鄒永平，李龍鶴

(海南省人民醫(yī)院急診外科，海南 ?？?570311)

SNAI2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

鄒永平，李龍鶴

(海南省人民醫(yī)院急診外科，海南 ?？?570311)

目的明確鋅指轉(zhuǎn)錄因子2(SNAI2)在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法收集海南省人民醫(yī)院胃腸外科2015年9月至2016年4月間收治的50例臨床結(jié)直腸癌組織樣本及癌旁組織，使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測其中SNAI2的表達(dá)水平，t檢驗比較兩組SNAI2水平的差異。針對SNAI2基因，設(shè)計四組干擾RNA序列和一組無任何靶向位點的隨機插入序列。將各組序列剪切到慢病毒載體上，用二代包裝系統(tǒng)包裝成慢病毒懸液。將HT29接種至6孔板，分別標(biāo)記為對照組、shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組。對照組注入插入隨機序列載體的慢病毒懸液，shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組分別注入插入四組干擾RNA序列的慢病毒懸液。挑選SNAI2表達(dá)最高的SW480細(xì)胞系進(jìn)行慢病毒感染，獲得穩(wěn)定knock-down SNAI2細(xì)胞系。在高表達(dá)SNAI2的SW480細(xì)胞系中，采用慢病毒感染的方法構(gòu)建穩(wěn)定干擾SNAI2細(xì)胞株。通過噻唑藍(lán)(MTS)比色法檢測細(xì)胞增殖能力，劃痕實驗檢測細(xì)胞侵襲遷移能力。同時Western blot檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。結(jié)果癌旁組織SNAI2的表達(dá)量低于結(jié)直腸癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與對照組比較，細(xì)胞黏附分子E-cadherin表達(dá)量升高，細(xì)胞骨架蛋白、Vimentin表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；siSNAI2的SW480細(xì)胞系中，與對照組比較，細(xì)胞增殖能力、侵襲能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論SNAI2在人結(jié)直腸癌中表達(dá)量升高，作為一種癌基因，其可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。

SNAI2；結(jié)直腸癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

結(jié)直腸癌(carcinoma of colon and rectum)是全世界常見的惡性腫瘤之一，在中國，其人群發(fā)病率位居第五，且呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。近年來許多研究顯示，鋅指轉(zhuǎn)錄因子2(SNAI2)在多種惡性腫瘤形成的過程中起到重要的作用：它參與腫瘤干細(xì)胞的形成，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用[2]。本研究擬探討SNAI2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本來源 樣本收集于海南省人民醫(yī)院胃腸外科2015年9月至2016年4月間大腸癌病理標(biāo)本50例，以及相應(yīng)癌旁組織50例(距癌變邊緣15 cm切取)取材后液氮保存。

1.2 細(xì)胞來源 實驗所用的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8細(xì)胞均來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究中心。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(Hyclone)、逆轉(zhuǎn)錄試 劑 盒 (Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas)、定 量 PCR試 劑 盒(iQ SYBR Green Supermix，BioRad)、RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code No.9108)、細(xì)胞增殖能力檢測試劑盒(MTS，Promega)、BCAAssay Reagent(美國Pierce Chemical公司)、PVDF膜(Millpore公司，Cat NO.IPVH00010)。

1.4 主要抗體 SNAI2抗體(Abcam，ab27568)、E-cadherin抗體(Abcam，ab15148)、Vimentin抗體(Abcam，ab92547)、β-actin抗體(Santa Cruz，sc-4778)。

1.5 RT-PCR檢測SNAI2基因的表達(dá) TRIZOL法抽提細(xì)胞總RNA。紫外分光光度儀檢測RNA濃度，取5 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用Cyber Green熒光實時定量PCR反應(yīng)體系檢測基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 4 min，擴(kuò)增條件94℃ 30 s，60℃1 min，40個循環(huán)。SNAI2上游引物：5'-AGACCCGCTGGCAAGGTGA CGCAAT-3'；SNAI2下游引物：5'-AATGCTTATTATGCA TCTGAAGT-3'；擴(kuò)增引物大小為1 308 bp。以β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5'-TGGCACCCAGCACA ATGAA-3'；下游引物序列為5'-CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA-3'；目的片段大小為186 bp。

1.6 Western-blot檢測 SNAI2、E-cadherin以及Vimentin表達(dá)水平 收集結(jié)直腸癌癌細(xì)胞，裂解液冰上裂解1 h，15 000 g，15 min離心后提取上清液，收集蛋白質(zhì)，BCA法行蛋白定量分析，配制10%丙烯酰胺膠，上樣，80 V穩(wěn)壓跑膠30 min，120 V穩(wěn)壓跑膠1 h，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.0 h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1.5 h，發(fā)光液曝光顯影。一抗?jié)舛缺葹?：1 000，二抗?jié)舛缺葹?：3 000，以β-actin作為內(nèi)參。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定knock-down SNAI2細(xì)胞系 針對SNAI2基因設(shè)計四組干擾RNA序列和一組無任何靶向位點的隨機插入序列。將各組序列剪切到慢病毒載體上，用二代包裝系統(tǒng)包裝成慢病毒懸液。將HT29接種至6孔板，分別標(biāo)記為對照組、shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組。對照組注入插入隨機序列載體的慢病毒懸液，shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組#、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組分別注入插入四組干擾RNA序列的慢病毒懸液。挑選SNAI2表達(dá)最高的SW480細(xì)胞系進(jìn)行慢病毒感染，獲得穩(wěn)定knock-down SNAI2細(xì)胞系。具體方法：用Lipofectamine 2000以2.5:1的體積比將慢病毒shRNA質(zhì)粒(6 μg/dish)、packing質(zhì)粒(psPAX2，4.5 μg/dish)和Envelop質(zhì)粒(pMD2.G；1.5 μg/dish)一并轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，7 h后更換正常培基，培養(yǎng)48 h，過濾收集上清液，并將帶有慢病毒的上清液感染SW480細(xì)胞，感染3 d后(加入Polybrene)，使用Puromycin篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，并進(jìn)行Western blot驗證。有效shRNA序列為shSNAI21#：TTCACAGCTGTCCCAGAGGG；shSNAI2 2#：TGAGGCGGGACCCTCAGGCC；shCtrl：GCTGTTT TTTGAGATTTCAG，詳細(xì)步驟參見文獻(xiàn)[3]。

1.8 MTS法檢測細(xì)胞增殖活力 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×103個細(xì)胞每孔的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(設(shè)置5個復(fù)孔)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別檢測細(xì)胞0 h、24 h、48 h以及72 h的細(xì)胞增殖活力，MTS與培基以1:5的比例混合均勻，混勻后于生化培養(yǎng)箱中孵育60 min后用多孔板酶標(biāo)儀在490 nm檢測吸光度。

1.9 細(xì)胞侵襲實驗以及細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗 采用Transwell小孔遷移試驗檢測細(xì)胞的侵襲能力，具體步驟見參見文獻(xiàn)[3]及說明書。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測臨床樣本中SNAI2 mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織細(xì)胞中SNAI2 mRNA水平相比正常癌旁組織顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

2.2 Western blot檢測直腸癌細(xì)胞系中SNAI2的表達(dá) 在 HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8細(xì)胞系中檢測SNAI2蛋白的表達(dá)水平，選取表達(dá)量最高的細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定knock-down SNAI2細(xì)胞系。結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞系SNAI2表達(dá)量高于其他細(xì)胞系，見圖2。

圖1 SNAI2在結(jié)腸癌組織和正常癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平比較

圖2 SNAI2在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平及比較

2.3 五組SNAI2蛋白及mRNA的表達(dá)量比較 Western blot法檢測SNAI2蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，shSNAI2 1#組、shSNAI2 3#組SNAI2蛋白水平下調(diào)顯著，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；RT-PCR 法檢測顯示，shSNAI2 1#組、shSNAI2 3#組SNAI2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3和圖4。

2.4 干擾SNAI2表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖能力的影響 利用MTS方法檢測敲除SNAI2后，SW480細(xì)胞增殖活力的變化。MTS法連續(xù)檢測3 d對照組及knock-down SNAI2穩(wěn)定細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖活力改變，在經(jīng)過慢病毒感染后的穩(wěn)定knock-down SNAI2細(xì)胞中，細(xì)胞在第2天、第3天細(xì)胞增殖活力明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 SW480 knock-down SNAI2細(xì)胞系4組序列的蛋白表達(dá)水平

圖4 SW480 knock-down SNAI2細(xì)胞系4組序列的mRNA表達(dá)水平

圖5 SW480 knock-down SNAI2細(xì)胞系MTS增殖活力的變化

2.5 干擾SNAI2表達(dá)對SW480細(xì)胞遷移能力的影響 對shSNAI2的SW480細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗。在劃痕0 h及24 h兩個時間點進(jìn)行拍照，比較兩組細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，與對照組比較，shSNAI2的SW480細(xì)胞系細(xì)胞遷移能力減弱，見圖6。

圖6 SW480細(xì)胞knock-down SNAI2細(xì)胞系劃痕修復(fù)實驗比較

2.6 干擾SNAI2表達(dá)水平對SW480細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)分子：E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)水平可作為評價腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性特征。利用Western blot檢測E-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。從結(jié)果可以看出，SNAI2下調(diào)后，E-cadherin的表達(dá)顯著上調(diào)，Vimentin表達(dá)降低，見圖7。

圖7 SW480細(xì)胞knock-down SNAI2細(xì)胞系E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)量

3 討 論

SNAI2在人正常機體內(nèi)充當(dāng)調(diào)節(jié)激活轉(zhuǎn)錄的作用，并參與神經(jīng)嵴細(xì)胞的產(chǎn)生和遷移[4]。近年來有許多報道顯示，其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：SNAI2參與抑制緊密連接蛋白(Zo-1)的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[5]。Tripathi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺細(xì)胞中，SNAI2通過結(jié)合E2-BOX蛋白和募集羧基末端結(jié)合蛋白-1(C-terminal-binding protein-1，CTBP1)及組蛋白去乙?；?(histone deacetylase-1，HDAC1)，調(diào)控乳腺癌相關(guān)基因BRCA2的表達(dá)。Wang等[7]和Gu等[8]研究證明，在卵巢癌細(xì)胞中，SNAI2可通過抑制Aurora-A的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞中，SNAI2可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子SOX2及Nanog的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，對TWIST1誘導(dǎo)的EMT及其促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移能力也起到重要作用[10]。

本研究運用熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌樣本及癌旁正常組織中SNAI2的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中SNAI2的mRNA表達(dá)明顯高于正常癌旁組織，提示高表達(dá)的SNAI2在癌癥發(fā)生發(fā)展的過程中可能起一定的作用進(jìn)而我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA SNAI2質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定敲除SNAI2的SW480細(xì)胞系。MTS的結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNAI2表達(dá)下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著降低，表明SNAI2在結(jié)直腸癌中能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。劃痕修復(fù)實驗結(jié)果示SNAI2下調(diào)后，細(xì)胞遷移能力顯著減弱，表明SNAI2在結(jié)直腸癌中能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。經(jīng)進(jìn)一步對shSNAI2 SW480細(xì)胞系的EMT相關(guān)分子E-cadherin及Vimentin進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，E-cadherin是上皮細(xì)胞表達(dá)的一種重要的黏附分子，代表細(xì)胞的黏附強度，惡變過程中E-cadherin的表達(dá)下調(diào)往往意味著細(xì)胞活動性增加，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強；Vimentin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，在細(xì)胞移行、黏附中起關(guān)鍵作用。有許多研究指出Vimentin在惡性腫瘤中表達(dá)增強且與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移正相關(guān)[11]。本實驗中，下調(diào)SNAI2后，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin表達(dá)下調(diào)，提示SNAI2在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)作用。

綜上所述，SNAI2對結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著積極的作用。在接下來的研究中，將進(jìn)一步通過動物體內(nèi)實驗驗證SNAI2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并結(jié)合臨床標(biāo)本，分析臨床資料，闡明SNAI2在結(jié)直腸癌患者的預(yù)后以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的確切作用，SNAI2在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的早期和后期分別扮演著何種角色，確定其可能的靶標(biāo)分子，為結(jié)直腸癌的臨床診治以及診斷提供一個新的分子靶標(biāo)。

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Expression of SNAI2 in colorectal cancer and its effect on cell proliferation and invasion.

ZOU Yong-ping,LI Long-he.Department of Emergency Surgery,Hainan General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo define the expression of SNAI2 in colorectal cancer and its effect on the proliferation and invasion of colorectal cancer cells.MethodsThe expression level of SNAI2 was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)in 50 cases of colorectal cancer tissues and adjacent tissues from Department of Gastrointestinal Surgery in our hospital during Sep.2015 and Apr.2016,and the difference between the two groups was detected by t test.For the SNAI2 gene,four groups of interfering RNA sequences and a group of random insertion sequences without any targeting sites were designed.The sequence of each group was sheared onto lentiviral vector and packaged into lentivirus suspension by two generation packaging system.HT29 was inoculated into 6 orifice plates and labeled as control group,shSNAI2 1#group,shSNAI2 2#group,shSNAI2 3#group,and shSNAI2 4#group.The control group was injected with lentivirus suspension inserted into the random sequence vector.ShSNAI2 1#group,shSNAI2 2#group,shSNAI2 3#group and shSNAI2 4#group were injected with four groups of lentivirus suspension which interfered with RNA sequence.SNAI2 cell line with the highest expression of SW480 was selected for lentivirus infection,and stable knock-down SNAI2 cell line was obtained.In SW480 cells with the high expression of SNAI2,the SNAI2 interference of stable cell lines was established through slow infection.The proliferation ability of cell was detected by thiazole blue(MTS)colorimetry method.The cell invasion ability was detected by scarification test.Western blot was used to detect the expression of E-cadherin and Vimentin.ResultsThe expression of SNAI2 in normal adjacent tissues was less than that in colorectal cancer tissues compared with normal adjacent tissues,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The expression of cell adhesion molecule E-cadherin increased compared with the control group,while the expression of cytoskeletal protein and Vimentin decreased,both with statistically significant difference(P＜0.05).In

2014年海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(編號：ZDXM2014066)

鄒永平。E-mail：strong007@qq.com the SW480 siSNAI2 cell line,compared with the control group,the cell invasion and proliferation ability decreased significantly(P＜0.05).ConclusionSNAI2 is highly expressed in human colorectal cancer tissue,and it could promote the proliferation,invasion and migration of colorectal cancer cells in vivo.

SNAI2;Colorectal cancer;Cell proliferation;Cell invasion

R735

A

1003—6350（2017）23—3789—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.002

2017-07-07)