張 進(jìn), 王星懿, 范 里, 譚文松

(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定性

張 進(jìn), 王星懿, 范 里, 譚文松

(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

實(shí)現(xiàn)了中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞高密度培養(yǎng)過(guò)程的穩(wěn)定。以表達(dá)IgG抗體的流加培養(yǎng)過(guò)程為研究對(duì)象,首先通過(guò)“魚骨圖”分析、FMEA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估剖析潛在的關(guān)鍵控制參數(shù),其次通過(guò)DOE (實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))方法確定和優(yōu)化關(guān)鍵控制參數(shù)及其范圍。結(jié)果表明,在99個(gè)培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)中搜尋并確認(rèn)了8個(gè)關(guān)鍵控制參數(shù)及其范圍。經(jīng)優(yōu)化控制后,表達(dá)IgG抗體的流加培養(yǎng)過(guò)程批次間抗體產(chǎn)量差異從200%下降至10%?；赒bD理論,能快速有效地實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定性,有利于保證抗體藥物生產(chǎn)的安全性以及保障企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù); QbD; FMEA; 設(shè)計(jì)范圍; 過(guò)程控制

抗體藥物在乙肝、腫瘤、自身免疫病、病毒感染病等疾病的治療中發(fā)揮重要作用,是生物醫(yī)藥的重要組成部分[1-2]。目前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是抗體藥物生產(chǎn)的主要手段[3],但是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中涉及的參數(shù)多達(dá)100多種且大部分隨時(shí)間變動(dòng)[4-16],如溫度、pH、溶解二氧化碳、溶解氧、滲透壓、乳酸、氨等不同程度地影響細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、抗體產(chǎn)量及質(zhì)量,使得細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程十分復(fù)雜,很難進(jìn)行控制。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的不穩(wěn)定,一方面使得不同批次細(xì)胞培養(yǎng)的最終抗體產(chǎn)量和質(zhì)量不一致,影響抗體藥物的安全性;另一方面,增加細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程失效的可能性,產(chǎn)生資源浪費(fèi),降低企業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。

為了控制藥物生產(chǎn)過(guò)程的穩(wěn)定,在2004年“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”(QbD)理念被提出,并普遍應(yīng)用于小分子藥物生產(chǎn)中,但在生物制藥中應(yīng)用較少[17]。QbD理念提倡在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中構(gòu)建產(chǎn)品質(zhì)量,這一觀念促使人們探究原料和過(guò)程參數(shù)對(duì)藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)的影響,通過(guò)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行控制以達(dá)到穩(wěn)定的目的[17]。在QbD理念的實(shí)施過(guò)程中,“設(shè)計(jì)空間”是一項(xiàng)重要的工具,它是指輸入變量和過(guò)程參數(shù)多元結(jié)合和相互作用,輸入變量和過(guò)程參數(shù)在該設(shè)計(jì)空間內(nèi)變動(dòng)不會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量造成影響[18]?；赒bD理念,Harms等[19]對(duì)畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的設(shè)計(jì)空間進(jìn)行研究,結(jié)果表明該發(fā)酵過(guò)程較為穩(wěn)定,過(guò)程中的參數(shù)都不顯著影響產(chǎn)物質(zhì)量;Amadeo等[20]對(duì)治療性重組蛋白下游純化最穩(wěn)定、最適的工作條件進(jìn)行了探究;Cook等[21]對(duì)單克隆抗體純化過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行鑒定并探究其設(shè)計(jì)空間;Abu-Absi等[18]對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中影響抗體質(zhì)量的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)的設(shè)計(jì)空間進(jìn)行系統(tǒng)地研究。但QbD理念在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程穩(wěn)定性方面的應(yīng)用不廣泛,目前鮮有針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)物產(chǎn)量穩(wěn)定性的研究。

本文以表達(dá)IgG抗體的流加培養(yǎng)過(guò)程為研究對(duì)象,為實(shí)現(xiàn)不同批次細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定,借鑒QbD理念對(duì)于藥物產(chǎn)品“設(shè)計(jì)空間”的研究,首先采用“魚骨圖”分析法羅列可能影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的因素、失效模型和效應(yīng)分析(FMEA)方法對(duì)上述因素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估確定其中可能的關(guān)鍵因素,其次通過(guò)DOE (實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))方法確定關(guān)鍵因素并優(yōu)化其控制范圍,最后通過(guò)對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行控制以實(shí)現(xiàn)流加培養(yǎng)過(guò)程的抗體產(chǎn)量穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO),由浙江海正藥業(yè)有限公司提供。該細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物為IgG抗體。

細(xì)胞傳代所用的培養(yǎng)基為商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基Mab-Works Medium C,并添加NaHCO3(1.83 g/L),4-羥基哌嗪乙磺酸(HEPES) (3.57 g/L)?；A(chǔ)培養(yǎng)基及流加培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室自行開(kāi)發(fā)。配制培養(yǎng)基所用的試劑均采購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 技術(shù)路線圖 本文的技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 技術(shù)路線圖Fig.1 Technology route map

1.2.2 “魚骨圖”分析法 “魚骨圖”分析法是一種羅列系統(tǒng)中存在的工藝參數(shù)的方法,它將所關(guān)注的目標(biāo)(VOC)標(biāo)在魚頭外,通過(guò)“頭腦風(fēng)暴”形式,從“人、機(jī)、料、法、環(huán)”等方面分析,以“魚刺”的形式將系統(tǒng)所涉及的工藝參數(shù)羅列在兩側(cè)。

1.2.3 FMEA方法 由于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所涉及的參數(shù)眾多,若將所有工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)將耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力。采用FMEA方法可以評(píng)估工藝參數(shù)影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn),從而對(duì)過(guò)程進(jìn)行前瞻性預(yù)測(cè)[22],以便我們挑選風(fēng)險(xiǎn)較大的工藝參數(shù)進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化工作。FMEA是基于已有數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)報(bào)道或者以往經(jīng)驗(yàn)對(duì)該工藝參數(shù)的失效模式可能產(chǎn)生的后果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,從嚴(yán)重性(S)、發(fā)生頻率(O)和易檢測(cè)度(D) 3個(gè)方面進(jìn)行打分[23]。打分人員應(yīng)由熟悉細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的專業(yè)人士構(gòu)成,不少于10人。將三者平均值相乘,計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先系數(shù)(RPN)值,RPN值越高表示失敗的風(fēng)險(xiǎn)越高,該因素越有可能對(duì)過(guò)程產(chǎn)生影響,在后續(xù)的研究中應(yīng)優(yōu)先考慮[23]。

1.2.4 DOE優(yōu)化設(shè)計(jì) 在運(yùn)用FMEA方法確定影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性可能因素的優(yōu)先次序后,采用DOE的方法探究關(guān)鍵參數(shù)、非關(guān)鍵參數(shù)以及關(guān)鍵參數(shù)的控制措施。在本研究中使用的DOE方法包括Plackett-Burman設(shè)計(jì)和單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在本研究中,對(duì)參數(shù)的分類是基于FMEA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和DOE實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩方面的考量,如果參數(shù)經(jīng)FMEA分析后RPN值占前10%,并且經(jīng)過(guò)DOE驗(yàn)證顯著影響抗體產(chǎn)量,則該參數(shù)定義為影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的關(guān)鍵參數(shù)[23]。

1.2.5 分析方法 CHO細(xì)胞計(jì)數(shù)采用臺(tái)盼藍(lán)染色法?？贵w產(chǎn)量檢測(cè)采用高效液相色譜法,用積分的形式獲得峰面積,并與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行對(duì)比,求得樣品的濃度。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程穩(wěn)定性定義 細(xì)胞過(guò)程穩(wěn)定定義為:采用相同的工藝條件進(jìn)行至少3個(gè)批次的細(xì)胞培養(yǎng),抗體產(chǎn)量質(zhì)量濃度的最大差異不超過(guò)10%。用公式(1)和(2)表示,當(dāng)Δtiter≤10%時(shí),可認(rèn)為過(guò)程達(dá)到穩(wěn)定。

其中ρmax為抗體產(chǎn)量質(zhì)量濃度的最大值,ρmin為抗體質(zhì)量濃度的最小值,單位為g/L。Relative titer是抗體產(chǎn)量質(zhì)量濃度相對(duì)比值,它是細(xì)胞培養(yǎng)某一批次的抗體產(chǎn)量質(zhì)量濃度與所有批次中抗體產(chǎn)量質(zhì)量濃度最小值的比值,為方便敘述,統(tǒng)稱為相對(duì)產(chǎn)量。Max (Relative titer)是細(xì)胞培養(yǎng)所有批次中抗體產(chǎn)量質(zhì)量濃度的最大值與最小值的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體過(guò)程中產(chǎn)量不穩(wěn)定現(xiàn)象的描述

采用相同的工藝條件,對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行5批流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng),抗體相對(duì)產(chǎn)量如圖2所示。由圖2可知,抗體產(chǎn)量最高和最低分別為C4和 C2批次,兩個(gè)批次抗體產(chǎn)量差異Δtiter為200%,遠(yuǎn)大于10%,說(shuō)明在原有的培養(yǎng)工藝條件下,抗體產(chǎn)量不穩(wěn)定。

圖2 原工藝條件下5個(gè)批次細(xì)胞培養(yǎng)的抗體產(chǎn)量相對(duì)比值Fig.2 Relative antibody titer of five batches cell culture under the condition of original process

2.2 采用“魚骨圖”分析法剖析CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程

采用“魚骨圖”分析法剖析CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程可能影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的因素,結(jié)果如圖3所示。整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程可分為細(xì)胞凍存、細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞擴(kuò)培以及細(xì)胞培養(yǎng)4個(gè)步驟,從“人、機(jī)、料、法、環(huán)”5個(gè)方面歸納總結(jié)每個(gè)步驟的輸入?yún)?shù),經(jīng)分析得到可能影響抗體產(chǎn)量的因素有99個(gè),在不同批次的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,這些因素難以控制一致,使得細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中難以達(dá)到抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性。

2.3 采用FMEA方法分析影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的潛在關(guān)鍵因素

將“魚骨圖”分析出的可能影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的因素轉(zhuǎn)化成調(diào)查問(wèn)卷,進(jìn)行FMEA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。首先,對(duì)調(diào)查問(wèn)卷中的因素從嚴(yán)重性(S)、發(fā)生率(O)和檢測(cè)率(D) 3個(gè)方面打分,其中S是該因素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生影響的程度,將其分值設(shè)置為1～5分,最低分1分表示幾乎不對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生影響,最高分5分表示導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程失敗;O是指該因素在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)的頻率,出現(xiàn)次數(shù)高的因素相應(yīng)的分值較高;D是指在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)控制該因素被檢測(cè)出來(lái)的可能性,被檢測(cè)出的可能性小相應(yīng)的分值高。其次,將各因素的S、O、D的分值相乘,計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先系數(shù)RPN值。FMEA分析后的部分結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體過(guò)程魚骨圖Fig.3 Fishbone diagram of CHO cell culture producing antibody process

ScoreS O D 1InfluenceoncellcultureprocesscanbeignoredDonothappenAlmostcertainlytobecheckedout2InfluenceoncellcultureprocessissmallRarelyoccurHighpossibilitytobecheckedout3InfluenceoncellcultureprocessismediumSometimesoccurMediumpossibilitytobecheckedout4InfluenceoncellcultureprocessislargeOftenoccurSmallpossibilitytobecheckedout5LeadtothefailureofcellcultureprocessAlwaysoccurNopossibilitytobecheckedout

表2 CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程部分FMEA分析表

最后,在對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行FMEA分析后,選定RPN值最高的前5個(gè)因素作為潛在的關(guān)鍵因素,進(jìn)行下一步的研究。這5個(gè)因素分別為種子細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值、接種方式、取樣體積、N-1代種子細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基是否更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.4 通過(guò)DOE方法確定影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素及控制范圍

對(duì)選定的5個(gè)潛在的關(guān)鍵因素進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素設(shè)置一個(gè)高水平和一個(gè)低水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。圖4(a)所示為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,從圖中可知這12組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況差異較大,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在第6 d達(dá)到生長(zhǎng)的最大密度,最高為12.5×106cells/mL,而最低為6×106cells/mL,相差約1倍。圖4(b)所示為抗體相對(duì)產(chǎn)量,這12組實(shí)驗(yàn)抗體產(chǎn)量最高的為第7組,最低的為第10組,相差12%。

將抗體產(chǎn)量作為響應(yīng)值,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,如表3所示。其中AdjSS為調(diào)整后的離散差平方和;AdjMS為調(diào)整后的平均方差和,是調(diào)整后的離散差平方和與自由度的比值;F值是方差分析中的一個(gè)指標(biāo),是組間和組內(nèi)的離散差平方和與自由度的比值,F值越大,P值越小,表示結(jié)果越可靠。當(dāng)P<0.05時(shí),說(shuō)明因素為顯著性影響因素。實(shí)驗(yàn)表明:種子細(xì)胞比生長(zhǎng)速率,N-1代種子細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基是否更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH,取樣體積這4個(gè)因素是抗體產(chǎn)量的顯著性影響因素。結(jié)合對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程關(guān)鍵參數(shù)的定義,這4個(gè)因素經(jīng)FMEA分析 RPN值占前10%,且經(jīng)過(guò)DOE驗(yàn)證顯著影響抗體產(chǎn)量,是影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。在不同實(shí)驗(yàn)批次中,若這些因素發(fā)生波動(dòng),且波動(dòng)超出控制范圍,將引起抗體產(chǎn)量的不穩(wěn)定。

采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)上述4個(gè)因素的控制范圍進(jìn)行探究,在該控制范圍內(nèi)變動(dòng),不對(duì)最終抗體產(chǎn)量產(chǎn)生影響。以N-1代種子細(xì)胞傳代時(shí)原傳代培養(yǎng)基與新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比為例,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(a)以及抗體相對(duì)產(chǎn)量比值(b)Fig.4 Cell growth curve (a) and antibody relative titer (b)

DegreeoffreedomAdjSSAdjMSFPModel50．0160490．00321011．510．005Seedcellspecificgrowthrate10．0050110．00501111．510．005PassagemediumofN-1seedcellswhethertobereplacedbybasalmedium10．0040670．00406714．590．009InitialpHvalueofbasalmedium10．0029370．00293710．540．018Inoculationmethod10．0000950．0000950．340．580Samplevolume10．0039380．00393814．130．009Error60．0016730．000279Total110．017721

圖5 在N-1代種子細(xì)胞傳代時(shí)更換不同體積比培養(yǎng)基的條件下細(xì)胞生長(zhǎng)(a)、產(chǎn)物表達(dá)情況(b)的比較Fig.5 Growth (a) and productivity (b) comparison under different replacement ratios of generation medium of N-1 seed cells

從細(xì)胞生長(zhǎng)可以看出,N-1代細(xì)胞傳代仍采用原傳代培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)可持續(xù)12 d,最大細(xì)胞密度在第6 d達(dá)到,約為9×106cells/mL;N-1代細(xì)胞傳代時(shí)原傳代培養(yǎng)基與新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積比為1∶1,細(xì)胞培養(yǎng)可維持10 d,最大細(xì)胞密度在第6 d達(dá)到,平均為9.3×106cells/mL;N-1代傳代時(shí)原傳代培養(yǎng)基與新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比為1∶3時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)可維持10 d,最大細(xì)胞密度在第4 d達(dá)到,約為8.7×106cells/mL。雖然最大活細(xì)胞密度差異不大,但N-1代細(xì)胞傳代采用原種子培養(yǎng)基,細(xì)胞在第6 d之后,活細(xì)胞密度下降較慢。

最終抗體產(chǎn)量在N-1代傳代培養(yǎng)基不更換的條件下較高,并且該條件與1∶1更換和1∶3更換的條件相比,抗體產(chǎn)量有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果表明,N-1代種子細(xì)胞傳代培養(yǎng)基不更換時(shí),有利于抗體產(chǎn)生,若由于工藝條件的設(shè)置需要更換N-1代傳代培養(yǎng)基時(shí),原傳代培養(yǎng)基與加入新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基的比例維持在1∶1～1∶3時(shí),不影響抗體產(chǎn)量。

本文對(duì)其他影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素及其控制范圍也進(jìn)行了探討,匯總?cè)绫?所示。

表4 影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素及其控制范圍

2.5 生產(chǎn)工藝改進(jìn)及新工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證

對(duì)上述影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素進(jìn)行控制,驗(yàn)證新工藝是否達(dá)到穩(wěn)定。對(duì)關(guān)鍵因素的控制條件為:N-1代種子細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基不更換為接種時(shí)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種時(shí)種子細(xì)胞密度為1.5×106～1.8×106cells/mL,細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率在0.6～0.7 d-1之間,基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH在7.0～7.2,采用離心接種的方式,使細(xì)胞初始接種密度為0.8×106～1.2×106cells/mL,離心后細(xì)胞放置時(shí)間小于10 min,取樣體積為400 μL。實(shí)驗(yàn)共4個(gè)批次,每個(gè)批次設(shè)置3個(gè)平行,最終抗體產(chǎn)量相對(duì)比值如圖6所示。

由圖6可知在新工藝條件下進(jìn)行4個(gè)批次的細(xì)胞培養(yǎng),抗體產(chǎn)量最高和最低分別為C2和C3批次,抗體產(chǎn)量的差異Δtiter為10%,基本滿足對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程穩(wěn)定性的要求。與原工藝條件相比,抗體產(chǎn)量的差異從200%下降至10%,說(shuō)明在對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的關(guān)鍵因素進(jìn)行控制之后,抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性提高。

圖6 新工藝條件下4個(gè)批次細(xì)胞培養(yǎng)的抗體相對(duì)產(chǎn)量Fig.6 Relative antibody titer of four batches cell culture under the condition of new process

3 討 論

CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的過(guò)程十分復(fù)雜,其中影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的因素眾多,利用“魚骨圖”分析能夠有效地對(duì)過(guò)程進(jìn)行拆分描述,并對(duì)其中可能影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的因素從“人、機(jī)、料、法、環(huán)”5個(gè)方面進(jìn)行歸納總結(jié),便于發(fā)現(xiàn)影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性的根本原因。在以往的研究中,“魚骨圖”常用于質(zhì)量、生產(chǎn)管理、項(xiàng)目管理等領(lǐng)域問(wèn)題的分析,作為一種定性分析工具,能夠幫助人們對(duì)問(wèn)題產(chǎn)生的原因進(jìn)行系統(tǒng)地評(píng)估[24]。趙靜等[25]運(yùn)用“魚骨圖”對(duì)影響我國(guó)奶源質(zhì)量安全的主要因素及存在的問(wèn)題進(jìn)行分析,提出了針對(duì)原料奶質(zhì)量控制的建議及對(duì)策,具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。Volchek等[26]運(yùn)用“魚骨圖”方法對(duì)低質(zhì)量的醫(yī)療衛(wèi)生造成較高的資源消耗的原因以及組成部分進(jìn)行了詳細(xì)地研究,對(duì)于這一問(wèn)題的解決提供了一定的思路。

FMEA分析是生產(chǎn)過(guò)程中一項(xiàng)重要的工具,是對(duì)過(guò)程中存在的故障模式及其可能產(chǎn)生的影響進(jìn)行分析,通過(guò)采取事前預(yù)防的措施,對(duì)過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)或控制,目前廣泛應(yīng)用于軍事、建筑安裝工程、船舶與海洋工程、醫(yī)療衛(wèi)生、軟件工程及信息系統(tǒng)開(kāi)發(fā)、核工業(yè)與食品安全等領(lǐng)域[27]。在過(guò)程定性研究中,常利用FMEA對(duì)過(guò)程的操作參數(shù)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,確定參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的優(yōu)先次序。本研究中,通過(guò)“魚骨圖”分析出細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的可能輸入?yún)?shù)有99個(gè),如果對(duì)這些參數(shù)均設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,將消耗大量的人力、物力、財(cái)力。通過(guò)FMEA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,排除可能性較小的因素,選取RPN值較高的因素進(jìn)行DOE探究,實(shí)現(xiàn)問(wèn)題的簡(jiǎn)化。

通過(guò)DOE驗(yàn)證得出影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的因素,包括N-1代細(xì)胞傳代的傳代培養(yǎng)基是否更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH、取樣體積、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的存放時(shí)間、細(xì)胞離心后放置時(shí)間、細(xì)胞初始接種密度、種子細(xì)胞密度等。文獻(xiàn)[28]報(bào)道在37 ℃時(shí),隨著CHO細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的提高,r蛋白的比生產(chǎn)速率逐漸提高,比生長(zhǎng)速率對(duì)產(chǎn)物表達(dá)有較大影響,這與本研究的結(jié)果一致;文獻(xiàn)[10]報(bào)道pH是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重要的測(cè)量及控制參數(shù),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)物表達(dá)有重要作用,本研究表明基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH對(duì)最終抗體表達(dá)影響較大;培養(yǎng)基中的谷氨酰胺是細(xì)胞生長(zhǎng)重要的碳源、氮源及能源物質(zhì),可通過(guò)能量代謝為細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成提供30%～65%的能量,維生素等物質(zhì)是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的重要物質(zhì)[29],但它們易分解?；A(chǔ)培養(yǎng)基存放時(shí)間較長(zhǎng)可能造成上述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺失,影響細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物表達(dá);Abu-Absi等[18]在研究生產(chǎn)單抗的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的設(shè)計(jì)空間時(shí),發(fā)現(xiàn)初始接種密度是影響抗體產(chǎn)量的關(guān)鍵因素,Padawer等[30]發(fā)現(xiàn)初始接種密度高的條件下,抗體產(chǎn)量較高,但是細(xì)胞凋亡較快,這些研究表明細(xì)胞初始接種密度對(duì)抗體產(chǎn)量影響較大;Rodriguez等[31]報(bào)道種子細(xì)胞密度很小的差異就會(huì)引起細(xì)胞比生長(zhǎng)速率產(chǎn)生較大的變化,種子細(xì)胞密度可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)而影響抗體表達(dá)。

目前,鮮有針對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體過(guò)程產(chǎn)量穩(wěn)定的報(bào)道,而保證細(xì)胞培養(yǎng)不同批次間抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定,不僅能夠保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性與可重復(fù)性,而且能夠滿足抗體生產(chǎn)過(guò)程對(duì)工藝穩(wěn)定性的要求,對(duì)于保證藥品生產(chǎn)的安全性及企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要作用。本文基于QbD理念,首先通過(guò)“魚骨圖”剖析CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程,其次通過(guò)FMEA對(duì)可能影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的因素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,選取RPN值高的因素作為潛在的關(guān)鍵影響因素,然后采用DOE方法,確定其中的關(guān)鍵影響因素及其控制措施,最終在99個(gè)可能影響抗體產(chǎn)量穩(wěn)定的因素中,篩選并得到了8個(gè)關(guān)鍵因素及控制范圍,經(jīng)過(guò)優(yōu)化控制后批次間抗體產(chǎn)量的差異從200%縮小至10%,抗體產(chǎn)量穩(wěn)定性大大提高。本研究填補(bǔ)了CHO細(xì)胞培養(yǎng)在抗體產(chǎn)量穩(wěn)定方面研究的空白,為過(guò)程穩(wěn)定性的研究提供新的思路,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[1] YAMADA T.Therapeutic monoclonal antibodies[J].The Keio Journal of Medicine,2010,60(2):37-46.

[2] ECKER D M,JONES S D,LEVINE H L.The therapeutic monoclonal antibody market[J].Mabs,2015,7(1):9-14.

[3] KIM J Y,KIM Y G,LEE G M.CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins:Current state and further potential[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93(3):917-930.

[4] LE H,KABBUR S,POLLASTRINI L,etal.Multivariate analysis of cell culture bioprocess data-lactate consumption as process indicator[J].Journal of Biotechnology,2012,162(2):210-223.

[5] MASTERTON R J,SMALES C M.The impact of process temperature on mammalian cell lines and the implications for the production of recombinant proteins in CHO cells[J].Pharmaceutical Bioprocessing,2014,2(1):49-61.

[6] WAYTE J,BORASTON R,BLAND H,etal.pH-Effects on growth and productivity of cell lines producing monoclonal antibodies:Control in large-scale fermenters[J].Genetic Engineer and Biotechnologist,1997,17(2-3):125-132.

[7] SCHMID G,BLANCH H W,WILKE C R.Hybridoma growth,metabolism,and product formation in hepes-buffered medium:II.Effect of pH[J].Biotechnology Letters,1990,12(9):633-638.

[8] SEO J S,KIM Y J,CHO J M,etal.Effect of culture pH on recombinant antibody production by a new human cell line,F2N78,grown in suspension at 33.0 ℃ and 37.0 ℃[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(12):5283-5291.

[9] TRUMMER E,FAULAND K,SEIDINGER S,etal.Process parameter shifting:Part I.Effect of DOT,pH,and temperature on the performance of Epo-Fc expressing CHO cells cultivated in controlled batch bioreactors[J].Biotechnology and Bioengineering,2006,94(6):1033-1044.

[10] LI F,VIJAYASANKARAN N,SHEN A,etal.Cell culture processes for monoclonal antibody production[J].Mabs,2010,2(5):466-479.

[11] KUNKEL J P,JAN D C H,JAMIESON J C,etal.Dissolved oxygen concentration in serum-free continuous culture affectsN-linked glycosylation of a monoclonal antibody[J].Journal of Biotechnology,1998,62(1):55-71.

[12] DEZENGOTITA V M,SCHMELZER A E,MILLER W M.Characterization of hybridoma cell responses to elevated pCO2and osmolality:Intracellular pH,cell size,apoptosis,and metabolism[J].Biotechnology and Bioengineering,2002,77(4):369-380.

[13] ZHU M M,GOYAL A,RANK D L,etal.Effects of elevated pCO2and osmolality on growth of CHO cells and production of antibody-fusion protein B1:A case study[J].Biotechnology Progress,2005,21(1):70-77.

[14] OZTURK S S,PALSSON B O.Effect of medium osmolarity on hybridoma growth,metabolism,and antibody production[J].Biotechnology and Bioengineering,1991,37(10):989-993.

[15] LAO M S,TOTH D.Effects of ammonium and lactate on growth and metabolism of a recombinant Chinese hamster ovary cell culture[J].Biotechnology Progress,1997,13(5):688-691.

[16] LI J,WONG C L,VIJAYASANKARAN N,etal.Feeding lactate for CHO cell culture processes:Impact on culture metabolism and performance[J].Biotechnology and Bioengineering,2012,109(5):1173-1186.

[17] RATHORE A S,WINKLE H.Quality by design for biopharmaceuticals[J].Nature Biotechnology,2009,27(1):26-34.

[18] ABU-ABSI S F,YANG L Y,THOMPSON P,etal.Defining process design space for monoclonal antibody cell culture[J].Biotechnology and Bioengineering,2010,106(6):894-905.

[19] HARMS J,WANG X,KIM T,etal.Defining process design space for biotech products:Case study of pichia pastoris fermentation[J].Biotechnology Progress,2008,24(3):655-662.

[20] AMADEO I,MAURO L V,ORTI E,etal.Determination of robustness and optimal work conditions for a purification process of a therapeutic recombinant protein using response surface methodology[J].Biotechnology Progress,2011,27(3):724-732.

[21] COOK S,PATTON K A,BAZEMORE L.Quality by design in the CMO environment[J].Biopharm International,2007,20(12):28.

[22] 朱愛(ài)勇,常旺,劉麗娟,等.FMEA與RCA在食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用[J].解放軍醫(yī)院管理雜志,2013,20(4):372-374.

[23] MARASCO D M,GAO J,GRIFFITHS K,etal.Development and characterization of a cell culture manufacturing process using quality by design (QbD) principles[J].Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,2013,139(22):79-86.

[24] CIOCOIU C N,ILIE G.Application of fishbone diagram to determine the risk of an event with multiple causes[J].Knowledge Management Research and Practice,2010,2(1):1-20.

[25] 趙靜,張耀荔,陳靜.原料奶質(zhì)量的控制及其影響因素研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(5):1972-1974.

[26] VOLCHEK V.Influence of care quality on the consumption of health resources[J].Bmc Research Notes,2015,7(1):1-7.

[27] 戴云徽,韓之俊,朱海榮.故障模式及影響分析(FMEA)研究進(jìn)展[J].中國(guó)質(zhì)量,2007(10):23-26.

[28] VERGARA M,BECERRA S,BERRIOS J,etal.Differential effect of culture temperature and specific growth rate on CHO cell behavior in chemostat culture[J].Plos One,2014,9(4):e93865.

[29] 張?jiān)d.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

[30] PADAWER I,LING W L W,BAI Y.Case study:An accelerated 8-day monoclonal antibody production process based on high seeding densities[J].Biotechnology Progress,2013,29(3):829-832.

[31] RODRIGUEZ E N,PEREZ M,CASANOVA P,etal.Effect of Seed Cell Density on Specific Growth Rate Using CHO Cells as Model[M].Dordrecht Netherlands:Springer Market,2001:434-437.

TiterStabilityofAntibodyProducedbyCHOCellCulture

ZHANGJin,WANGXing-yi,FANLi,TANWen-song

(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,SchoolofBioengineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)

The stability of Chinese hamster ovary (CHO) cells during high density cultivation process was realized.The fed-batch culture process expressing IgG antibody was studied based on QbD theory.Firstly,potential critical control parameters were dissected by using “fishbone diagram” analysis and Failure Mode and Effect Analysis (FMEA).Secondly,key control parameters were determined and their design ranges were optimized by DOE (Design of experiment) method.Results show that eight key control parameters and their scope were searched and confirmed within 99 cell culture process parameters.Through optimization and control,difference of antibody titer between batches of fed-batch culture process decreases from 200% to 10%.Based on QbD theory,it can rapidly and effectively achieve process stability of antibody production by CHO cell culture which is benefit for the safety of antibody drug production and the economic benefits of enterprises.

cell culture technology; QbD; FMEA; design space; process control

1006-3080(2017)06-0806-09

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.06.009

2017-05-04

張 進(jìn)(1992-),女,河南人,碩士生,主要從事動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的研究。E-mail:zhangjinecust@163.com

譚文松,E-mail:wstan@ecust.edu.cn

Q813.1+1

A