張景艷，張 宏，王 磊, 李建喜*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050； 2.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730030)

高效液相色譜法測(cè)定去滯散中柚皮苷和新橙皮苷的含量

張景艷1，張 宏2，王 磊1, 李建喜1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050； 2.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730030)

為了測(cè)定去滯散中枳殼的含量，采用C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，在室溫下，以乙腈-水(20∶80，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3)為流動(dòng)相，283 nm為檢測(cè)波長，流速為1.0 mL/min，建立了反相高效液相色譜(RP-HPLC)測(cè)定方法。結(jié)果顯示，柚皮苷在0.08～4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9999，回收率為94.4%～101.7%，RSD為2.23%；新橙皮苷在0.08～4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9995，回收率為90.6% ～100.0%，RSD為2.85%。本方法簡便、準(zhǔn)確、快速，可用于控制去滯散中枳殼的含量。

去滯散；枳殼；柚皮苷；新橙皮苷；高效液相色譜法

去滯散是運(yùn)用中獸醫(yī)傳統(tǒng)理論，在《元亨療馬集》“曲蘗散”的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行藥味加減，并通過臨床試驗(yàn)篩選后研制出的一種中藥復(fù)方散劑[1]，由六神曲、枳殼、山楂、黃芪、當(dāng)歸、茯苓、甘草等中藥配伍，經(jīng)粉碎制成，具有健脾和胃，補(bǔ)中益氣，消食化積的功效。主要用于豬、牛食欲不振、消化不良、便秘腹脹。本試驗(yàn)擬建立去滯散中君藥枳殼的含量測(cè)定方法，以控制去滯散的質(zhì)量[2]。為了更準(zhǔn)確的反映枳殼中理氣和行滯的主要藥理活性成分，試驗(yàn)中分別測(cè)定了柚皮苷和新橙皮苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(配二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等)；XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；Waters600高效液相色譜儀；電子天平(型號(hào)為AE100，AE240)，購自梅特勒-托利多公司。

1.2 試藥與試劑 柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)為110722-201111)、新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)為111857-201102)均購自中國食品藥品檢定研究院；去滯散樣品(批號(hào)分別為20130502，20130504，20130506)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所制備與提供；甲醇為色譜純(賽默飛)；超純水為Simplicity超純水器(Millipore公司)二次制備，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈-水(20∶80，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長283 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含柚皮苷、新橙皮苷各80 μg的溶液(實(shí)際濃度柚皮苷80.8 μg/mL、新橙皮苷80.4 μg/mL)，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方及制法制備不含枳殼的陰性制劑，取枳殼陰性制劑1.3 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖1，理論塔板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算為3517，分離度為2.72。陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品和供試品色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰。結(jié)果表明處方中其他成分對(duì)枳殼的定量檢測(cè)無干擾，專屬性能滿足檢測(cè)要求。

2.4 線性范圍 取濃度同為80 μg/mL的柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、5、10、20、50 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以各自峰面積為縱坐標(biāo)，以柚皮苷、新橙皮苷質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，柚皮苷回歸方程y=1711.5x-33.197，R2=0.9999，柚皮苷在0.08～4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；新橙皮苷回歸方程y=1735.2x+0.9598，R2=0.9995，新橙皮苷在0.08～4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 準(zhǔn)確度 采用加標(biāo)回收的方法，在已知含量的去滯散中加入一定質(zhì)量的柚皮苷或新橙皮苷對(duì)照品，使其制備后在供試品中的量分別為其限度值的80%(L組)、100%(M組)、120%(H組)，每組制備3份。再按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算出實(shí)際加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量，用實(shí)際計(jì)算出來的加入量比上由稱量得到的加入量，即得。

柚皮苷回收率 將柚皮苷對(duì)照品按高、中、低3個(gè)濃度添加到批號(hào)為20130502的去滯散中，按2.2中的方法制備供試品溶液，精密量取10 μL上機(jī)測(cè)定，柚皮苷回收率為94.4%～101.7%，RSD為2.23%。結(jié)果見表1。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖(A、B、C、D分別為柚皮苷、新橙皮苷、去滯散供試品、枳殼陰性對(duì)照)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test(A:Naringin; B:Neohesperidin: C:Quzhi San; D:Aurantii fructus negative control)

序號(hào)樣品重量/g柚皮苷含量/mg柚皮苷添加量/mg測(cè)得柚皮苷總含量/mg回收率/%RSD/%L10．75484．993．028．06101．7L20．75124．973．158．0296．8L30．74994．963．057．9297．1M10．75254．975．249．9695．2M20．75094．965．019．8597．6M30．74894．955．1710．0197．9H10．74824．956．9911．5594．4H20．75134．977．1511．9998．2H30．75014．967．0612．03100．12．23

新橙皮苷回收率 將新橙皮苷對(duì)照品按高、中、低3個(gè)濃度添加到批號(hào)為20130502的去滯散中，按2.2中的方法制備供試品溶液，精密量取10 μL上機(jī)測(cè)定，新橙皮苷回收率為90.6%～100.0%，RSD為2.85%。結(jié)果見表2。

表2 新橙皮苷加樣回收率試驗(yàn)Tab 2 Recovery results of Neohesperidin

2.6 精密度 取供試品(批號(hào)：20130502)溶液，精密量取10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得柚皮苷峰面積RSD為0.64%，新橙皮苷峰面積RSD為1.09%，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)Tab 3 Precision test

2.7 耐用性 取按準(zhǔn)確度測(cè)定項(xiàng)下制得的樣品，保持流動(dòng)相比例和流速不變，在Waters600和Agilent 1100色譜儀上分別使用Agilent SB-C18(4.6 mm×150mm，5 μm)柱和Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×150mm，5 μm)色譜柱，于20 ℃、30 ℃、40 ℃條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明該方法能夠耐受不同液相色譜儀、色譜柱、柱溫等因素的小范圍變化，測(cè)定去滯散中柚皮苷、新橙皮苷的含量無顯著差異，說明耐用性良好。

2.8 含量測(cè)定 取3批去滯散(批號(hào)分別為20130502，20130504，20130506)，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取10 μL上機(jī)測(cè)定峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算柚皮苷和新橙皮苷的含量，結(jié)果見表4。根據(jù)3批樣品中柚皮苷和新橙皮苷的含量實(shí)測(cè)值，參考2015年版《中華人民共和國獸藥典》二部[3]枳殼含量測(cè)定項(xiàng)下柚皮苷和新橙皮苷含量理論值，確定含量限度為每1 g去滯散中含枳殼以柚皮苷計(jì)不得低于5.0 mg，以新橙皮苷計(jì)不得低于4.0 mg。

表4 含量測(cè)定結(jié)果(單位：mg/g)Tab 4 Content determination results of three batch Quzhi San(unit：mg/g)

3 討論與小結(jié)

3.1 含量測(cè)定成分的選擇 去滯散中六神曲、枳殼、山楂為主藥，主要起健脾和胃、行滯消脹、消食、健胃等功能。六神曲為傳統(tǒng)成方曲劑，在加工生產(chǎn)中，普遍存在處方原料入藥方式及配比不一致、生產(chǎn)工藝不一致、質(zhì)量評(píng)價(jià)體系不完善、發(fā)酵環(huán)境中的菌種不同等問題[4-5]，限制了六神曲中化學(xué)成分的研究，因此選擇另一主藥枳殼作為去滯散的定量參數(shù)。枳殼具有理氣寬中、行滯消脹等功效，研究表明枳殼的水提物能夠增強(qiáng)腸蠕動(dòng)[6]；枳殼的醇提物和水提物對(duì)豬源鏈球菌有較強(qiáng)的抑菌活性[7]，是中獸醫(yī)臨床常用的藥物之一，常用于畜禽脹滿疼痛，食積不化，胸脅氣滯，痰飲內(nèi)停，臟器下垂等。枳殼理氣、行滯的重要成分為柚皮苷、新橙皮苷[8-9], 并且柑橘屬多種植物果實(shí)含有柚皮苷而不含有新橙皮苷，不作為枳殼的基原植物[10]，所以去滯散中含量測(cè)定的成分選擇為柚皮苷和新橙皮苷。

3.2 樣品前處理方法的選擇 柚皮苷和新橙皮苷同屬枳殼的黃酮類成分，其提取、分離方法主要有水浴回流提取法、醇或堿液提酸沉法、索氏提取法、超聲輔助提取法和超臨界流體苯取等方法[11]。參考2015年版《中華人民共和國獸藥典》二部枳殼含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本試驗(yàn)采用甲醇作為溶媒，加熱回流1.5 h，結(jié)果證明該方法能夠較為完全的提取出去滯散中的柚皮苷和新橙皮苷，并且枳殼陰性對(duì)照無干擾。

3.3 含量測(cè)定限度的確定 枳殼收錄在2015年版《中華人民共和國獸藥典》二部，其含量限度為柚皮苷(C27H32O14)不得少于4.0%，新橙皮苷(C28H34O15)不得少于3.0%，由于未見相關(guān)毒性報(bào)道，所以沒有上限規(guī)定。在去滯散處方中枳殼所占比例約為13.3%，理論含量為每1 g去滯散中含枳殼以柚皮苷計(jì)不得低于5.32 mg，以新橙皮苷計(jì)不得低于3.99 mg。在實(shí)際樣品(批號(hào)分別為20130502，20130504，20130506)測(cè)定時(shí)，柚皮苷含量為6.12～6.61 mg/g，新橙皮苷含量為4.88～5.17 mg/g，均為理論值115%以上，說明制劑生產(chǎn)過程中質(zhì)量穩(wěn)定。因此，參考含量理論值并取整數(shù)部分確定了含量測(cè)定的限度下限，上限未作規(guī)定。隨著對(duì)枳殼中柚皮苷、新橙皮苷等有效成分研究的深入，其毒理作用必將逐漸明晰，屆時(shí)可以考慮設(shè)定更加合理的限度范圍。

用高效液相法測(cè)定去滯散中柚皮苷、新橙皮苷的含量，方法簡便，準(zhǔn)確，靈敏度高，回收率好，可有效控制該制劑中主藥枳殼的含量，含量限度為每1 g去滯散中含枳殼以柚皮苷計(jì)不得低于5.0 mg，以新橙皮苷計(jì)不得低于4.0 mg。

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RP-HPLCDeterminationofNaringinandNeohesperidininQuzhiSan

ZHANG Jing-yan1, ZHANG Hong2, WANG Lei1, LI Jian-xi1*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,Lanzhou, 730050,China;2.GansuInstituteofVeterinaryDrugandFeedInspection，Lanzhou730030,China)

LIJian-xi,E-mail: 195425319@qq.com

A method for the determination ofAurantiifructusin Quzhi San was developed by the reverse high performance liquid chromatography(RP-HPLC).The C18 colum (4.6 mm×150 mm, 5 μm) was used with acetonitrle-water(20∶80, pH was adjusted to 3 by H3PO4) and the detection wavelength was 283 nm.The results showed that Naringin had a good linear relationship at the range of 0.08～4 μg(R2=0.9999)and the recovery rate were 94.4%～101.7%，RSD=2.23%. Neohesperidin had a good linear relationship at the range of 0.08～4 μg(R2=0.9995)and the recovery rate were 90.6%～100.0%，RSD=2.85%. The method was simple, accurate and fast in the determination ofAurantiifructusin Quzhi San.

Quzhi San;Aurantiifructus; Naringin; Neohesperidin; RP-HPLC

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.07

2017-06-04

A

1002-1280 (2017) 12-0036-06

S853.7

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：20130340-15)

張景艷，助理研究員，從事中獸醫(yī)藥學(xué)研究；張 宏，為共同第一作者。

李建喜。E-mail: 195425319@qq.com

(編輯：陳希)