性，再用丙酮洗滌，洗滌后的硅膠于110 ℃烘干備用。

活化硅膠的?；痆20-23]：稱取活化后的硅膠5 g，于500 mL的圓底三口燒瓶中，加入無(wú)水甲苯150 mL，常溫磁力攪拌條件下緩慢加入30 mL的APTS，再緩慢加入10 mL的吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下95 ℃磁力攪拌反應(yīng)24 h。將所得固體過(guò)濾，依次用甲苯、丙酮、乙醚、甲醇分別洗滌3次，110 ℃干燥12 h，得氨基化硅膠。稱取氨基化硅膠4 g于250 mL圓底三口燒瓶中，加入無(wú)水甲苯100 mL，磁力攪拌15 min后，緩慢加入8 mL丙烯酰氯，磁力攪拌10 min后，再緩慢添加5 mL的三乙胺作為反應(yīng)催化劑，滴加完畢后于氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫磁力攪拌24 h，產(chǎn)物依次用50 mL甲苯、純水、乙醇洗滌3次，于110 ℃干燥后備用。

稱取271 mg(1 mmol)花椒麻味物質(zhì)的替代模板分子于100 mL圓底燒瓶中，依次加入80 mL乙腈，4 mmol功能單體2-Vpy，800 mg?；枘z，超聲30 min，使其充分溶解分散后，加入20 mmol交聯(lián)劑EDMA和40 mg引發(fā)劑AIBN，向混合液中通氮?dú)?0 min，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用封口膜密封燒瓶；磁力攪拌下于50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合4 h后再于60 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合20 h，所得固體以甲醇-乙酸(體積比9∶1)為溶劑進(jìn)行索氏提取，直至索氏提取器內(nèi)溶液不含類模板分子為止，再用甲醇反復(fù)洗滌聚合物以除去其中殘留的乙酸，將處理好的分子印跡聚合物放置于真空干燥箱內(nèi)，60 ℃干燥至恒重，待用，并記為SMIP?？瞻追怯≯E聚合物的制備及處理方法與表面分子印跡聚合物的制備步驟相同，只是在聚合物合成過(guò)程中不加入替代模板分子，記為SNIP。

1.3.2 分子印記聚合物的吸附性能研究

準(zhǔn)確稱取50.0 mg SMIP和SNIP，分別置于20 mL具塞錐形瓶中，分別加入8 mL質(zhì)量濃度為250 μg/mL的HJMS氯仿溶液?；旌先芤河?5 ℃恒溫水浴振蕩器中，使聚合物與HJMS分子相互作用，每隔一段時(shí)間t(60、90、120、150、180、210、240、300 min)后，取出SMIP和SNIP上清液各1份，測(cè)定其中HJMS的含量，繪制HJMS吸附量Q(mg/g)與吸附時(shí)間t之間的變化曲線[24]。

1.3.3 分子印跡固相萃取柱的制備

取2只內(nèi)徑為12.7 mm，長(zhǎng)為66 mm的聚丙烯空柱，先用玻璃棒把一層聚乙烯篩板推到柱體底部，將長(zhǎng)頸漏斗置入柱體中，分別在漏斗中加入處理過(guò)的SMIP和SNIP填料，輕輕提起漏斗，柱床體積為6 mL，裝填料后，緩慢注入5 mL甲醇通過(guò)固相萃取柱，再用玻璃棒把另一層聚乙烯篩板頂入柱體，使其在填料上表面固定，輕輕按壓使其表面平齊。

1.3.4 分子印跡固相萃取柱的優(yōu)化

1.3.4.1 上樣原液的制備

取1.45 g花椒油樹脂置于75 mL三氯甲烷中，于35 ℃下150 r/min振蕩提取4 h，再將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，振搖2 min，靜置分層后，收集三氯甲烷萃取液，定容于100 mL容量瓶中，將其作為固相萃取柱的上樣原液于4 ℃下避光保存待用。

1.3.4.2 上樣溶劑種類及上樣量的選擇[25]

實(shí)驗(yàn)選取相同體積的丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙腈分別作為上樣的溶劑[26]。取1 mL上樣原液分別用上述上樣溶劑稀釋至25 mL作為上樣液，相同操作下分別上樣1.6倍柱床體積的上樣液(經(jīng)檢測(cè)，其中花椒麻味物質(zhì)濃度為0.35 mg/mL)，高效液相色譜法分別檢測(cè)上樣液和流出液中花椒麻味物質(zhì)的濃度，差減法計(jì)算出花椒麻味物質(zhì)在固相萃取小柱中的保留率B[27]，保留率最大的溶劑為最佳上樣溶劑，見(jiàn)式(1)：

(1)

式中：C1為上樣流出液中花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量，mg；C0為上樣液中花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量，mg。

以保留效果最佳的溶劑為上樣溶劑，分別上樣4、5、6、7、8 mL，高效液相檢測(cè)流出液中花椒麻味物質(zhì)的濃度，流出液中檢測(cè)不出花椒麻味物質(zhì)的最大體積為最大上樣量。

1.3.4.3 淋洗溶劑種類的選擇[28]

參照王遵臣[29]等的方法選取相同體積的乙腈、三氯甲烷、甲苯、甲醇/水溶液(體積比5∶5)分別作為淋洗溶劑。MISPE柱中的吸附劑不僅吸附目標(biāo)分子，還有些雜質(zhì)會(huì)被同時(shí)吸附。因此，先用淋洗劑除去雜質(zhì)，再洗脫目標(biāo)物質(zhì)，以減少雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的影響[30]，先用1倍柱床體積的上樣液上樣，再分別用乙腈、三氯甲烷、甲苯、甲醇/水(體積比5∶5)各0.8倍柱床體積對(duì)其進(jìn)行淋洗，收集淋洗液，高效液相色譜法測(cè)其中花椒麻味物質(zhì)的濃度。計(jì)算淋洗后花椒麻味物質(zhì)在固相萃取柱上的保留率，保留率見(jiàn)式(2)：

(2)

式中：m1為淋洗流出液中花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量，mg；m0為上樣液中花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量，mg。

1.3.4.4 洗脫液用量的確定[31]

固定制備好的MISPE柱，用1倍柱床體積的上樣溶液上樣， 0.8倍柱床體積的淋洗液淋洗后，再依次用6、8、10、12 mL的甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗出液，高效液相色譜法測(cè)其中花椒麻味物質(zhì)的濃度，當(dāng)花椒麻味物質(zhì)的回收率接近100%的最小體積為洗脫液用量。根據(jù)上樣液與洗脫液中花椒麻味物質(zhì)量的變化計(jì)算花椒麻味物質(zhì)的回收率[32]，回收率定義為式(3):

(3)

式中：R為花椒麻味物質(zhì)的回收率；NP為經(jīng)過(guò)萃取柱后洗脫溶液中所含花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量，mg；NC表示初始上樣液中含有花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量，mg。

1.3.5 分子印跡固相萃取柱的實(shí)際應(yīng)用

在最佳的上樣溶劑、淋洗溶劑、洗脫溶劑下進(jìn)行過(guò)柱。用高效液相色譜分別測(cè)定上樣液與固相萃取柱流出液中花椒麻味物質(zhì)的純度。其高效液相色譜條件為：色譜柱-Agilent EclipseXDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相-甲醇∶水(體積比60∶40)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。GC-MS條件為：氣相色譜條件:色譜柱為石英毛細(xì)管柱HP-1(30 m×0.25 mm)，進(jìn)樣口溫度 280 ℃，采用程序升溫：起始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至140 ℃，接著以10 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。進(jìn)樣量1 μL，載氣氦氣流速1.0/min，分流比10∶1。質(zhì)譜條件：EI離子源，連接質(zhì)譜接口溫度 280 ℃，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，倍增器電壓1.8 kV；質(zhì)量掃描范圍為m/z：35～500，掃描間隔1 s。

1.3.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Origin8.0和Excel 2003處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面分子印跡聚合物的吸附特性

如圖2所示，在前180 min，吸附速率較快，在吸附210 min以后吸附量基本保持不變，達(dá)到吸附平衡。吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，SMIP對(duì)花椒麻味物質(zhì)的飽和吸附時(shí)間為210 min，對(duì)花椒麻味物質(zhì)的最大吸附容量為(24.92±0.81) mg，特異因子α=(2.91±0.09)。

圖2 SMIP及SNIP對(duì)花椒麻味物質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)分析Fig.2 Binding dynamics of SMIP and SNIP to HJMS

2.2 上樣溶劑種類及上樣量的選擇

由圖3-A所示，當(dāng)以丙酮作為上樣溶劑時(shí)，HJMS的保留率最低(MISPE和NISPE分別為(40.05±4.39)%和(29.64±3.71)%，當(dāng)以二氯甲烷作為上樣溶劑時(shí)，HJMS的保留率最高(MISPE和NISPE分別為(78.72±5.36)%和(40.46±4.23)%，即MISPE對(duì)HJMS的保留能力隨著上樣溶劑極性增大而降低，這是因?yàn)槿軇O性太大則會(huì)破壞特異性印跡位點(diǎn)與花椒麻味物質(zhì)之間的氫鍵結(jié)合[33]。故選二氯甲烷為上樣溶劑。

為了確定MISPE的最大上樣量，分別取4、5、6、7、8 mL的上樣液(其中花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL)上樣，分別計(jì)算保留率。如圖3-B所示，當(dāng)上樣量為 4、5、6 mL時(shí)花椒麻味物質(zhì)在MISPE中的保留率均是100%，即這些過(guò)程中均沒(méi)有花椒麻味物質(zhì)穿漏，當(dāng)上樣量為7 mL時(shí)MISPE對(duì)HJMS的保留率為(88.71±3.36)%，即上樣液中約12%的花椒麻味物質(zhì)沒(méi)有被MISPE吸附。因此，當(dāng)固相萃取柱的柱床體積為6 mL時(shí)，選擇1倍柱床體積的0.35 mg/mL的花椒麻味物質(zhì)上樣液作為最大上樣量[34]。

2.3 淋洗溶劑種類的選擇

在分子印跡固相萃取實(shí)驗(yàn)中，淋洗溶劑的選擇應(yīng)盡可能地消除分子印跡聚合物對(duì)模板分子非特異性相互作用而最大限度地保留住特異性相互作用[29]。為了最大限度地保留MISPE柱的特異性吸附性能，而且盡可能降低雜質(zhì)等非特異性吸附的干擾，實(shí)驗(yàn)分別考察了以乙腈、三氯甲烷、甲苯、甲醇/水溶液(體積比5∶5)作為淋洗劑時(shí)，固相萃取柱對(duì)花椒麻味物質(zhì)的保留率。由圖3-C可知，當(dāng)以甲醇/水(體積比5∶5)作為淋洗劑時(shí)，HJMS在MISPE上的保留率最低。當(dāng)以三氯甲烷和甲苯作為淋洗劑時(shí)，MISPE對(duì)HJMS的保留率均為100%，即MISPE柱中沒(méi)有HJMS被淋洗下來(lái)；但三氯甲烷和甲苯分別作為淋洗劑時(shí)，NISPE柱上非特異吸附的花椒麻味物質(zhì)的保留率分別為(51.47±3.92)%和(85.04±6.09)%，說(shuō)明三氯甲烷作為淋洗劑時(shí)能比甲苯更好的消除非特異性吸附力的影響。因此，淋洗溶劑選用氯仿溶液。

2.4 洗脫液種類及用量的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為洗脫溶劑，分別以6、8、10、12 mL的甲醇作為洗脫液計(jì)算回收率[35-36]，結(jié)果如圖3-D所示，甲醇用量為10 mL時(shí)，MISPE上的HJMS的回收率為(98.57±2.18)%，即HJMS幾乎全部被洗脫下來(lái)。因此，當(dāng)固相萃取柱的柱床體積為6 mL，取1倍柱床體積的上樣液時(shí)，選用10 mL約1.7倍柱床體積的甲醇作為洗脫液[28]。

A-不同上樣溶劑對(duì)MISPE和NISPE中花椒麻味物質(zhì)保留率的影響；B-上樣體積對(duì)MISPE和NISPE中花椒麻味物質(zhì)保留率的影響；C-不同淋洗溶劑對(duì)MISPE和NISPE中花椒麻味物質(zhì)保留率的影響；D-甲醇用量對(duì)MISPE中花椒麻味物質(zhì)回收率的影響圖3 固相萃取柱優(yōu)化結(jié)果圖Fig.3 Optimization diagram of solid phase extraction column

2.5 高效液相色譜檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)的分離純化結(jié)果

采用高效液相色譜法，在相同檢測(cè)條件下對(duì)花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和固相萃取柱分離純化得到的產(chǎn)物進(jìn)行定性確證，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 液相色譜圖的分析結(jié)果Table 1 Analysis results of HPLC chromatogram

花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的3個(gè)峰的平均保留時(shí)間分別是(13.961±0.237)、(14.538±0.221)、(14.908±0.256) min，固相萃取柱分離純化得到的產(chǎn)物的3個(gè)峰的平均保留時(shí)間分別是(13.718±0.218)、(14.235±0.206)、(14.752±0.202) min，經(jīng)均值差異性檢驗(yàn)，花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的3個(gè)峰的平均保留時(shí)間與固相萃取柱分離純化得到的產(chǎn)物的平均保留時(shí)間相比，無(wú)顯著性差異(p>0.05)，可確證分離純化出的物質(zhì)的主要成分是花椒麻味物質(zhì)；上樣液中花椒麻味物質(zhì)的峰面積占總峰面積的76.15%，固相萃取柱分離純化得到的花椒麻味物質(zhì)占總峰面積的94.10%，花椒麻味物質(zhì)占總峰面積的比例提高了18%，從圖4看出，固相萃取柱流出液的HPLC圖主要有3個(gè)峰，中間峰最大[37-38]。

A-花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的高相液相色譜圖；B-上樣液的HPLC圖；C-固相萃取柱流出液的HPLC圖圖4 花椒麻味物質(zhì)的高效液相色譜圖Fig.4 Chromatogram of HPLC

2.6 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)的分離純化結(jié)果

GC-MS儀器檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、上樣液、固相萃取柱流出液的氣相色譜-質(zhì)譜總流圖見(jiàn)圖5。經(jīng)NIST05.LIB譜庫(kù)檢索和峰面積歸一化法計(jì)算[39]，其分析結(jié)果分別見(jiàn)表2～表4。

A-花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖；B-上樣液的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖；C-固相萃取柱流出液的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖圖5 花椒麻味物質(zhì)的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of the numb-taste component

由圖5-A和表2可知，花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品主要成分為酰胺類物質(zhì)，其中山椒素1含量為11.72%、山椒素2的含量為13.91%、長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)1的含量為19.42%、長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)2的含量為10.51%、長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)3的含量為17.08%；由圖5-B和表3可知，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)出上樣液中主要含50種成分，酰胺類物質(zhì)即花椒麻味物質(zhì)在上樣液中的相對(duì)含量為30.81%；由圖5-C和表4可知，經(jīng)過(guò)分子印跡固相萃取柱分離純化得到的產(chǎn)物中花椒麻味物質(zhì)的相對(duì)含量為93.66%，說(shuō)明上樣液在經(jīng)過(guò)分子印跡固相萃取柱分離后可得到純度較高的花椒麻味物質(zhì)，其中酰胺類物質(zhì)4的含量最高，為28.71%，其次酰胺類物質(zhì)3的含量為22.27%，酰胺類物質(zhì)7的含量為11.16%、酰胺類物質(zhì)8的含量為6.12%、酰胺類物質(zhì)9的含量為8.22%，酰胺類物質(zhì)10的含量為6.84%[40-41]。

表2 花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的組分及其相對(duì)含量Table 2 The component and relative content component of the numb-taste component standards

表3 花椒油樹脂的組分及其相對(duì)含量Table 3 The component and relative content component of Zanthoxylum oil resin ingredient

續(xù)表3

序號(hào)保留時(shí)間/min化合物名稱(英文名稱)質(zhì)荷比(m/z)相對(duì)含量/%2919 581β?瑟林烯(β?selinene)2040 743019 796巴倫西亞橘烯(naphthalene)2041 783120 156欖香腦(elemenolic)2220 793221 056杜松醇(cadinol)2220 623321 358橙花叔醇(nerolidol)2226 383421 768氧化石竹烯(caryophylleneoxide)2200 473522 167斯巴醇(spathalenol)2220 533623 8512，3?二甲基?2，3?二苯基丁烷(2，3?dimethyl?2，3?diphenylbutane)2380 353725 791十七烷(heptadecane)2400 573826 5732?十六烯酸(hypogaeicacid)2540 143927 646棕櫚酸(palmiticacid)2560 224031 269羥基?山椒素12451 514131 632羥基?山椒素22450 544234 261山椒素12633 624335 381山椒素22633 484435 765山椒素32631 234537 106山椒素52630 284640 453長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)12927 764740 935長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)22922 434841 373長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)32965 084941 572長(zhǎng)碳鏈不飽和酰胺類物質(zhì)42964 885044 362反?9?十八碳烯酸甲酯(methylelaidate)2980 11

表4 固相萃取柱流出液的組分及其相對(duì)含量Table 4 The component and relative content component of the sample liquid passing solid-phase extraction column

3 結(jié)論

用硅膠表面分子印跡聚合物制成固相萃取柱，確定了該固相萃取柱的最佳上樣溶劑為二氯甲烷，最佳淋洗溶劑為三氯甲烷，最佳洗脫溶劑為甲醇，用此固相萃取柱對(duì)花椒油樹脂中的花椒麻味物質(zhì)進(jìn)行分離純化，結(jié)果表明，該固相萃取柱對(duì)花椒麻味物質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性吸附效果，可以分離純化出相對(duì)純度為93.66 %的花椒麻味物質(zhì)，與其它提取純化花椒麻味物質(zhì)的研究方法相比，該方法更加快速、經(jīng)濟(jì)、高效。

[1] 史勁松,顧龔平,吳素玲,等.花椒資源與開發(fā)利用現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國(guó)野生植物資源,2003,22(5):6-8.

[2] 王宇,巨勇,王釗.花椒屬植物中生物活性成分研究近況[J].中草藥,2002,33(7):93-97.

[3] 張敬文,趙鐳,史波林,等.花椒果皮中化學(xué)成分的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2016,31(2):109-112.

[4] 莫麗春,盧馨,曾里,等.速煮紫薯中花青素的測(cè)定方法研究[J].糧食與飼料工業(yè),2012,12(6):18-20.

[5] TANAKA O.Novel amide compound and produeton thereof[P].日本專利:JP1294657,1989-11.

[6] 徐文雯,馬習(xí)東,王芳,等.富馬酸生產(chǎn)菌少根根霉的誘變篩選[J].生物加工過(guò)程,2008,6(4):61-64.

[7] HASHIMOTO,SATOH K,KASE Y,et al.Modulatory effect of aliphatic acid amides fromZanthoxylumpiperitumon isolated gastrointestinal tract[J].PLANTA MEDICA,2001,67(2):179-181.

[8] 周敏,花椒麻素對(duì)肝癌細(xì)胞生理功效及機(jī)理研究[D].重慶： 西南大學(xué)，2014.

[9] 曹繼全,徐偉昌,李春榮.高溫高壓水煮制取花椒麻味素的方法[P].中國(guó)專利:CN 1305742A.2001,8.

[10] IH-SHENG CHEN，TZU-LI CHEN，WEI Yu-lin,et al.Isobutyl amides from the fruit of Zanthoxylum integrifoliolum[J].Phytochemistry,1999，52:357-360.

[11] XIONG Quanbo,SHI Dawen,HIROFUMI,et al.Alkyl amides from Pericarps of Zanthoxylum[J].Phytochemistry,1997,46(6):1 123-1 126.

[12] 莫彬彬,連賓,萬(wàn)固,等.超臨界CO2分步萃取花椒香氣和麻味物質(zhì)的初步研究[J].食品科學(xué),2009,30(8):201-203.

[13] 楊瀟,芮光偉,鐘智超,等.9種花椒超臨界CO2萃取物中化學(xué)成分的GC/MS/AMDI分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(3):158-162.

[14] 羅凱,胡江,黃秀芳,等.花椒麻味物質(zhì)的提取分離及其組分分析[J].食品科學(xué),2013,34(24):88-91.

[15] SUGAI E,MORIMITSU Y,KUBOTA K.Quantitative analysis of sanshool compounds in Japanese pepper (Xanthoxylum piperitum DC.) and their pungent characteristics[J].Bioscience Biotechnology & Biochemistry,2014,69(10):1 958-1 962.

[16] 薛敏,王安,王瑜,等.分子印跡固相萃取技術(shù)檢測(cè)江水、尿液及牛奶中雌激素殘留[J].分析化學(xué),2011(6):793-798.

[17] 胡艷云,徐慧群,姚劍,等.分子印跡固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中20種三唑類農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué),2014(2):227-232.

[18] 韋壽蓮,郭小君,汪洪武,等.咖啡因分子印跡固相萃取柱的制備及應(yīng)用[J].分析化學(xué),2012(7):1 071-1 075.

[19] GUTIéRREZCLIMENTE R,GMEZCABALLERO A,HALHALLI M,et al.Iniferter-mediated grafting of molecularly imprinted polymers on porous silica beads for the enantiomeric resolution of drugs[J].Journal of Molecular Recognition,2016,29(3):106-114.

[20] 王明華,曲榮君,紀(jì)春暖,等.含酰胺結(jié)構(gòu)的硅膠鍵載二乙烯三胺螯合微粒的合成及其吸附性能[J].離子交換與吸附,2008,24(5):408-417.

[21] 胡廷平,張宴銘,鄭立輝,等.硅膠表面苯并噻吩分子印跡聚合物的分子識(shí)別與吸附性能[J].燃料化學(xué)學(xué)報(bào),2010,38(6):722-729.

[22] GAO D,ZHANG Z,WU W,et al.A surface functional monomer-directing strategy for highly dense imprinting of TNT at surface of silica nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(25):7 859-7 866.

[23] LIAO S,ZHANG W,LONG W,et al.Adsorption characteristics,recognition properties,and preliminary application of nordihydroguaiaretic acid molecularly imprinted polymers prepared by sol-gel surface imprinting technology[J].Applied Surface Science,2016,364(4):579-588.

[24] KYZAS G Z,LAZARIDIS N K,BIKIARIS D N.Optimization of chitosan and β-cyclodextrin molecularly imprinted polymer synthesis for dye adsorption[J].Carbohydrate Polymers,2013,91(1):198-208.

[25] BITAR N,CAYOT P,BOUMAROUN E.Cayot and E.Boumaroun,Molecularly imprinted polymer solid phase extraction of fungicides from wine samples[J].Analytical Methods,2014,6(16):6 467-6 472.

[26] 吐?tīng)柡椤べI買提,阿不都克熱木·卡地爾,哈麗丹·買買提,等.替代模板法制備甲硝唑分子印跡聚合物及其在血清樣品固相萃取中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),2011,39(12):1 841-1 845.

[27] AZODI-DEILAMI,NAJAFABADI A H,ASADI E,et al.,Magnetic molecularly imprinted polymer nanoparticles for the solid-phase extraction of paracetamol from plasma samples,followed its determination by HPLC[J].Microchimica Acta,2014,181(15):1 823-1 832.

[28] 韓芳,胡艷云,張蕾,等.虛擬分子印跡固相萃取技術(shù)檢測(cè)食品中10種三嗪類除草劑殘留[J].分析化學(xué),2012,40(11):1 648-1 653.

[29] 王遵臣,于海寧,沈生榮,等.辣椒素分子印跡聚合物的制備及其在固相萃取中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2013,34(12):45-50.

[30] 杜欣蔚,劉廣洋,張艷欣,等.模板替代法制備三聚氰胺表面分子印跡聚合物及其在牛奶樣品固相萃取中的應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2015(4):36-40.

[31] SHEYKHAGHAEI G,HOSSAINISADR M,KHANAHMADZADEH S,et al.Magnetic molecularly imprinted polymer nanoparticles for selective solid phase extraction and pre-concentration of Tizanidine in human urine[J].Journal of Chromatography B,2016,1011(7):1-5.

[32] 劉伯洋,李利軍,程昊,等.分子印跡固相萃取技術(shù)對(duì)六堡茶中表兒茶素的分離特性[J].食品科學(xué),2016,37(13):1-11.

[33] 張鐵莉,赫彩霞,王磊.沉淀聚合法制備3-吲哚乙酸印跡聚合物微粒及其固相萃取應(yīng)用[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2016,35(8):962-967.

[34] 杜麗麗,蘇立強(qiáng),高寶勛,等.加替沙星分子印跡聚合物的制備及其應(yīng)用[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2015,27(3):262-267.

[35] PARK H E,TIAN M,ROW K H.Molecularly imprinted polymer for solid-phase extraction of phenolic acids from salicornia herbacea L[J].Separation Science and Technology,2014,49(9):1 401-1 406.

[36] ZHANG Z,ZHENG S,YANG J,et al.Synthesis and solid phase extraction performance study of NNAL-specific molecularly imprinted polymers using dummy templates[J].Chinese Journal of Chemical Physics,2013,26(3):361-368.

[37] RAOR N,SRAVAN B,REDDY C K,et al.Molecularly imprinted polymer-based,solid-phase extraction followed by liquid chromatographic determination of lacosamide in rat plasma[J].Analytical Methods,2014,6(9):3 101-3 107.

[38] SANAGI M M,SALLEH S,WAN A W I,et al.Molecularly imprinted polymer solid-phase extraction for the analysis of organophosphorus pesticides in fruit samples[J].Journal of Food Composition and Analysis,2013,32(2):155-161.

[39] 房信勝,穆向山,李明會(huì),等.萊蕪花椒和川椒揮發(fā)油的GC-MS分析比較[J].中藥材,2011,34(4):555-559.

[40] 莫彬彬,連賓,萬(wàn)固存,等.超臨界CO2分步萃取花椒香氣和麻味物質(zhì)的初步研究[J].食品科學(xué),2009,30(8):201-203.

[41] 杜文倩,史波林,歐克勤,等.基于麻味物質(zhì)構(gòu)成特征的紅花椒高效液相色譜指紋圖譜建立研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2016,7(3):1 138-1 144.

ThepreparationandapplicationoftheChinesepricklyash'smolecularlyimprintedsolid-phaseextraction

CHEN Xiao-long1,LI Yao1,CHEN Guang-jing1,JIN Xin-kai3,KAN Jian-quan1,2*

1(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715 China) 2(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation,Chongqing 400715,China) 3(College of Gardening,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The molecularly imprinted polymers was synthesized by molecular structure analogues of α-(OH)-sanshool as the template molecule,2-Vpy as functional monomer,EDMA as the crosslinking agent and at the proportion of 1∶4∶20.The optimal sample solvent,drip washing solvent and elution solvent were selected out and the SMIP was used to separate and purify the numb taste components in Zanthoxylum oleoresin.The results show that the SMIP had specific adsorption to the numb taste components,and 93.66% of pure numb taste components can be separated.

Chinese prickly ash; molecularly imprinted polymer; molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE); high performance liquid chromatography (HPLC); gas chromatography mass spectrometry (GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014711

碩士研究生(闞建全教授為通訊作者，E-mail：kanjianquan@163.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371834)

2017-05-06，改回日期：2017-06-01