韓新影，劉紅正，李秀清，鞠英博，李艷艷，張志剛

(1.滄州市人民醫(yī)院病理科，河北 滄州 061001；2.滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001)

胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

韓新影1，劉紅正2，李秀清1，鞠英博1，李艷艷1，張志剛1

(1.滄州市人民醫(yī)院病理科，河北 滄州 061001；2.滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001)

目的檢測胃癌組織及癌旁組織中VGLL4、YAP蛋白的表達(dá)情況，探討其在胃癌診治中的臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測46例胃癌組織及癌旁組織中VGLL4、YAP蛋白的表達(dá)情況,分析其表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白的陽性表達(dá)率分別為39.1%(18/46)，76.1%(35/46)，癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為91.3%(42/46)、10.9%(5/46)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。VGLL4和YAP蛋白的表達(dá)均與胃癌組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲性具有相關(guān)性(P＜0.05)，且與患者預(yù)后相關(guān)。YAP陽性表達(dá)高水平胃癌患者術(shù)后中位生存時間[(19.000±0.557)個月]明顯短于YAP陽性表達(dá)低水平胃癌患者[(36.000±2.942)個月]，VGLL4陽性表達(dá)低水平胃癌患者術(shù)后中位生存時間[(18.000±1.503)個月]明顯短于VGLL4陽性表達(dá)高水平胃癌患者[(26.000±2.863)個月]，YAP和VGLL4表達(dá)水平均與胃癌患者預(yù)后明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論VGLL4在胃癌組織中較癌旁組織表達(dá)下降，且與腫瘤發(fā)展和惡性程度呈負(fù)相關(guān)，是一種潛在的抑癌蛋白。YAP在胃癌組織中較癌旁組織表達(dá)增高，與腫瘤發(fā)展和惡性程度呈正相關(guān)，且兩者均與患者預(yù)后相關(guān)。

胃癌；免疫組化；VGLL4；YAP

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌惡性生物學(xué)行為的重要特征，是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后差和死亡的主要原因[1-3]。研究表明，Hippo通路可以調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，YAP是其主要的效應(yīng)分子，YAP基因突變或表達(dá)異常引起的Hippo-YAP通路的調(diào)控失常可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡失衡和腫瘤的形成[4]。轉(zhuǎn)錄輔助因子退變樣蛋白4(VGLL4)是VGLL的家族成員之一，VGLL4可以搶先一步控制YAP的活性“開關(guān)”，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。研究者發(fā)現(xiàn)，VGLL4蛋白在胃癌組織中明顯減少，且與腫瘤的發(fā)展及惡化明顯負(fù)相關(guān)，是一種潛在的抑癌蛋白，且癌細(xì)胞對于該多肽抑制劑的敏感性與癌細(xì)胞本身的YAP/VGLL4蛋白比率成正相關(guān)[5]。本研究采用免疫組化檢測胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自滄州市人民醫(yī)院病理科2015年6月至2016年6月存檔的胃癌組織及對應(yīng)癌旁組織(距離癌組織＞5 cm)的石蠟包埋組織46例，重新制備4 μm切片，HE染色，由兩名有經(jīng)驗(yàn)的診斷醫(yī)師進(jìn)行審核及組織學(xué)分型。其中女性19例，男性27例，年齡24～89歲，平均60.5歲，組織學(xué)分型及臨床分期不等。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法兔抗人YAP多克隆抗體，VGLL4單克隆抗體(bs-3605R，bs-9185R)，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)SP法嚴(yán)格按照試劑說明的要求進(jìn)行，YAP一抗稀釋濃度為1：100，VGLL4一抗稀釋濃度為1：200，用已知陽性組織切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照，同時每例取一張切片做HE染色觀察形態(tài)。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) VGLL4、YAP，蛋白著色部位為胞核，少數(shù)病例可見胞漿著色。采用陽性細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度兩項計分法綜合評定陽性結(jié)果，即首先將染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。將陽性細(xì)胞百分比分成5級：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞＜25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強(qiáng)度積分和數(shù)量積分相加：0分為-，2～3分為±，4～5分為+，6～7分為++，其中+、++判讀為陽性。所有胃癌患者被分為兩組，＜4分被認(rèn)為低表達(dá)組，≥4分被認(rèn)為是高表達(dá)組。

1.2.3 臨床病理資料 按照不同的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分組，其中臨床分期采用外科常用的TNM分期法，組織學(xué)分級采用楊軍等提出的一種新型胃癌組織學(xué)分型、分級-評分系統(tǒng)[6]：G1≤4分；G2 5～7分；G3≥8分。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析VGLL4、YAP蛋白表達(dá)與胃癌患者生存時間的關(guān)系，所選46例患者均具有完整的隨訪資料，術(shù)后第一年每2個月隨訪一次，以后每半年隨訪一次，隨訪主要以門診復(fù)查和電話隨訪為主。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料的描述統(tǒng)計量以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。生存率的計算采用Kaplan-meier法，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)，VGLL4和YAP的表達(dá)相關(guān)性采用Spearman's雙變量相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VGLL4、YAP蛋白在胃癌及癌旁組織中陽性免疫反應(yīng)定位及表達(dá)情況 VGLL4蛋白主要在周圍胃黏膜組織中的胞核表達(dá)，呈棕黃色顆粒，在胃癌組織中表達(dá)減少甚至無表達(dá)；YAP蛋白在胃癌組織中主要在胞核和(或)胞質(zhì)表達(dá)，呈棕黃色顆粒，小部分胃癌組織及周圍正常胃黏膜組織中未見表達(dá)(圖1)。VGLL4蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況分別為 39.1%(18/46)和 91.3%(42/46)(χ2=25.348，P＜0.001)，YAP蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況分別為76.1%(35/46)和10.9%(5/46)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.808，P＜0.001)。

2.2 VGLL4和YAP蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 VGLL4和YAP的異常表達(dá)均與胃癌組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲性具有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小并無顯著相關(guān)性(P＞0.05)，見表1。

圖1 VGLL4和YAP在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（SP法×100）

表1 YAP和VGLL4蛋白表達(dá)與46例胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n=46)

2.3 VGLL4和YAP蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性 YAP陽性表達(dá)高水平胃癌患者術(shù)后中位生存時間[(19.000±0.557)個月]明顯短于YAP陽性表達(dá)低水平胃癌患者[(36.000±2.942)個月]，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示YAP表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后相關(guān)(t=-38.636，P＜0.05)。VGLL4陽性表達(dá)低水平胃癌患者術(shù)后中位生存時間[(18.000±1.503)個月]明顯短于VGLL4陽性表達(dá)高水平胃癌患者[(26.000±2.863)個月]，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示VGLL4表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后相關(guān)(t=16.779，P＜0.05)。

2.4 YAP和VGLL4在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在YAP陽性表達(dá)高水平的35例胃癌組織中，VGLL4陽性表達(dá)高水平者10例，VGLL4陽性表達(dá)低水平者25例。在YAP陽性表達(dá)低水平的11例胃癌組織中，VGLL4陽性表達(dá)高水平者8例，VGLL4陽性表達(dá)低水平者3例。同時，在VGLL4陽性表達(dá)高水平的18例胃癌組織中，YAP陽性表達(dá)高水平者10例，YAP陽性表達(dá)低水平者8例。在VGLL4陽性表達(dá)低水平的28例胃癌組織中，YAP陽性表達(dá)高水平者25例，YAP陽性表達(dá)低水平者3例。在Spearman's相關(guān)分析顯示，YAP和VGLL4在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=0.386，P＜0.05)，見表2。VGLL4和YAP蛋白表達(dá)不同水平胃癌患者生存曲線見圖2。

表2 VGLL4和YAP在46例胃癌患者中表達(dá)的相關(guān)性

圖2 YAP和VGLL4表達(dá)水平對胃癌患者術(shù)后生存的影響

3 討 論

胃癌是我國臨床常見的消化道惡性腫瘤，占全部腫瘤死亡率的20%以上[7]，對人來健康構(gòu)成極大威脅。胃癌發(fā)生的分子機(jī)制涉及多個癌基因及抑癌基因的表達(dá)，研究胃癌發(fā)生發(fā)展的基因及蛋白表達(dá)產(chǎn)物，有助于進(jìn)一步明確胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，提高胃癌分子診斷，發(fā)現(xiàn)胃癌治療的新靶點(diǎn)。

YAP蛋白是Hippo信號通路中一種起關(guān)鍵作用的連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過控制細(xì)胞凋亡和增殖之間的平衡，從而調(diào)控器官大小和腫瘤的增殖。Hippo-YAP信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要抑癌通路，通過一系列磷酸化負(fù)性調(diào)控下游YAP蛋白來抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控器官大小[8]。正常情況下，YAP在正常組織中呈不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)，一旦上游或下游分子發(fā)生突變，這些分子就會激活原先不表達(dá)的YAP，作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與TEAD1結(jié)合誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移與癌變的作用，產(chǎn)生腫瘤[9-11]。與本文研究結(jié)果一致，胃癌組織中YAP蛋白表達(dá)水平較癌旁組織顯著增加，且與胃癌患者組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性相關(guān)，生存曲線顯示YAP蛋白高表達(dá)者生存期短于YAP蛋白低表達(dá)者，從而證實(shí)YAP在胃癌組織中作為一種原癌蛋白發(fā)揮作用。是腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)，因此靶向YAP的抑制劑可能會更有效直接地糾正失調(diào)的Hippo信號通路，殺死腫瘤。

轉(zhuǎn)錄輔助因子退變樣蛋白4(VGLL4)是VGLL家族成員之一，是最新發(fā)現(xiàn)的原癌蛋白YAP的拮抗因子，VGLL4通過直接競爭與YAP綁定TEADs對過度激活的YAP-TEAD信號的胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制劑作用，有效地抑制腫瘤的形成及發(fā)展[12-13]，是一種潛在的抑癌蛋白，且癌細(xì)胞對于該多肽抑制劑的敏感性與癌細(xì)胞內(nèi)YAP/VGLL4蛋白比率呈正相關(guān)。本研究顯示胃癌組織中VGLL4表達(dá)較癌旁組織中降低，且VGLL4蛋白的表達(dá)與胃癌的組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性呈負(fù)相關(guān)，生存曲線顯示VGLL4蛋白低表達(dá)者生存期短于VGLL4蛋白高表達(dá)者。進(jìn)一步證實(shí)VGLL4蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。且相關(guān)性分析顯示VGLL4與YAP蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)。但是由于本研究標(biāo)本量有限，未涉及到分子水平的研究，VGLL4和YAP蛋白的具體的相互作用機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述、VGLL4、YAP蛋白的表達(dá)可以有效反映腫瘤細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移的情況，進(jìn)一步判斷患者的預(yù)后，胃癌術(shù)后檢測VGLL4、YAP蛋白的表達(dá)水平，可以一定程度反映胃癌的生物學(xué)特征，為臨床治療提供指導(dǎo)，為胃癌及其相似腫瘤患者提供新的治療思路，準(zhǔn)確判斷胃癌患者的臨床預(yù)后，指導(dǎo)術(shù)后臨床治療，提高患者的生活質(zhì)量，促進(jìn)康復(fù)。

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Relationship between the expression of VGLL4 and YAP protein in gastric cancer tissue and prognosis of patients with gastric cancer.

HAN Xin-ying1,LIU Hong-zheng2,LI Xiu-qing1,JU Ying-bo1,LI Yan-yan1,ZHANG Zhi-gang1. 1.Department of Pathology,the People's Hospital of Cangzhou City,Cangzhou 061001,Hebei,CHINA;2.Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Cangzhou 061001,Hebei,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of vestigial-like family member 4(VGLL4)and yes-associated protein(YAP)in gastric cancer tissue and paracancerous tissue,and to analyze its clinical significance in the diagnosis and treatment of gastric cancer.MethodsThe expression of VGLL4 and YAP protein in 46 cases of gastric carcinoma and paracancerous tissue were detected by SP immunohistochemical method,and the correlation between the expression and prognosis of patients was analyzed.ResultsThe positive expression rates of VGLL4 and YAP protein were respectively 39.1%(18/46)and 76.1%(35/46)in gastric cancer tissues versus 91.3%(42/46)and 10.9%(5/46)in paracancerous tissues(P＜0.05).The expression of VGLL4 and YAP protein were correlated with the histological grade,clinical stage,lymph node metastasis and invasion(P＜0.05),and correlated with the prognosis.The median survival of patients with high level of YAP positive expression was(19.000±0.557)months,which was significantly shorter than(36.000±2.942)months of the patients with low levels of YAP positive expression(P＜0.05);the median survival of patients with low level of VGLL4 positive expression was(18.000±1.503)months,which was significantly shorter than(26.000±2.863)months of the patients with high levels of VGLL4 positive expression(P＜0.05).ConclusionCompared with the adjacent tissue,the expression of VGLL4 in gastric cancer tissue shows a significant downward trend,and the degree of tumor development and malignancy is negatively correlated with the expression of VGLL4,as a potential anti-cancer protein.YAP is a proto-oncogene,which is highly expressed in gastric cancer tissues,and positively correlated with tumor progression and malignancy.The expression of VGLL4 andYAPprotein is correlated with the prognosis of gastric cancer.

Gastric cancer;Immunohistochemistry;Vestigial-like family member 4(VGLL4);Yes-associated protein(YAP)

張志剛。E-mail：zhzhg001518@126.com

R735.2

A

1003—6350（2017）23—3883—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.032

2017-03-29)