李天芝 ，于新友 ，沈志強(qiáng) ，，王金良

（1．山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

基于便攜式熒光定量PCR儀的豬瘟病毒現(xiàn)場檢測方法的建立及應(yīng)用

李天芝1，于新友1，沈志強(qiáng)1，2，王金良2

（1．山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

為建立豬瘟病毒疫苗株和強(qiáng)毒株一步法雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測方法。研究參照GenBank中豬瘟病毒疫苗株以及強(qiáng)毒株特異性基因序列，設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan-MGB探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了同時(shí)檢測豬瘟病毒疫苗株和強(qiáng)毒株的雙重?zé)晒釸T-PCR方法，并驗(yàn)證該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性。本試驗(yàn)建立的TaqMan-MGB一步法雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法可對豬瘟病毒疫苗株和野毒株進(jìn)行快速鑒別診斷，為豬瘟的凈化奠定了基礎(chǔ)。

豬瘟病毒；疫苗株；強(qiáng)毒株；TaqMan-MGB；一步法；雙重?zé)晒釸T-PCR

豬瘟(CSF)又稱爛腸瘟，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種重要的急性、熱性、高度接觸、致死性傳染病。臨床上主要以高熱稽留、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)和高死亡率為主要特征。豬瘟在世界上許多養(yǎng)豬國家都有不同程度的流行，即能水平傳播又能垂直傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為A類法定傳染病之一[2]，我國也將其列為一類動(dòng)物疾病。

近年來，豬瘟在我國的流行特點(diǎn)發(fā)生改變，以隱性感染和亞病毒感染為主，臨床表現(xiàn)形式多樣，即有散發(fā)，又有區(qū)域性暴發(fā)，既有高死亡率的急性癥狀，又有持續(xù)感染的癥狀溫和的慢性病例，出現(xiàn)了所謂的“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”[3]，臨床與病理解剖上不典型[4]，同時(shí)存在著與其他病混合感染的狀況，給獸醫(yī)對豬瘟的臨床診斷工作帶來了很大的困難。我國研制的豬瘟兔化弱毒株(hog cholera lapinized virus，HCLV) 是世界公認(rèn)最好的豬瘟疫苗[5]，也是我國唯一一株經(jīng)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)的弱毒疫苗，能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，安全性好，免疫豬可抵抗所有品系的豬瘟強(qiáng)毒株的攻擊，HCLV在我國的大規(guī)模應(yīng)用，對控制豬瘟起到了非常重要的作用，但HCLV能在已接種的豬體內(nèi)持續(xù)存在一段時(shí)間，這會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)室對豬瘟強(qiáng)毒株的檢測，造成未感染免疫豬被誤殺的可能。這些都不利于豬瘟的凈化。需要建立可以準(zhǔn)確區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒和疫苗毒的敏感、特異的鑒別診斷方法。

CSFV是單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.3 kb，包括5`非編碼區(qū)（5`UTR）、3`非編碼區(qū)3`UTR、中間是一個(gè)大的ORF，編碼多聚前蛋白，多聚前蛋白可裂解為12種蛋白，包括8種非結(jié)構(gòu)蛋白和4種結(jié)構(gòu)蛋白，其中，5`UTR、3`UTR基因序列比較保守[6]。豬瘟病毒基因組5`UTR長374 bp， 3`-UTR長242 bp，HCLV與豬瘟強(qiáng)毒株3`UTR的區(qū)別是HCLV基因組3`UTR有12個(gè)堿基(CTTTTTTCTTTT)的插入，HCLV與豬瘟強(qiáng)毒株5`UTR的區(qū)別是豬瘟強(qiáng)毒株5`UTR 122位點(diǎn)存在一個(gè)堿基A缺失，137位點(diǎn)一個(gè)堿基A突變?yōu)閴A基G。本研究根據(jù)豬瘟病毒5`UTR基因組特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對檢測豬瘟強(qiáng)毒株的引物及探針，根據(jù)豬瘟病毒3`UTR基因組特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對檢測HCLV的引物及探針，通過優(yōu)化熒光RT-PCR檢測條件，建立了能區(qū)分豬瘟病毒疫苗株與強(qiáng)毒株的TaqMan-MGB一步法雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，為豬瘟的早期快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查、防控和凈化工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)、豬瘟病毒石門強(qiáng)毒株(Shimen)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬乙型腦炎病毒（JEV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存，臨床檢測病料為2016年10月—2017年9月采自山東省各地豬場臨床診斷為CSFV感染豬的扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟等。

1.2 試劑和試劑盒

Taq DNA聚 合 酶、M-MLV反 轉(zhuǎn) 錄 酶、RNasin、dNTPs、pMD18-T載 體、DL2000 Marker、PrimeScript? One Step RTPCR Kit Ver.2等購自寶生物工程(大連)有限公司，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 引物和探針

應(yīng)用DNAStar軟件對GenBank中收錄的CSFV基因組序列進(jìn)行比對分析，應(yīng)用生物學(xué)軟件分別設(shè)計(jì)2對引物及相應(yīng)TaqMan-MGB探針，其中1對引物及相應(yīng)的探針擴(kuò)增豬瘟兔化弱毒疫苗毒株，引物序列為CSFV-F1：5′-GGTAACCCGGGATCTGAAC-3′和CSFV-R1：5′-ACCAGTTCTTACTCATTCAA-3′，特異性探針為P1：5′- FAM-ACACTACTTTTCTTTTTTCTTTTTTATTMGB-3′，另1對引物及相應(yīng)的探針擴(kuò)增豬瘟強(qiáng)毒株，引物序列為CSFV-F1：5′-CGACGGCCGAACTGGGCTA-3′和 CSFV-R1：5′ -TCGAACTACTGACGACTGTCCTG-3′，特異性探針為P2：5′- HEX-CAAACGGAGGGACTAGCCG-MGB-3′。

1.4 病毒核酸的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株的RNA，作為模板。

1.5 熒光RT-PCR檢測方法的建立和優(yōu)化

按 照 PrimeScript? OneStep RTPCR Kit Ver.2說明配置反應(yīng)體系，體系 總 體 積 為 25μL：2×1 Step Buffer 12.5μL，CSFV-F1、CSFV-R1和 P1、CSFV-F2、CSFV-R2和 P2各 若 干，PrimeScript? 1 step Enzyme Mix 1.0μL，模板RNA 2μL，其余用RNase free dH2O補(bǔ)齊。離心數(shù)秒后，放入MyGo mini熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，對熒光RT-PCR的程序進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對反應(yīng)體系中的引物和探針濃度進(jìn)行篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強(qiáng)度增加值。

1.6 熒光RT-PCR的靈敏度

參照文獻(xiàn)[7]測定HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株TCID50。將病毒培養(yǎng)液進(jìn)行10倍系列稀釋，各取100μL病毒稀釋液，經(jīng)AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒抽提核酸后，進(jìn)行熒光RT-PCR檢測，重復(fù)3次，確定最低的檢測靈敏度。

1.7 熒光RT-PCR的特異性、重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立起的熒光RT-PCR法分別對HCLV、CSFV石門強(qiáng)毒株、BVDV、PRRSV、JEV、PPV、PRV、PCV2進(jìn)行檢測，驗(yàn)證其特異性。對HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株的細(xì)胞培養(yǎng)液分別10倍系列稀釋，每個(gè)梯度同時(shí)重復(fù)檢測3次后，記錄CT值，然后分別計(jì)算對HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株組內(nèi)檢測的變異系數(shù)。

1.8 臨床樣品檢測

用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR法對從山東省各地收集的臨床疑似病料165份進(jìn)行CSFV檢測，同時(shí)用常規(guī)RT-PCR法及單重?zé)晒舛縍T-PCR法進(jìn)行檢測，并比較三者檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 熒光RT–PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)化結(jié)果表明，在25μL反應(yīng)體系中，擴(kuò)增效果最佳的引物和探針濃度分別為：1μL CSFV-F1(15μmol/L)，1.2μLCSFV-R1(15μmol/L)，0.8μLP1(5μmol/L)， 1 μ L C S F V-F 2(1 5 μ m o l/L)，1.5μLCSFV-R2(15μmol/L)，1μLP2(5μmol/L)優(yōu)化后的反應(yīng)程序如下：50 ℃反轉(zhuǎn)錄10 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 10 s，72 ℃延伸10 s(此處收集熒光)。

2.2 熒光RT-PCR的靈敏度

HCLV和CSFV石 門 強(qiáng)毒株細(xì)胞培養(yǎng)液病毒滴度分別 為 1 05.8T C I D50/1 0 0 μ L 及104.25TCID50/100μL。 當(dāng) 經(jīng) 典 毒 株等比稀釋到10-7，即病毒滴度稀釋到0.12TCID50/100μL時(shí)， 熒 光 RTPCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽性，當(dāng)高致病毒株等比稀釋到10-4，即病毒滴度稀釋到1.78TCID50/100μL時(shí)，熒光RTPCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽性。

2.3 特異性檢驗(yàn)

按建立方法對HCLV、CSFV石門強(qiáng)毒株、HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒混合 毒、BVDV、PRRSV、JEV、PPV、PRV、PCV2的陽性樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，HCLV樣品孔FAM熒光檢測出現(xiàn)了單一的s型擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果說明豬瘟疫苗毒株陽性，CSFV石門強(qiáng)毒株樣品孔HEX熒光檢測出現(xiàn)了單一的s型擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果說明豬瘟疫苗毒株陽性，HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株混合毒樣品孔FAM和HEX熒光檢測均出現(xiàn)了單一的s型擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果說明豬瘟疫苗毒株和強(qiáng)毒株均為陽性。其余樣品孔FAM和HEX熒光檢測均沒有s型擴(kuò)增曲線，表明建立的熒光RT-PCR檢測方法特異性良好。

2.4 熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立起的熒光RT-PCR法分別對HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株的細(xì)胞培養(yǎng)液分別10倍系列稀釋，每個(gè)梯度同時(shí)重復(fù)檢測3次后，記錄CT值，然后分別計(jì)算對HCLV和CSFV石門強(qiáng)毒株組內(nèi)、組間檢測的變異系數(shù)，結(jié)果樣品的Ct值批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于2.0%，批間重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于1.0%，表明本方法的重復(fù)性好（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

分別用建立雙重?zé)晒舛縍TPCR和普通RT-PCR方法，對臨床收集的165份疑似CSFV樣品進(jìn)行檢測，并與常規(guī)RT-PCR檢測方法進(jìn)行比較。雙重?zé)晒舛縍T-PCR結(jié)果顯示165份病料中有5份為CSFV疫苗毒陽性，檢出率為3%；23份CSFV強(qiáng)毒陽性，檢出率為13.9%；其中1份CSFV疫苗毒和強(qiáng)毒均為陽性。常規(guī)RT-PCR結(jié)果顯示165份病料中有4份為CSFV疫苗毒陽性，檢出率為2.4%；18份CSFV強(qiáng)毒陽性，檢出率為10.9%；其中1份CSFV疫苗毒和強(qiáng)毒均為陽性；雙重?zé)晒舛縍T-PCR與常規(guī)RTPCR符合率為96.4%。雙重?zé)晒舛縍T-PCR與單重?zé)晒舛縍T-PCR的結(jié)果相同，二者的符合率為100%。從臨床檢測結(jié)果看出，雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢出率高于普通RT-PCR。

3 討論

根據(jù)《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》，豬瘟已被列入其中[8]，要做到優(yōu)先防治，到2020年全國所有種豬場達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。近年來，我國已出臺一系列政策來支持開展豬瘟凈化，同時(shí)將豬瘟列入優(yōu)先防治病種之一。王偉等[9]建立了鑒別檢測CSFV強(qiáng)毒株與疫苗株的雙重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法，應(yīng)用該方法對CSFV強(qiáng)毒和疫苗株的最低檢出量為10拷貝/μL，檢測BVDV、PRRSV、PRV、PCV-2均呈陰性，批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均低于3%。劉俊等[10]等建立了豬瘟強(qiáng)毒株一步TaqMan-MGB RT-PCR診斷方法，該法能檢測5.3×102pgCSFV病毒核酸；能檢測除HCLV以外的豬瘟流行強(qiáng)毒株，對牛病毒性腹瀉病毒及其他多種豬常見病毒等檢測結(jié)果均為陰性。趙建軍等[11]建立能區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒、疫苗弱毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，并且與BVDV、TGEV、PEDV、PRV、PCV2、PRRSV、PPV不發(fā)生反應(yīng)，該方法對CSFV強(qiáng)毒和豬瘟弱毒疫苗RNA的最低檢出限分別為41.8拷貝/μL和81.5拷貝/μL。

傳統(tǒng)CSFV診斷方法主要包括病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金試紙條、熒光抗體試驗(yàn)、常規(guī)RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)、膠體檢測法等。這些方法在敏感性、特異性、時(shí)效性等方面都存在各自的不足，尤其不適于CSFV強(qiáng)毒感染的早期快速診斷。比如當(dāng)病毒分離鑒定耗時(shí)一長、血清學(xué)方法可能會(huì)出現(xiàn)一定的交叉反應(yīng)，且敏感性低不能早期檢測，常規(guī)RT-PCR技術(shù)不能對病毒定量，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等缺點(diǎn)，橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)目前還不太成熟，沒有大規(guī)模推廣應(yīng)用，膠體金檢測雖然方便，但敏感性太低，有時(shí)特異性不好，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。熒光定量PCR技術(shù)經(jīng)過20多年發(fā)展已經(jīng)成熟，筆者以為熒光PCR檢測是當(dāng)前最適合臨床應(yīng)用檢測的技術(shù)，現(xiàn)已到了大規(guī)模推廣應(yīng)用熒光PCR檢測病料樣品的最佳時(shí)期。

熒光定量PCR技術(shù)分為染料法和探針法兩種，與染料法相比探針法檢測特異性好，敏感性高，本實(shí)驗(yàn)采取的是一種新型探針即TaqMan MGB探針，其優(yōu)點(diǎn)是①探針背景的本底信號更低，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。②能顯著提高探針Tm值，因此，可以減少探針設(shè)計(jì)長度，尤其對AT富含區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)探針更有利。③探針與模板結(jié)合的特異性更高，即使一個(gè)堿基不匹配都能正確區(qū)分。由于豬瘟疫苗毒與豬瘟強(qiáng)毒基因組序列差別不大，同源性96%左右，因此，TaqMan MGB探針較適用于二者的鑒別檢測。

核酸提取是PCR檢測的重要步驟，核酸提取的時(shí)間和質(zhì)量對PCR檢測的總時(shí)間和檢測的效果均有重要的影響，本研究采用商品化核酸試劑提取核酸，其主要采用吸附柱式，操作簡單、快速，提取時(shí)配合小型高速離心機(jī)，半小時(shí)即能完成提取過程。筆者將經(jīng)典的Triol法與該法進(jìn)行比對，結(jié)果檢測結(jié)果一致，說明提取的RNA質(zhì)量完全能滿足檢測要求，最重要的該法核酸提取的時(shí)間遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)的Triol法。與磁株相比的優(yōu)勢是所需要的試劑少，操作簡單，試劑常溫保存即可，貯存和運(yùn)輸不需要低溫，適合現(xiàn)場檢測。

本研究采用豬瘟病毒疫苗株和野毒株一步法雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測方法。只需在PCR反應(yīng)中加入反轉(zhuǎn)錄試劑即可，無需單獨(dú)反轉(zhuǎn)錄時(shí)間，可大幅縮減反應(yīng)所需的時(shí)間，可在55 min完成擴(kuò)增反應(yīng)，得出檢測結(jié)果。不需特定實(shí)驗(yàn)室，無需電泳，至少可節(jié)省1/2的時(shí)間和費(fèi)用，該法操作簡單，避免了由于多次操作及電泳而造成的污染問題，可檢測微量病毒，將人為因素對結(jié)果的印象降到最低。試驗(yàn)所用的熒光定量PCR儀尺寸小，重量輕，便于攜帶，適合用于現(xiàn)場快速檢測，從而節(jié)省送樣的時(shí)間和樣品運(yùn)送途中的損耗，進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性，提早采取相應(yīng)的防控措施，減少養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)損失。為了更進(jìn)一步滿足現(xiàn)場檢測的需求，筆者下一步工作中將對檢測試劑的保存方式進(jìn)行優(yōu)化，將所用檢測試劑配制完成后，加入凍干保護(hù)劑，并分裝到8聯(lián)管中凍干保存，常溫保存和運(yùn)輸即可，使用時(shí)，只需要加入滅菌純化水和模板，即能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。簡化加樣步驟，避免了操作過程的污染。

本實(shí)驗(yàn)建立了豬瘟病毒疫苗株和野毒株一步法雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測方法，可用于現(xiàn)場檢測豬瘟病毒，特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好，配合AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，從核酸提取到報(bào)告檢測結(jié)果僅需1.5 h，檢測速度快，操作簡便，適合現(xiàn)地檢測，下一步可開發(fā)組裝成試劑盒，市場前景很好，適合基層臨床豬瘟的快速診斷，從而制定相應(yīng)的防治措施，使損失降到最低，也可用于精準(zhǔn)評估和診斷母豬豬瘟病毒帶毒排毒、仔豬潛在感染情況，臍帶血中豬瘟病毒含量情況，從而為豬瘟的預(yù)警、疫苗免疫效果評估及豬瘟防控凈化工作提供有力的條件。

[1] 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 2版.北京：科學(xué)出版社，1997：652-664.

[2] 仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗——半個(gè)世紀(jì)的回顧[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38 (8)：1675-1685.

[3] 于新友，李天芝，苗立中，等.分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進(jìn)展[J].豬業(yè)科學(xué)，2015，32(1)：76-78.

[4] 涂長春.豬瘟國際流行態(tài)勢、我國現(xiàn)狀及防制對策[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(8)：955-960.

[5] 陳鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價(jià)檢驗(yàn)替代方法的研究與應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(1)：162-169.

[6] 張改平，何文博，王德國，等.豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2014，46(3)：85-90.

[7] 戴志紅，蔣卉，李翠，等.用間接免疫熒光檢測方法評價(jià)豬瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究[J].中國獸藥雜志，2014，48(1)：34-37.

[8] 王長江，王琴，沙依蘭古麗，等.動(dòng)物疫病凈化的基本要求和方法探討[J].中國動(dòng)物檢疫，2013，30(8)：40-43.

[9] 王偉，符芳，陳欣，等.豬瘟病毒野毒株與疫苗株雙重SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(11) ：854-857.

[10] 劉俊，王琴，范學(xué)政，等.豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(12)：4366-4371.

[11] 趙建軍，成丹，李娜，等.豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株復(fù)合實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 鑒別方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37(5)：406-412.?

豬瘟耐熱凍干保護(hù)劑活疫苗免疫及檢測技術(shù)的研究與示范項(xiàng)目；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-08-17 )

李天芝(1985-)，女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷及防控研究.

2017-11-09）