劉麗莉，楊陳柳，李玉，梁嚴(yán)予，李丹，孟圓圓，代曉凝

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)

BacilluscereusMBL13-U膠原蛋白酶的分離純化及其降解動(dòng)力學(xué)分析

劉麗莉*，楊陳柳，李玉，梁嚴(yán)予，李丹，孟圓圓，代曉凝

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)

膠原蛋白；純化；骨膠原蛋白酶；動(dòng)力學(xué)；降解

我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，如何有效利用畜禽屠宰后的副產(chǎn)物，成為近年來的研究熱點(diǎn)。利用酶技術(shù)對(duì)我國(guó)來源廣泛的畜禽骨資源進(jìn)行深加工，既解決了大量畜禽骨骼的浪費(fèi)問題，又帶來了一定的經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。膠原蛋白酶是通過膠原的解螺旋作用降解膠原蛋白卻不作用于其他蛋白底物的酶類。膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)降解后所得的小肽混合物,其具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易吸收、抗氧化、降血壓、增強(qiáng)免疫力等諸多生理活性[3-4]。從來源上，膠原蛋白酶可分為微生物膠原蛋白酶和動(dòng)物膠原蛋白酶，而微生物源的膠原蛋白酶因其高酶活等優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用，如FERREIRA等[5]通過曲霉菌生產(chǎn)膠原酶，并對(duì)所產(chǎn)酶分離純化及酶學(xué)特性研究。NAGANO等[6]從枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基的上清液中分離膠原酶，研究酶純化后的特異性。ABFALTER等[7]從蠟狀芽孢桿菌ATCC 14579中克隆出膠原酶ColA基因并對(duì)其表達(dá)機(jī)制進(jìn)行研究。在工業(yè)開發(fā)中膠原蛋白酶可應(yīng)用于膠原蛋白分級(jí)降解獲得膠原多肽，而由于骨骼中主要的蛋白質(zhì)為膠原蛋白，因此選用專用的膠原蛋白酶進(jìn)行酶解則具有很高的研究?jī)r(jià)值。

蛋白的降解過程是集復(fù)雜和多樣于一體的過程[8-10]，不同的蛋白酶和降解條件都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生很大的影響，很難在生產(chǎn)應(yīng)用上掌握和調(diào)控蛋白的降解過程。因此，從反應(yīng)機(jī)理出發(fā)，推導(dǎo)描述蛋白質(zhì)降解過程規(guī)律的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，得出動(dòng)力學(xué)參數(shù)，建立符合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)于蛋白質(zhì)降解過程的深入理解有重要意義[11-12]。本研究以課題組篩選的菌種BacilluscereusMBL13-U為出發(fā)菌種，將其粗酶液依次采用多種分離純化步驟，純化出一種特異降解牛骨膠原蛋白的酶，并對(duì)其特性進(jìn)行了相關(guān)分析。同時(shí)，參照相關(guān)研究[13-15]，以米氏方程為基礎(chǔ)，針對(duì)骨膠原蛋白酶(bone-specifi collagenase,BSC)降解牛骨膠原蛋白的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探討，從而構(gòu)建出降解牛骨膠原蛋白的動(dòng)力學(xué)模型。該項(xiàng)研究為新型膠原蛋白酶源的開發(fā)及其未來開發(fā)應(yīng)用奠定了科學(xué)理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛腿骨,洛陽老城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)； 牛跟腱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白,DEAE瓊脂糖凝膠FF，上海源葉生物有限公司；牛血清白蛋白，眾一生物公司；葡聚糖凝膠G100，上海藍(lán)季科技；甲醛、HCl、NaOH,洛陽昊化化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-130B恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)，上海精密儀器有限公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器、BT-100數(shù)顯恒流泵、TH-500梯度混合儀，上海青浦滬西儀器廠；電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛骨膠原蛋白的制備

新鮮牛骨→除雜→切塊(5～6 cm)→高壓蒸煮(121 ℃，0.1 kPa)→脫脂、脫鈣(0.48% HCl) →水洗→烘干→粉碎(40目篩)→牛骨膠原蛋白[16]

1.3.2 BSC粗酶液的制備

參照課題組前期實(shí)驗(yàn)確定的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)菌種[17]，將B.cereusMBL13-U以4 mL/100mL的接種量接種于pH 6.4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35 ℃，160 r/min的條件下反應(yīng)46 h，以14 800g離心力，4 ℃高速離心25 min，收集上清液即為BSC的粗酶液M1樣。

1.3.3 BSC的分離純化

向M1樣中緩慢加入(NH4)2SO4，使其溶液飽和度達(dá)到30%，4 ℃靜置8 h后，在離心力為14 800g，4 ℃條件下高速離心25 min，接著向上清液中加入(NH4)2SO4，使其溶液飽和度達(dá)到75%，采取同樣方法離心，收集沉淀；沉淀用去離子水溶解離心，將上清液移入透析袋內(nèi)，4 ℃，2～3 h更換一次去離子水，將透析后的去離子水用BaCl2檢測(cè)，直到檢測(cè)不出沉淀，透析結(jié)束。透析后冷凍干燥得到M2樣。然后將M2樣溶液用DEAE-Sepharose Fast Flow離子層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.8 mL/min，按4 mL/管，定時(shí)5 min的速度收集洗脫液，得到M3樣[18]。取M3樣溶液1 mL加入Sephadex G-100凝膠層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，按2.5 mL/管，5 min的速度收集洗脫液，收集酶活較高的部分，干燥后得到BSC的純品。

1.3.4 BSC分子質(zhì)量及純度鑒定

BSC的分子量及純度鑒定采用SDS-PAGE垂直電泳法[19]進(jìn)行分析，本試驗(yàn)選擇的分離膠為10%，濃縮膠為5%。

1.3.5 不同蛋白酶對(duì)牛跟腱I型膠原蛋白的作用對(duì)比

分別將BSC、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶作用于牛跟腱I型膠原蛋白上，在溫度為50 ℃和pH 6.5條件下反應(yīng)6 h后，沸水浴5 min，冷卻后離心取上清液，對(duì)其進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.3.6 BSC的底物特異性

將BSC分別作用于牛血清白蛋白，牛跟腱I型膠原蛋白、牛跟腱II型膠原蛋白、牛跟腱Ⅲ型膠原蛋白，在溫度為50 ℃和pH 6.5條件下反應(yīng)6 h后，沸水浴5 min，冷卻后離心取上清液，分別測(cè)其水解度。

1.3.7 BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動(dòng)力學(xué)分析

1.3.7.1 BSC降解牛骨膠原蛋白過程監(jiān)測(cè)

將分離純化出的BSC作用于牛骨膠原蛋白，研究降解過程中酶添加量(0.12、0.22、0.32、0.42 g/100 mL)和牛骨膠原蛋白添加量(4.14、5.14、6.14、7.14 g/100 mL)對(duì)水解度的影響。其中，調(diào)節(jié)反應(yīng)液至pH 6.5，將其置于恒溫培養(yǎng)搖床中在46 ℃的條件下反應(yīng)8 h，分別在每隔30 min對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間下將反應(yīng)液沸水浴滅酶15 min，以6 570g的離心力離心15 min，得上清液測(cè)其水解度。

1.3.7.2 BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建

通過BSC降解牛骨膠原蛋白中不同BSC添加量和牛骨粉添加量對(duì)其水解度的影響，根據(jù)各研究學(xué)者前期的模型構(gòu)建，結(jié)合本試驗(yàn)的相關(guān)參數(shù)，推導(dǎo)出符合本研究BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動(dòng)力學(xué)的模型，并對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確保模型的有效性。

1.4 測(cè)定方法

(1)BSC酶活的測(cè)定：茚三酮顯色法[20]。

(2)BSC的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：Bradford法[20]。

圖1為利用Origin 8.5得到的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.021 85x+0.065 75，R2=0.994 13。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

(3)水解度的測(cè)定：甲醛-電位滴定法[21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSC分離純化結(jié)果

將(NH4)SO4沉淀后的M2樣進(jìn)行DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析的分離純化，結(jié)果如圖2。

圖2 BSC的DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析圖Fig.2 The DEAE-Sepharose fast flow ion exchange chromatography of BSC

圖2中結(jié)果表明，整個(gè)M2樣的洗脫時(shí)間為260 min，期間共出現(xiàn)了30～75 min的洗脫峰I、85～150 min的洗脫峰II、170～235 min的洗脫峰Ⅲ3個(gè)明顯分離的洗脫峰，分別對(duì)這3個(gè)明顯的洗脫峰進(jìn)行膠原蛋白酶酶活的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅在洗脫峰Ⅲ的時(shí)間范圍內(nèi)檢測(cè)出了膠原蛋白酶酶活，證明在170～235 min洗脫時(shí)間內(nèi)分離出的為BSC，為了保證BSC的純度，收集180～185 min內(nèi)的洗脫液，此時(shí)NaCl的濃度為0.57 mol/L左右，此范圍內(nèi)收集的BSC活達(dá)到最高，重復(fù)多次試驗(yàn)，收集BSC洗脫液，于真空冷凍干燥箱內(nèi)干燥得M3樣。將M3樣進(jìn)行Sephadex G-100凝膠層析，如圖3所示。

圖3 BSC的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.3 The sephadex G-100 gel chromatogram of BSC

由圖3可知，M3樣的洗脫時(shí)間為230 min，在整個(gè)分離純化期間共出現(xiàn)了2個(gè)完全分離的洗脫峰，洗脫峰I、II出現(xiàn)的時(shí)間為40～80 min和120～200 min，分別對(duì)洗脫峰I和II中的各管BSC的洗脫液進(jìn)行酶活檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在洗脫峰II的時(shí)間范圍內(nèi)檢測(cè)出了膠原蛋白酶酶活，證明在120～200 min的洗脫時(shí)間內(nèi)分離純化出的為BSC，為了保證BSC的純度，我們選取155～165 min內(nèi)的洗脫液進(jìn)行收集，此范圍內(nèi)收集的BSC酶活達(dá)到最高，重復(fù)多次試驗(yàn)，收集BSC洗脫液，真空冷凍干燥后的BSC純品。

由表1可知，在BSC粗酶液中總酶活為46.92×103U，蛋白質(zhì)總含量為360.92 mg，經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀后BSC中大部分雜質(zhì)已經(jīng)除去，再經(jīng)過2次柱層析的分離純化后BSC的蛋白質(zhì)總含量為1.14 mg，總酶活為6.35×103U，比活力為5.57×103U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到42.85倍，純化效果良好。

表1 BSC的分離純化結(jié)果Table 1 The isolation and purification results of BSC

2.2 BSC分子量及純度鑒定

分別對(duì)各步處理的BSC樣品進(jìn)行SDS-PAGE純度鑒定，并對(duì)最后分離純化出的純酶進(jìn)行分子質(zhì)量的測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖4表明，M2樣條帶較多，證明此時(shí)的酶液中含有較多的雜蛋白質(zhì)；M3樣僅有幾條明顯的條帶，表明M3樣大部分的雜蛋白被分離除去；當(dāng)M3樣經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析純化過后，只有1條明顯的條帶，證明此時(shí)分離純化出的BSC已達(dá)到了電泳純的程度，為BSC純酶。目前有關(guān)膠原蛋白酶的研究，如李星碩等[22]純化的膠原酶的分子質(zhì)量為100.0 kDa，龔福明等[25]從枯草芽孢桿菌中提取的膠原蛋白酶分子質(zhì)量為33.0 kDa，劉麗莉等[2]從蠟樣芽孢桿菌中的得到的蛋白酶分子質(zhì)量約為38.0 kDa，而本實(shí)驗(yàn)分離純化的BSC的分子質(zhì)量約為52.0 kDa，可以認(rèn)定其為一種新型的蛋白酶。

Mark—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—Sephadex G-100凝膠層析后純化的BSC； 2—DEAE -Sepharose Fast Flow陰離子層析后分離的BSC； 3—(NH4)2SO4沉淀后的粗酶液圖4 BSC的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of purified BSC

2.3 不同蛋白酶對(duì)牛跟腱I型膠原蛋白的作用對(duì)比

測(cè)定牛跟腱I型膠原蛋白在不同蛋白酶的作用下水解度的變化，結(jié)果見圖5。

圖5 不同蛋白酶對(duì)牛跟腱I型膠原蛋白的作用Fig.5 The influences of different protease on type I collagen of bovine achilles tendon

由圖5可知，5種酶降解能力為：BSC﹥胃蛋白酶﹥風(fēng)味蛋白酶﹥木瓜蛋白酶﹥中性蛋白酶(p<0.05)，結(jié)果表明BSC對(duì)降解牛跟腱I型膠原蛋白的作用顯著，因此具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

2.4 不同蛋白底物在BSC作用下水解度的變化

將分離純化的BSC酶作用于不同蛋白底物，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同蛋白底物對(duì)水解度的影響Fig.6 The influences of different protein substrates on the degree of hydrolysis

圖6表明，BSC酶對(duì)牛血清白蛋白沒有降解作用，而對(duì)其他3種類型的膠原蛋白都表現(xiàn)出了降解能力，特別是對(duì)I型膠原蛋白的水解度高達(dá)31%，顯著高于II、III型膠原蛋白的水解度為16%和22%(p<0.05)，因此確定BSC酶具有特異降解I型膠原蛋白的能力。

2.5 BSC降解牛骨膠原蛋白的動(dòng)力學(xué)分析

2.5.1 不同BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量對(duì)降解過程中水解度的影響

針對(duì)不同的酶添加量和底物濃度，測(cè)定牛骨膠原蛋白的水解度變化,結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著BSC和骨膠原蛋白添加量的不斷上升，水解度也逐漸提高。同時(shí)也可看出，在反應(yīng)初期，兩者的降解反應(yīng)速率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先迅速增加后變緩，最終基本保持不變。這是因?yàn)榉磻?yīng)初期隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，BSC與骨膠原蛋白充分結(jié)合反應(yīng)，加快了反應(yīng)速率，但是當(dāng)?shù)竭_(dá)一定的反應(yīng)時(shí)間后，BSC與骨膠原蛋白反應(yīng)基本完成，反應(yīng)體系達(dá)到飽和，導(dǎo)致反應(yīng)后期反應(yīng)速率基本保持不變。

圖7 酶添加量和底物濃度對(duì)降解過程中水解度的影響Fig.7 The influence of adding amount of enzyme addition and substrate concentration on DH during degradation process

2.5.2 BSC降解牛骨膠原蛋白動(dòng)力學(xué)的構(gòu)建

BSC降解牛骨膠原蛋白的過程可以用Michaelis-Menten的快速平衡學(xué)說來反映[26]，他們所建立的米氏方程可以有效地描述降解反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)，即反應(yīng)用的酶(E)與作用的底物(S)作用所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物(ES)會(huì)再生成產(chǎn)物(P)，反應(yīng)過程如式(1)所示：

(1)

結(jié)合前期的許多研究學(xué)者[10,13]的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，BSC降解骨膠原蛋白過程的動(dòng)力學(xué)模型為：

(2)

其中:DH為水解度，%；t為降解時(shí)間，h；E0為BSC添加量，g/100 mL；S0為牛骨膠原蛋白添加量，g/100 mL；K2為降解反應(yīng)速率常數(shù)項(xiàng)，h-1；Kd為BSC失活反應(yīng)速率常數(shù)項(xiàng)，h-1；Km為米式常數(shù)。

令

(3)

(4)

結(jié)合(2)、(3)、(4)得出BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動(dòng)力學(xué)模型為：

(5)

R=αS0exp(-β×DH)

(6)

其中：R為降解速率。

2.5.3 BSC降解牛骨膠原蛋白的動(dòng)力學(xué)各參數(shù)的確定

將圖7中不同的BSC和牛骨膠原蛋白添加量和不同降解時(shí)間內(nèi)水解度的變化分別帶入式(5)，利用Origin 8.5分別對(duì)其進(jìn)行非線性擬合，擬合結(jié)果如表2所示。

表2 降解過程擬合結(jié)果表Table 2 The fitting results of the degradation process

由表2中的數(shù)據(jù)可以得出式(5)中對(duì)應(yīng)的各個(gè)參數(shù)，如表3所示。

表3 降解過程動(dòng)力學(xué)參數(shù)表Table 3 The kinetic parameters of the degradation process

由表3可以得出，在恒溫條件下，隨著BSC添加量的逐漸增加，α呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，隨著骨膠原蛋白添加量的逐漸增加，α反而逐步降低，這恰好與公式(3)相對(duì)應(yīng)，α與BSC添加量成正比，與骨膠原蛋白添加量成反比，同時(shí)，在表3中可以看出，β并不隨BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量的變化而變化，基本在0.119 0左右的范圍內(nèi)，由公式(4)中可以看出，在設(shè)定相同溫度反應(yīng)體系的前提下，β可當(dāng)作常數(shù)。

由式(3)可知，α與BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量的比值呈線性關(guān)系，采用Origin 8.5對(duì)表3中E0/S0，α的結(jié)果進(jìn)行線性擬合，得出結(jié)果為：

(7)

其中:R2為0.956 8。

將式(7)與式(3)結(jié)合，可得K2為583.816 3 h-1。

將α，β帶入式(6)，得出所構(gòu)建的BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動(dòng)力學(xué)模型為：

(8)

R=(583.813 6E0+1.296 7S0)exp(-0.119 0DH)

(9)

由張輝[10]的結(jié)果可知，

K4=KdKm

(10)

其中：K4為BSC降解牛骨膠原蛋白過程中BSC失活常數(shù)(h-1)。

將式(7)帶入式(3)和式(4)得：

(11)

由式(11)可知，α、β的乘積與BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量的比值呈線性關(guān)系，采用Origin 8.5對(duì)表3中E0/S0，αβ的結(jié)果進(jìn)行線性擬合，得出結(jié)果為：

(12)

其中：R2為0.942 7。

由式(12)可以得出，BSC降解牛骨膠原蛋白過程中BSC的失活常數(shù)K4為64.115 7 h-1。

2.5.4 BSC降解牛骨膠原蛋白的動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本模型，在反應(yīng)溫度46 ℃、牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、酶添加量0.42 g/100 mL、pH 6.5的條件下分別測(cè)得不同反應(yīng)時(shí)間的水解度變化。如圖8所示，與模型擬合值基本吻合，相對(duì)誤差為0.45%，表明此模型能較好地描述牛骨膠原蛋白的降解過程，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

圖8 水解動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證Fig.8 Validation of hydrolysis kinetic model

3 結(jié)論

本研究從課題組篩選到的菌株BacilluscereusMBL13-U的粗酶液中，通過(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-100凝膠層析，得到分子質(zhì)量為52.0 kDa的BSC酶，其比活力為5.57×103U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到42.85倍，得率為 13.53%。經(jīng)底物特異性分析該酶為骨膠原蛋白酶，對(duì)I型膠原蛋白具有顯著的水解能力。通過對(duì)比試驗(yàn)表明其降解I型膠原蛋白的能力顯著優(yōu)于常用的蛋白酶。通過對(duì)不同的BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量對(duì)骨膠原蛋白降解過程中水解度影響，建立BSC降解牛骨膠原蛋白的動(dòng)力學(xué)模型。同時(shí)得出BSC降解牛骨膠原蛋白過程中BSC的失活常數(shù)K4為64.1157/h。通過驗(yàn)證試驗(yàn)確定所建模型與實(shí)驗(yàn)值基本吻合，誤差較小，具有較高的利用價(jià)值，為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供良好的理論支持。

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PurificationofBacilluscereusMBL13-Ucollagenaseanddegradationkineticsofcollagen

LIU Li-li1*,YANG Chen-liu,LI Yu,LIANG Yan-yu,LI Dan,MENG Yuan-yuan,DAI Xiao-ning

(College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

collagen; purification; bone specific collagenase(BSC); kinetics; degradation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015222

博士,副教授(本文通訊作者，E-mail：yangliuyilang@126.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401622)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303084)；河南省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(152102110080)；河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(13A550255)；河南省重大專項(xiàng)(161100110900)

2017-07-17，改回日期：2017-09-01