張乾義，徐 璐，孫駿翔，王 琴

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，OIE/國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

檢測(cè)診斷

豬瘟診斷技術(shù)

張乾義，徐 璐，孫駿翔，王 琴

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，OIE/國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

中國(guó)是世界生豬養(yǎng)殖大國(guó)，生豬年出欄量占到世界總量的48%。豬瘟在中國(guó)被列為一類動(dòng)物疫病，影響著養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)安全，在其他很多國(guó)家也是動(dòng)物疫病防控的重點(diǎn)。有效防控豬瘟疫病，既是保護(hù)國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的需要，也是中國(guó)對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展責(zé)無(wú)旁貸的貢獻(xiàn)。當(dāng)前，中國(guó)正處在大力發(fā)展現(xiàn)代畜牧業(yè)的關(guān)鍵時(shí)期，隨著集約化、規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖的加快推進(jìn)，受生態(tài)環(huán)境、飼養(yǎng)模式、市場(chǎng)流通等多方面因素的影響，重大動(dòng)物疫病防控新情況、新特點(diǎn)不斷出現(xiàn)，防控難度也在不斷增加。2012年5月，作為一項(xiàng)重要的民生工程，中國(guó)政府發(fā)布了《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》，這標(biāo)志動(dòng)物疫病防控從過(guò)去的有效控制邁入到了逐步凈化消滅的嶄新階段。診斷檢測(cè)是動(dòng)物疾病防控的重要手段，準(zhǔn)確而快速的診斷是疾病控制的前提保障。早期確診并快速清除感染豬是控制豬瘟的關(guān)鍵所在。在典型性豬瘟流行的早期，人們通過(guò)典型臨床癥狀及剖檢病理變化即可進(jìn)行豬瘟的診斷。然而近30年來(lái)隨著非典型豬瘟越來(lái)越常見(jiàn)，僅靠臨床癥狀和病理剖檢變化已經(jīng)難以對(duì)豬瘟進(jìn)行確診，必須依賴實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)等診斷技術(shù)進(jìn)行快速確診。中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬瘟實(shí)驗(yàn)室是OIE/國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，承擔(dān)農(nóng)業(yè)部下達(dá)的大量流行病學(xué)調(diào)查任務(wù)，每年獲得病原學(xué)樣本約2 000余份、血清學(xué)樣本約5 000余份，在豬瘟診斷技術(shù)方面積累了一些經(jīng)驗(yàn)和檢測(cè)方法。因此本文就豬瘟臨床表現(xiàn)、病理剖檢、實(shí)驗(yàn)室診斷3個(gè)方面展開(kāi)對(duì)豬瘟診斷技術(shù)的概述。

1 臨床表現(xiàn)

豬瘟的臨診癥狀和死后病變，因毒株、宿主因素不同和病程長(zhǎng)短有很大差異。在臨床上根據(jù)病情、病毒的毒力、病程長(zhǎng)短、臨床癥狀和感染時(shí)期（出生前或出生后）表現(xiàn)不同，可將豬瘟分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、持續(xù)感染型5種類型。最急性型豬瘟病程一般為1～6 d，突然發(fā)病，全身痙攣，四肢抽搐，皮膚和黏膜發(fā)紺，倒臥，很快死亡；急性型病程一般為6～20 d、亞急性型為21～30 d，二者在臨床上并沒(méi)有太大的癥狀區(qū)分，主要表現(xiàn)是高稽留熱常超過(guò)40 ℃，腹部皮下、鼻鏡、耳尖、四肢內(nèi)側(cè)均可出現(xiàn)紫色或大小不等的出血斑點(diǎn)，指壓不褪色，眼結(jié)膜和口腔黏膜可見(jiàn)出血點(diǎn)，早期有結(jié)膜炎，眼睛內(nèi)有多量淡黃色的濃性分泌物，食欲下降，精神沉郁，瀕死期呈犬坐姿勢(shì)（見(jiàn)圖1和2）。

慢性豬瘟多發(fā)生于老疫區(qū)或接種豬瘟疫苗但免疫水平不高的豬群，病程通常在一個(gè)月以上，繼發(fā)感染嚴(yán)重，病豬食欲減退或食欲時(shí)好時(shí)壞；體溫有時(shí)正?；虺霈F(xiàn)周期性發(fā)熱；便秘與腹瀉交替發(fā)生，病豬腹瀉時(shí)間較長(zhǎng)則出現(xiàn)毛色粗亂，生長(zhǎng)停滯，貧血，日益消瘦。皮膚呈現(xiàn)紫色出血斑、丘疹或壞死，以耳尖壞死最為明顯。病豬難以完全康復(fù)，常成為僵豬。

持續(xù)感染型是目前引起豬瘟流行的最主要原因之一。感染豬本身無(wú)任何臨床癥狀，死亡率低，但長(zhǎng)期帶毒和排毒，母豬可正常返情，但久配不孕，并發(fā)展成繁殖障礙“帶毒母豬綜合征”，產(chǎn)木乃伊胎、死胎、畸形胎，出現(xiàn)新生仔豬顫抖病。國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室的研究人員進(jìn)行了人工豬瘟病毒持續(xù)感染動(dòng)物模型的建立和研究，發(fā)現(xiàn)懷孕母豬可連續(xù)帶毒750 d，母豬可正常返情，但久配不孕（《豬瘟》王琴、涂長(zhǎng)春主編，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社）。持續(xù)感染性豬瘟給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的危害極大，“健康”的先天性病毒感染的帶毒仔豬均不能消除體內(nèi)的病毒，產(chǎn)生免疫耐受，疫苗免疫之后不產(chǎn)生抗體導(dǎo)致免疫失敗。帶毒仔豬如果逃避病原監(jiān)測(cè)而進(jìn)入后備豬群體，經(jīng)水平傳播不斷排向外界，引起易感豬感染、發(fā)病和死亡并污染環(huán)境，導(dǎo)致在一個(gè)豬群內(nèi)病毒持續(xù)存在，難以清除帶毒仔豬進(jìn)入后備豬群體成為種豬，形成惡性循環(huán)，成為主要的傳染來(lái)源，這是目前對(duì)我國(guó)規(guī)模豬場(chǎng)養(yǎng)豬業(yè)危害最大的感染形式。

2 病理剖檢

急性亞急性的病理剖檢結(jié)果相似，脾的邊緣或脾體表面可見(jiàn)從粟粒至黃豆大、數(shù)目不等的紫紅色或紫黑色出血性梗死灶。梗死灶組織堅(jiān)實(shí)、表面稍凸出于周圍正常組織，切面呈楔形，其檢出率約占總病例的30%～40%，見(jiàn)圖3。腎臟病變明顯，表現(xiàn)為顏色淡，有時(shí)呈土黃色，有針尖大至米粒大出血點(diǎn)，量少時(shí)出血點(diǎn)稀疏散甚至只有少數(shù)幾個(gè)，量多時(shí)密布整個(gè)腎臟表面，如麻雀蛋外觀，見(jiàn)圖4。

圖1 全身出現(xiàn)紫色或大小不等的出血斑點(diǎn)

圖2 瀕死期病豬呈犬坐姿勢(shì)

圖3 脾邊緣出血性梗死

圖4 腎臟點(diǎn)狀出血

全身淋巴結(jié)病變具有一定的特征性，幾乎全身淋巴結(jié)都有出血性病變。主要表現(xiàn)淋巴結(jié)出血、腫脹，表面呈深紅色至紫黑色，見(jiàn)圖5。切面呈紅白相間的大理石狀外觀，這是因?yàn)榱馨透]內(nèi)積聚血液，而其余淋巴組織呈灰白色，兩者相互鑲嵌形成大理石樣花紋，見(jiàn)圖6。在頜下、咽背、耳下、支氣管、胃門、腎門、腹股溝及腸系膜等淋巴結(jié)病變最明顯，見(jiàn)圖7。

圖5 腸系膜淋巴結(jié)出血

圖6 頜下淋巴結(jié)大理石樣變

圖7 頜下淋巴結(jié)出血

全身多組織器官表現(xiàn)出血、喉頭和會(huì)厭軟骨上多數(shù)有小出血點(diǎn)，見(jiàn)圖8；腸道淋巴濾泡常腫大，直接從漿膜面即可明顯觀察；膀胱黏膜呈片狀或散在點(diǎn)狀出血；胃大彎內(nèi)黏膜常見(jiàn)明顯的充血和出血斑和出血點(diǎn)，表面糜爛、潰瘍，見(jiàn)圖9。扁桃體明顯腫大，表面因繼發(fā)細(xì)菌感染而出現(xiàn)的潰瘍壞死灶，見(jiàn)圖10。

圖8 喉頭和會(huì)厭軟骨出血

圖9 胃大彎黏膜出血、潰瘍

圖10 扁桃體潰瘍、壞死

慢性豬瘟剖檢見(jiàn)腸黏膜充血、出血，回盲瓣呈“紐扣狀”潰瘍，見(jiàn)圖11、12和13。

圖11 腸黏膜充血、出血

圖12 回盲瓣出血、潰瘍

圖13 回盲瓣呈“紐扣狀”

持續(xù)性感染無(wú)癥狀或癥狀不明顯，仔豬先天性感染豬瘟病毒，導(dǎo)致發(fā)生死胎、木乃伊胎、胎兒皮下水腫，腹腔積水以及畸形胎兒，出生后很快死亡的胎兒通常在皮膚和內(nèi)臟器官呈現(xiàn)點(diǎn)狀出血。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷一般分為動(dòng)物接種、病毒抗原檢測(cè)、病毒分離、病毒核酸檢測(cè)這4種方法，其中以病毒核酸檢測(cè)最為常用。

3.1 動(dòng)物接種

動(dòng)物接種法診斷豬瘟主要包括兔體交互實(shí)驗(yàn)和本體動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。受診斷成本及時(shí)間限制，動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在極少使用。兔體交互實(shí)驗(yàn)的主要原理是豬瘟強(qiáng)毒不會(huì)引起兔的體溫反應(yīng)，但能使其產(chǎn)生免疫力，豬瘟兔化弱毒苗能使家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，但對(duì)已產(chǎn)生免疫力的家兔則不產(chǎn)生體溫反應(yīng)，因此根據(jù)試驗(yàn)組兔不發(fā)生定型熱反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)樣本中是否含有豬瘟病毒。通過(guò)本動(dòng)物接種分離鑒定豬瘟病毒是檢測(cè)豬瘟病毒最敏感的方法，但試驗(yàn)成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，動(dòng)物個(gè)體差異大，存在生物安全隱患且須在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，散毒風(fēng)險(xiǎn)高。

3.2 豬瘟病毒抗原檢測(cè)

如果樣本是血液或者組織研磨液，可以選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，該方法具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，但存在靈敏度低，田間感染很難檢測(cè)。若是組織切片/抹片可選用免疫熒光/過(guò)氧化物酶實(shí)驗(yàn)，該種方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高、檢測(cè)時(shí)間短，但對(duì)檢驗(yàn)人員要求高，敏感性低。

3.3 豬瘟病毒分離

目前用于豬瘟病毒分離的組織主要有：血液、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和回腸等組織。血液（抗凝血、脫纖血）、扁桃體和淋巴結(jié)等組織也是國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展豬瘟流行病學(xué)監(jiān)測(cè)在養(yǎng)豬場(chǎng)和屠宰場(chǎng)常用的采樣組織，也是豬瘟病毒的嗜性組織。脾臟：健康脾臟為飽滿的紅棕色，豬瘟病毒感染后蒼白、柔軟、邊緣梗死，適宜在梗死灶之間進(jìn)行采樣。腎臟：健康腎臟為蒼白紅棕色豬瘟病毒感染后表面有針狀出血點(diǎn)，采樣時(shí)采集皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處?；啬c：回腸底部潰爛是急性豬瘟的典型癥狀，但只見(jiàn)于回腸內(nèi)壁，潰爛周圍組織是病毒富集區(qū)適宜進(jìn)行采樣。

豬瘟病毒分離實(shí)驗(yàn)室操作主要分為4個(gè)步驟：組織處理（修剪、研磨）、接種（敏感細(xì)胞系：PK15或ST）、結(jié)果判定（細(xì)胞、核酸染色法）、鑒定（RTPCR、測(cè)序）。上述檢測(cè)步驟也存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：特異性好，可用于病毒的進(jìn)一步鑒定和毒種保存；缺點(diǎn)：靈敏度低，檢測(cè)周期長(zhǎng)，易出現(xiàn)假陰性。

3.4 病毒核酸檢測(cè)

目前豬瘟病毒核酸檢測(cè)法主要是熒光RT-PCR和RT-nPCR，且這兩種方法都已申請(qǐng)國(guó)標(biāo)為我所豬瘟組自主開(kāi)發(fā)產(chǎn)品，見(jiàn)圖14和圖15。

熒光RT-PCR用于豬瘟病毒野毒、疫苗毒等所有毒株的診斷和監(jiān)測(cè)，適用于豬活體及其臟器、血液、排泄物和細(xì)胞培養(yǎng)物中CSFV核酸的檢測(cè)。原理是在PCR擴(kuò)增體系中加入一條特異熒光探針，該探針為一寡核苷酸鏈，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)(R)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)(Q）。探針完整時(shí)，兩者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，R基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)淬滅，PCR擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)，Taq酶發(fā)揮5`～3`外切酶活性，將探針降解，實(shí)現(xiàn)R基團(tuán)與Q基團(tuán)分離，Q基團(tuán)淬滅作用隨即消失，R基團(tuán)釋放熒光信號(hào)，被熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收，即每完成一次擴(kuò)增，就有一個(gè)熒光信號(hào)累積，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。在操作過(guò)程中應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照，包括樣本陰性對(duì)照與體系陰性對(duì)照；由于該方法的靈敏性很強(qiáng)，需要注意實(shí)驗(yàn)污染，因此最好將實(shí)驗(yàn)分區(qū)，將試劑配置、樣本處理、核酸擴(kuò)增等步驟區(qū)分開(kāi)來(lái)，避免污染。在大規(guī)模檢測(cè)時(shí)，建議使用UNG防污染體系。

圖14 豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒

RT-nPCR即套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于豬瘟的診斷和監(jiān)測(cè)，適用于豬活體及其臟器、血液、排泄物和細(xì)胞培養(yǎng)物中豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。RT-nPCR使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整目的片段，第二對(duì)引物特異性的擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片段，彌補(bǔ)RT-PCR的不足，可檢測(cè)病毒含量低的樣品。在RT-nPCR擴(kuò)增的特定基因（E2基因）片段的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行基因序列測(cè)定，因此該方法可進(jìn)一步鑒定流行毒株的基因型，從而追蹤流行毒株的傳播來(lái)源。

3.5 豬瘟抗體檢測(cè)

進(jìn)行豬瘟抗體監(jiān)測(cè)是國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查的主要內(nèi)容之一?？贵w檢測(cè)既可以用于免疫豬的抗體水平監(jiān)測(cè)，從而篩選出免疫耐受豬或者對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)，也可用于非免疫豬的感染篩查。目前豬瘟抗體檢測(cè)方法主要有細(xì)胞中和試驗(yàn)、兔體中和試驗(yàn)、正向間接血凝試驗(yàn)、ELISA、免疫層析技術(shù)以及其他的新型檢測(cè)技術(shù)。

1)細(xì)胞中和試驗(yàn)常用于豬血清中具有中和作用的豬瘟抗體效價(jià)的測(cè)定，主要采用固定病毒含量（通常病毒含量為100TCID50/50μL），稀釋待測(cè)血清的方法進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。該方法是豬瘟抗體檢測(cè)中的金標(biāo)準(zhǔn)但操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間久，影響因素較多。

2)兔體中和試驗(yàn)也是豬瘟抗體檢測(cè)中的金標(biāo)準(zhǔn)，其原理是利用工作濃度的豬瘟兔化弱毒抗原，與不同稀釋度的被檢血清等量混合作用后，耳靜脈注射家兔，據(jù)家兔體溫反應(yīng)結(jié)果定性定量判定被檢血清。該方法同樣操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間久。

圖15 豬瘟病毒RT-nPCR檢測(cè)試劑盒

3)豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)是利用豬瘟病毒致敏紅細(xì)胞，將待檢血清梯度稀釋后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)紅細(xì)胞的凝集判斷結(jié)果。這種方法能夠測(cè)出豬瘟抗體效價(jià)，簡(jiǎn)便易操作，常用于免疫抗體的監(jiān)測(cè)。

4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)即ELISA技術(shù)，是國(guó)際貿(mào)易指定標(biāo)準(zhǔn)診斷方法之一，該方法又分為間接ELISA、阻斷ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA。中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室制成了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，適合我國(guó)全面免疫的防控策略，具有敏感性高特點(diǎn)。

5)免疫層析技術(shù)其原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)層析作用，使抗原抗體在固相膜上反應(yīng)，由膠體金標(biāo)記的抗體顯色，陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色，陰性反應(yīng)則不顯色。操作簡(jiǎn)便、快速，全程只需5 min左右，肉眼直接觀察和判斷檢測(cè)結(jié)果；可采用儀器進(jìn)行相對(duì)定量，但是該方法敏感性低，不適合大量的樣品檢測(cè)。隨著科技發(fā)展，化學(xué)發(fā)光技術(shù)、熒光微球檢測(cè)技術(shù)、鑭系高敏熒光定量免疫層析技術(shù)等新興技術(shù)逐漸用于豬瘟抗體的檢測(cè)。

相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和高新技術(shù)的一次次突破，越來(lái)越多的新技術(shù)、新方法被研發(fā)并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中，當(dāng)然也包括我們獸醫(yī)界在豬瘟診斷領(lǐng)域的突破和創(chuàng)新。豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室將按照OIE參考實(shí)驗(yàn)室的職能和國(guó)家豬瘟防控需求，努力完善豬瘟流行病學(xué)的研究，進(jìn)一步提升診斷水平和標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，開(kāi)展相關(guān)基礎(chǔ)研究以及新型診斷試劑及疫苗的研發(fā)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，進(jìn)一步增強(qiáng)在國(guó)際社會(huì)中的交流與合作，建立長(zhǎng)期聯(lián)系機(jī)制，深入探討豬瘟防控中的技術(shù)問(wèn)題，共同為在全球控制和消滅豬瘟做出更大的貢獻(xiàn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“豬瘟病毒RNA在體內(nèi)外細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)態(tài)研究”（編號(hào)：31372434）；《“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題》項(xiàng)目“豬瘟和豬偽狂犬病防控凈化技術(shù)集成研究與示范”，項(xiàng)目編號(hào)：2015BAD12B04。

2017-10-30）