田維敏，宿 桐，黃 萍，吳妙心

1,25-二羥維生素D3對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及RhoA表達(dá)的影響

田維敏1*，宿 桐2，黃 萍1，吳妙心1

目的觀察1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘大鼠AMSCs增殖及RhoA表達(dá)的影響，探討其在哮喘治療中的作用。方法用卵白蛋白致敏和激發(fā)建立急性哮喘模型，原代培養(yǎng)急性哮喘大鼠的ASMCs，以1,25-(OH)2D3作為干預(yù)因素，CCK8法檢測(cè)1,25-(OH)2D3對(duì)ASMCs增殖的影響,測(cè)定細(xì)胞增殖活力；用TNF-α、1,25-(OH)2D3和地塞米松(DXM)處理體外培養(yǎng)的急性哮喘大鼠ASMCs并分組：對(duì)照組(N)、哮喘組(A組)、1,25-(OH)2D3組(VD組)、DXM組、1,25-(OH)2D3+DXM聯(lián)合治療組(L組)。用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。同時(shí)采用Real time PCR和Western blot方法檢測(cè)肺組織和ASMCs中RhoA的表達(dá)變化，研究其作用機(jī)制。結(jié)果1,25-(OH)2D3在10-9～10-6mol/L濃度下能顯著抑制ASMCs的增殖，且為濃度依賴性(P<0.05)；1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘大鼠的ASMCs的抗增殖作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘大鼠的ASMCs遷移有明顯的抑制作用；1,25-(OH)2D3顯著抑制哮喘大鼠ASMCs細(xì)胞周期中G1/S期的轉(zhuǎn)化；1,25-(OH)2D3抑制并減少了RhoA/Rho激酶信號(hào)通路中RhoA基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)論1,25-(OH)2D3能顯著抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖、遷移及細(xì)胞周期的進(jìn)展，這種多重的抑制作用可能是其通過調(diào)控RhoA/Rho激酶信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥、AHR和氣道重塑的作用機(jī)制之一。

哮喘；1,25-二羥維生素D3；氣道平滑肌細(xì)胞；增殖；遷移；細(xì)胞周期；RhoA

0 引言

支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness,AHR)和不可逆性氣流受阻是哮喘的三大特征，除炎癥細(xì)胞外，氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞如氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cells，ASMCs)、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞也發(fā)揮著重要的作用[1]。ASMCs具有收縮功能，能表達(dá)黏附分子，釋放細(xì)胞因子，產(chǎn)生基質(zhì)成分和金屬蛋白酶等，這些物質(zhì)可促進(jìn)ASMCs增殖，加重氣道重構(gòu)[2]，并與AHR密切相關(guān)。ASMCs增生和肥大是氣道重塑的主要病理改變，而氣道重塑最終可導(dǎo)致不可逆的氣流阻塞及肺功能進(jìn)行性和持續(xù)性的損害，有效抑制ASMCs的過度增殖，是治療哮喘的重要途徑。

糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的基本藥物,主要通過抑制氣道炎癥和ASMCs增殖來(lái)治療哮喘[3]，但其長(zhǎng)期吸入是否會(huì)導(dǎo)致全身不良反應(yīng)仍不清楚，且糖皮質(zhì)激素?zé)o法完全阻斷炎性遞質(zhì)。有研究顯示,吸入糖皮質(zhì)激素可引起腎上腺功能抑制。

1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2D3] 是體內(nèi)最重要的維生素D的活性代謝產(chǎn)物，可作用于免疫反應(yīng)，在防治自身免疫性疾病方面亦有一定療效[4-5]。1,25-(OH)2D3可有效抑制多種類型細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Kim等[6]的研究表明,1,25-(OH)2D3抑制了VEGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖并使細(xì)胞周期停滯，但其在哮喘中對(duì)ASMCs的作用機(jī)制目前尚未明確，本研究就此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SPF級(jí)Wistar大鼠，體重150～160 g，由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，滅活百日咳桿菌疫苗購(gòu)于北京生物制品研究所，1,25-(OH)2D3口服制劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，布地奈德混懸液購(gòu)自澳大利亞阿斯利康公司，重組人TNF-α、RhoA購(gòu)于Peprotech公司，地塞米松(Dexamethasome,DXM)購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 按照Wistar大鼠哮喘模型制作方法制作哮喘模型[7]。根據(jù)隨機(jī)化分配原則將40只SPF級(jí)Wistar大鼠分為5組，每組8只。正常對(duì)照組(N組)、哮喘組(A組)、1,25-(OH)2D3組(VD組)、布地奈德組(P組)和1,25-(OH)2D3與吸入用布地奈德混懸液聯(lián)合治療組(L組)。

1.2.2 取材、細(xì)胞的純化及傳代 取前述哮喘模型大鼠，10%水合氯醛40 mg/kg麻醉，無(wú)菌取氣管，剝離氣管內(nèi)、外膜及軟骨，剪碎剩余的平滑肌條。經(jīng)離心，胰酶和Ⅳ型膠原酶消化后，應(yīng)用差速貼壁法來(lái)純化細(xì)胞，然后接種至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.3 細(xì)胞分組 將培養(yǎng)至4～6代長(zhǎng)致80%融合的急性哮喘模型大鼠的ASMCs做同步化處理，進(jìn)行分組并參照文獻(xiàn)[4-5,8-9]處理細(xì)胞：對(duì)照組(N組)為急性哮喘模型組、TNF-α組(A組)、1,25-(OH)2D3組(VD組)、DXM組(P組)、1,25-(OH)2D3+DXM 聯(lián)合治療組(L組)。

1.2.4 確定1,25-(OH)2D3作用的最佳濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ASMCs，以6×103/well接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)孵育，待細(xì)胞完全貼壁伸展后將其同步化，給予TNF-α刺激，并將細(xì)胞分6個(gè)亞組：分別加入10-6～10-11mol/L 1,25-(OH)2D3孵育24 h，每孔加入CCK8液孵育1 h，選擇450 nm波長(zhǎng)，用自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值，記錄、分析、確定1,25-(OH)2D3最佳作用濃度。

1.2.5 確定1,25-(OH)2D3作用的最佳時(shí)間 繼續(xù)用CCK8法對(duì)1,25-(OH)2D3進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)的抗增殖作用檢測(cè)。分別于1,25-(OH)2D3刺激后12、24、36、48 h各取一塊培養(yǎng)板，檢測(cè)A450nm值，比較各時(shí)間點(diǎn)下1,25-(OH)2D3對(duì)ASMCs的增殖抑制率，確定1,25-(OH)2D3的最佳作用時(shí)間。

1.2.6 Transwell小室檢測(cè)ASMCs的跨膜遷移 將Transwell小室上下室之間用預(yù)處理的孔徑8 μm的聚碳酸脂膜隔開。上室加入細(xì)胞懸液，下室加入趨化誘導(dǎo)物。按“1.2.3”項(xiàng)下方法分組，24 h后加入24孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞通過膜上的小孔遷移、黏附到膜的下面，將膜下面的ASMCs經(jīng)固定、染色、透明及封片，倒置顯微鏡(200×)下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè) ASMCs的細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASMCs接種于25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，細(xì)胞完全貼壁伸展且匯合近瓶底面積的80%時(shí)，棄上清。按Transwell小室細(xì)胞分組方法給細(xì)胞分組和處理，孵育24 h，然后消化、水洗，制備細(xì)胞懸液，經(jīng)離心、棄上清、酒精固定等處理后，將1×10-7個(gè)ASMCs懸浮于1 mL碘化吡啶染液中37 ℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。

依公式PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。

詢問了解患者的亞急性甲狀腺炎情況與病史，對(duì)患者進(jìn)行詳細(xì)的身體檢查，進(jìn)行確切的診斷，了解患者的禁忌情況等，以上檢查與詢問情況進(jìn)行保密。本組患者同時(shí)進(jìn)行核醫(yī)學(xué)及超聲檢查。

1.2.8 RT-PCR檢測(cè)大鼠肺組織和ASMCs中RhoA的mRNA表達(dá) 采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，分別制作目的基因RhoA和管家基因GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。采用TRIzol法抽提總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。

表1 引物序列

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度114 bp。反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。以預(yù)實(shí)驗(yàn)中Ct值為18的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，用RNasefree dH20依次稀釋，與樣品同時(shí)擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)梯度點(diǎn)分析，若相關(guān)系數(shù)γ2>0.96，表明線性關(guān)系良好，可確定為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光定量PCR儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果，待測(cè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用2-△△Ct方法得出相對(duì)倍數(shù)。

1.2.9 Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織及細(xì)胞中RhoA蛋白表達(dá) 取出凍存的標(biāo)本，將組織塊剪碎，消化收集各組細(xì)胞，裂解離心提取蛋白質(zhì)，將樣本用裂解緩沖液稀釋，各標(biāo)本蛋白上樣50 μL，上清用12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，再轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。用含5%去脂奶粉的TBS封閉4 ℃過夜。取出膜后，TBS洗膜，加入一抗(1∶400)，室溫下孵育2 h，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫下孵育2 h，清洗，發(fā)光。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件(America)分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn)行定量分析。蛋白含量=樣本蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值。

2 結(jié)果

2.1 CCK8法檢測(cè)1,25(OH)2D3對(duì)ASMCs增殖活力的影響 在TNF-α刺激的ASMCs增殖的基礎(chǔ)上，分別加入不同濃度1,25(OH)2D3培養(yǎng)24 h，用CCK8法測(cè)定各組A450nm吸光度值，發(fā)現(xiàn)10-9～10-6mol/L的VD組A450nm值均較A組明顯下降，具有濃度依賴性，因10-7mol/L作用已非常明顯，故選10-7mol/L作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究，見表2。

表2 不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)ASMCs增殖活力的影響(n=8)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組、VD 10-11mol/L、VD 10-10mol/L比較，P<0.01；c.與VD 10-9mol/L比較，P<0.01；d.與VD 10-8mol/L比較，P<0.05；e.與VD 10-8mol/L比較，P<0.01；f.與VD 10-7mol/L比較，P<0.01

2.2 用CCK8法對(duì)10-7mol/L 1,25(OH)2D3抗ASMCs增殖的多時(shí)間點(diǎn)作用的檢測(cè) 用CCK8法對(duì)10-7mol/L 1,25(OH)2D3進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)的抗增殖作用檢測(cè)，可見隨時(shí)間延長(zhǎng)，1,25(OH)2D3對(duì)TNF-α刺激的ASMCs的抗增殖作用越明顯，具有時(shí)間依賴性，見表3。

表3 10-7mol/L 1,25(OH)2D3對(duì)TNF-α刺激的ASMCs增殖的影響(A450nm吸光度值)(n=8)

注：a.與N組比較，P<0.05；b.與A組比較，P<0.05

2.3 1,25(OH)2D3對(duì)TNF-α刺激的ASMCs遷移的影響 由表4可見，1,25(OH)2D3對(duì)TNF-α刺激的ASMCs的遷移有明顯的抑制作用，其遷移細(xì)胞數(shù)較A組明顯減少(P<0.01)，較P組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合治療組較VD組和P組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示1,25(OH)2D3可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的ASMCs遷移，但其作用弱于DXM，二者聯(lián)合應(yīng)用作用明顯。

2.4 1,25(OH)2D3對(duì)TNF-α處理的ASMCs細(xì)胞周期的影響 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，TNF-α刺激后，ASMCs的PI較N組明顯增高(P<0.05)，而VD組PI降低(P<0.05)；進(jìn)一步比較細(xì)胞周期的時(shí)相分布，可見1,25(OH)2D3顯著增加了TNF-α刺激的G0/1期比例(P<0.05)，相應(yīng)地減少了S期及G2/M期的比例(P<0.05)，即阻止了細(xì)胞由G0/1期向S期的轉(zhuǎn)化；但其作用弱于P組和L組(P<0.05)，見表5。

表4 各組ASMCs遷移情況(n=8)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組比較，P<0.05；c.與VD組比較，P<0.05；d.與P組比較，P<0.05

表5 各組ASMCs細(xì)胞周期比較(n=5)

注：a.與N組比較，P<0.05；b.與A組比較，P<0.05；c.與VD組比較，P<0.05；d.與P組比較，P<0.05

2.5 Real time PCR檢測(cè)1,25(OH)2D3對(duì)哮喘大鼠氣道及平滑肌細(xì)胞RhoA mRNA表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)定量PCR的相對(duì)定量分析顯示，在肺組織與ASMCs水平上，各模型組大鼠RhoA特異產(chǎn)物的融解溫度為88.0 ℃。經(jīng)GAPDH內(nèi)參照標(biāo)化后，比較各目的基因mRNA的相對(duì)含量，可見各組均較C組增高(P<0.01)；各治療組經(jīng)治療后,較TNF-α組顯著下降(P<0.01)；1,25(OH)2D3作用弱于P組和L組(P<0.01)；L組作用明顯優(yōu)于VD組、P組，組織水平上仍高于N組(P<0.05)，但細(xì)胞水平上與N組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

2.6 Western blot檢測(cè)1,25(OH)2D3對(duì)哮喘大鼠氣道及平滑肌細(xì)胞RhoA蛋白表達(dá)的影響 在肺組織與ASMCs水平上，VD組、P組及L組均顯著下調(diào)了哮喘大鼠RhoA的蛋白表達(dá)(P<0.01)；L組與N組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明在治療哮喘方面，1,25(OH)2D3與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同效應(yīng),見表7、圖1、圖2。

表6 各組大鼠肺組織及ASMCs中RhoA mRNA表達(dá)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組比較，P<0.01；c.與VD組比較，P<0.01；d.與P組比較，P<0.01

表7 各組大鼠肺組織及ASMCs中RhoA蛋白表達(dá)灰度值(n=3)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組比較，P<0.01；c.與VD組比較，P<0.01；d.與P組比較，P<0.05

圖1 肺組織中RhoA的蛋白表達(dá)

圖2 ASMCs中RhoA的蛋白表達(dá)

3 討論

哮喘是一種以氣道慢性炎癥、AHR和氣道重塑為特征的異質(zhì)性疾病。氣道重塑是指發(fā)生在氣道的結(jié)構(gòu)改變，包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、黏液分泌增加、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基底膜和平滑肌層增厚、新生血管生成等[10]，與氣道慢性炎癥、ASMC功能紊亂共同構(gòu)成支氣管哮喘的三個(gè)主要病理特征。氣道重塑與哮喘患者預(yù)后不良有關(guān)，直接影響患者病情轉(zhuǎn)歸。因此，識(shí)別支氣管氣道重塑的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)哮喘的治療尤為重要。

ASMCs是各種炎癥介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)引起收縮的部分，也是各種炎癥因子、細(xì)胞因子、趨化因子及生長(zhǎng)因子的來(lái)源，存在收縮和合成兩種表型，二者在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，其特點(diǎn)為強(qiáng)大的生長(zhǎng)和遷移能力。ASMCs的遷移是哮喘氣道重塑的重要特征之一。各種絲裂原和介導(dǎo)ASMCs增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均可導(dǎo)致ASMCs的增殖、遷移和細(xì)胞周期的進(jìn)展[11-13]。細(xì)胞周期有兩個(gè)關(guān)鍵性限制點(diǎn)，分別為G1/S 期、G2/M 期[14]，細(xì)胞在G1期對(duì)細(xì)胞外信號(hào)發(fā)生應(yīng)答，如能越過G1/S 期限制點(diǎn)，則細(xì)胞周期就可自主進(jìn)行,故G1期時(shí)程決定了細(xì)胞周期的長(zhǎng)短。哮喘時(shí)，細(xì)胞外的各種絲裂原通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)ASMCs 增殖，因此，若能阻斷細(xì)胞完成細(xì)胞分裂周期，就可望達(dá)到控制或逆轉(zhuǎn)氣道重構(gòu)的目的，從而控制哮喘。

Rho/Rock信號(hào)通路參與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，可調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等[15]。Rho蛋白是具有GTP酶活性的Ras超家族中的小分子G蛋白成員，以活化的Rho-GTP 形式和非活化的Rho-GDP 形式兩種狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，具有活性的RhoA可影響細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)和形態(tài)，使平滑肌產(chǎn)生收縮等生理功能。Rock是Rho 激酶下游靶效應(yīng)分子，以兩種同源性極高的異構(gòu)體形式存在(Roka/Rock2、Rokβ/Rockl)，分別存在于肺、肝臟、骨骼肌、心臟等組織器官中[16]。多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等可使Rho活化，ROCK與GTP結(jié)合蛋白R(shí)ho相互作用，通過磷酸化激活多種下游蛋白或核因子，從而引起細(xì)胞骨架、肌動(dòng)蛋白纖維的形成和組裝，在機(jī)體的各項(xiàng)調(diào)節(jié)功能中起重要作用。研究表明，Rho/Rho激酶信號(hào)通路選擇性抑制劑可明顯抑制5-HT誘導(dǎo)的大鼠ASMC的增殖，且使細(xì)胞停滯于G0/G1期。抑制Rho激酶可以減少氣道重塑和AHR，還可以減少氣道炎癥和氧化應(yīng)激[17]。綜上所述，Rho/Rock激酶信號(hào)通路可通過介導(dǎo)ASM收縮、成肌纖維細(xì)胞分化和ASMCs成熟、氣道壁間質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移以及炎癥細(xì)胞的遷移，在哮喘等慢性氣道炎癥疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

吸入糖皮質(zhì)激素是目前長(zhǎng)期預(yù)防和治療哮喘的一線藥物[18]，主要通過抑制氣道炎癥治療哮喘,并能有效抑制ASMCs 的增殖，但其作用是非特異的，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起一系列代謝及內(nèi)分泌紊亂等不良反應(yīng)，且隨著病程的進(jìn)展，哮喘患者還有可能出現(xiàn)不同程度的氣道重塑，最終發(fā)展成為不可逆的氣流阻塞。

維生素D缺乏與哮喘、過敏性鼻炎和喘息密切相關(guān)[19-20]，可導(dǎo)致哮喘加重[21]，增加炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的氣道重塑[22]。1,25-(OH)2D3可抑制多種類型細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[23]，同時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和分化[24]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3通過部分抑制哮喘大鼠氣道和血清中Eotaxin、IL-8、IgE的產(chǎn)生等來(lái)減少氣道炎癥、AHR和改善肺功能[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可增強(qiáng)激素抵抗性哮喘和激素敏感性哮喘患者單核細(xì)胞的抗炎效應(yīng)，并可增強(qiáng)激素的作用[26]。Th17細(xì)胞因子在哮喘,包括激素抵抗性哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，嚴(yán)重哮喘患者Th17細(xì)胞因子水平增加。Th17不能被類固醇激素抑制，而1,25-(OH)2D3可通過T細(xì)胞和DCs介導(dǎo)的通路抑制Th17細(xì)胞因子的產(chǎn)生，表明維生素D對(duì)于哮喘患者可增強(qiáng)類固醇的效應(yīng)[27-28]。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK8法檢測(cè)在10-11～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)1,25(OH)2D3對(duì)ASMCs增殖活力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3在10-9～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)ASMCs表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性的增殖抑制作用；1,25(OH)2D3可抑制哮喘大鼠的ASMCs的增殖和遷移，將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G1期而產(chǎn)生增殖抑制效應(yīng)。1,25-(OH)2D3減少了RhoA蛋白和mRNA的表達(dá)，抑制了Rho/ROCK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制了哮喘的氣道炎癥、AHR和氣道重塑。1,25-(OH)2D3在本部分試驗(yàn)中的作用弱于糖皮質(zhì)激素，但聯(lián)合應(yīng)用作用明顯，表明1,25(OH)2D3可以增強(qiáng)類固醇效應(yīng)。然而，亦有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3并沒有降低持續(xù)性哮喘和維生素D缺乏的成人哮喘患者首次治療失敗或加重的發(fā)生率[29]，這些研究結(jié)果不支持有癥狀的哮喘患者補(bǔ)充維生素D3治療的戰(zhàn)略。因此，1,25-(OH)2D3，在臨床上是否能輔助糖皮質(zhì)激素治療哮喘，還有待于進(jìn)一步探討，以期發(fā)現(xiàn)更合理的臨床應(yīng)用方式。

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Effectsof1,25-dihydroxyvitaminD3onproliferationofASMCsandRhoAinasthmaticrats

TIAN Wei-min1*,SU Tong2,HUANG Ping1,WU Miao-xin1

(1.Department of Pediatrics,Zhongshan Hospital,Xiamen University,Xiamen 361004,China;2.the First Clinical College,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

ObjectiveTo observe the effect of 1,25-(OH)2D3on proliferation of ASMCs and RhoA in asthma rats,and explore its role in the treatment of asthma.MethodsAcute asthma models of Wistar rats were established with ovalbumin sensitizing and challenging,ASMCs of acute asthmatic rats were primarily cultured.1,25-(OH)2D3as the intervention factors,the effect of 1,25-(OH)2D3on proliferation and proliferation activity of ASMCs was determined by CCK8.The cultured ASMCs of acute asthma rat in vitro were divided into 5 groups:control group (group N),TNF-α group (group A),1,25-(OH)2D3group (group VD),DXM group,1,25-(OH)2D3+DXM group (group L). The cell migration was detected by Transwell chamber;cell cycle was analyzed by flow cytometry. Meanwhile,the expression of RhoA in lung tissue and ASMCs was detected by Real time PCR and Western blot,and the mechanism of action was analyzed.Results1,25-(OH)2D3could significantly inhibit the proliferation of ASMCs in a concentration dependent manner (P<0.05);1,25-(OH)2D3had anti-proliferative effects on ASMCs of asthmatic rats in a time dependent manner;1,25-(OH)2D3had obviously inhibitory effect on the migration of ASMCs in asthmatic rats;1,25-(OH)2D3could significantly inhibit the cell cycle conversion during G1/S period in ASMCs of asthma rats;1,25- (OH)2D3could inhibit and decrease the expression of RhoA gene and protein in Rho/Rho kinase signaling pathway.Conclusion1,25-(OH)2D3can inhibit the proliferation,migration and cell cycle progression of ASMCs,which may be one of the mechanisms by which RhoA/Rho kinase signaling pathway regulates airway inflammation,AHR and airway remodeling in asthma.

Asthma;1,25-(OH)2D3;ASMCs;Proliferation;Migration;Cell cycle;RhoA

2017-06-05

1.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院兒科，廈門 361004;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，武漢 430030

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016J01615)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712002