孫利杰，劉東旭，李健明，冷 雪，時(shí) 坤，李 東，杜 銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長春 130118; 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132000; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，長春 130118)

兩株水貂阿留申全基因重組核酸疫苗的免疫效果初步評(píng)估

孫利杰1，劉東旭2，李健明1，冷 雪1，時(shí) 坤1，李 東1，杜 銳3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長春 130118; 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132000; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，長春 130118)

為研究實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的兩株水貂阿留申重組核酸疫苗(pcDNA3.1-ADV-428和pcDNA3.1-ADV-428-487)對水貂的免疫原性，將其經(jīng)肌肉注射接種到水貂體內(nèi)進(jìn)行免疫，免疫完成后對水貂進(jìn)行攻毒，然后每隔兩周對水貂進(jìn)行指尖采血。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測全血中的CD8+淋巴細(xì)胞亞群，用間接ELISA法檢測血清中的抗體水平，用血清蛋白電泳檢測血清中γ球蛋白占總蛋白的百分比以及應(yīng)用聚乙二醇沉淀比濁法檢測水貂血清中抗原抗體復(fù)合物的含量，以對兩株核酸疫苗的免疫效果進(jìn)行初步評(píng)估。試驗(yàn)結(jié)果表明，pcDNA3.1-ADV-428和 pcDNA3.1-ADV-428-487的各項(xiàng)數(shù)據(jù)都優(yōu)于對照組，且pcDNA3.1-ADV-428-487的保護(hù)效果優(yōu)于pcDNA3.1-ADV-428，兩種核酸疫苗都展現(xiàn)了良好的疫苗潛質(zhì)。

水貂；阿留申??；核酸疫苗；免疫；抗原抗體復(fù)合物；γ球蛋白；淋巴細(xì)胞

核酸疫苗是將編碼某種能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原基因直接導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)，經(jīng)宿主細(xì)胞表達(dá)出抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，以期達(dá)到防治疾病的目的[1-3]。由于水貂阿留申病特殊的致病機(jī)理以及抗原抗體復(fù)合物的沉積作用[4]使得針對水貂阿留申病疫苗的研制一直是動(dòng)物醫(yī)學(xué)界難以解決的一大問題。核酸疫苗以其既能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生體液免疫同時(shí)也能引起宿主細(xì)胞免疫[5]的優(yōu)勢逐漸引起人們的重視，針對水貂阿留申病核酸疫苗的研究也越來越多。目前，水貂阿留申病疫苗的研究主要有關(guān)于ADV(Aleutian disease virus，ADV)全基因、NS1、VP2以及VP2截?cái)嘈蛄械难芯縖6]，這些研究雖然都表現(xiàn)出了一定的保護(hù)效果，但都無法完全預(yù)防水貂阿留申病。本研究以兩株前期構(gòu)建并已證明具有良好反應(yīng)原性的核酸疫苗為實(shí)驗(yàn)對象，進(jìn)行本體動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，研究其對水貂的免疫原性及免疫效果。

1 材料與試劑

1.1 重組真核質(zhì)粒以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428和pcDNA3.1-ADV-428-487為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，ADV全基因切除428-446序列進(jìn)行重組然后與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行連接構(gòu)建了pcDNA3.1-ADV-428。ADV全基因同時(shí)切除428-446和487-501序列后進(jìn)行重組然后與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行連接構(gòu)建了pcDNA3.1-ADV-428-487。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自黑龍江帽兒山水貂養(yǎng)殖場的六月齡阿留申病陰性雌貂。

1.2 主要試劑 10×紅細(xì)胞裂解液購自美國BD公司；FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG和純化的小鼠IgG購自DAKO公司；小鼠抗牛IFN-γ干擾素購自AbD Serotec公司；固定劑、破膜劑購自北京四正柏公司；brefeldin A、inomycin、PNA、Saponin以及小鼠抗人CD8+IgG購自Sigma公司；RPMI 1640液體培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；氨基黑10B購自上海源葉生物。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、免疫與攻毒 將經(jīng)檢驗(yàn)無水貂阿留申病的六月齡雌性水貂隨機(jī)分成5組，每組3只。分別為A：pcDNA3.1-ADV-428組；B：pcDNA3.1-ADV-428-487組；C：滅活苗組;D：空載體組；E：PBS組。兩周后，對水貂進(jìn)行免疫。A、B兩實(shí)驗(yàn)組分別取相對應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行4～5位點(diǎn)的大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射(533 μg/只)3～4位點(diǎn)的低脊背肌肉注射(267 μg/只)，C組取滅活苗與等體積的鋁膠佐劑混合后，大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射(500 μL/只)，所用滅活苗為實(shí)驗(yàn)室制備，D組取空載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行4～5位點(diǎn)的大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射(533 μg/只)3～4位點(diǎn)的低脊背肌肉注射(267 μg/只),E組取PBS大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射(500 μL/只)，共免疫3次，每次間隔3周。

在最后一次免疫1個(gè)月后對水貂進(jìn)行攻毒，每只水貂腹腔注射105.0TCID50的水貂阿留申病強(qiáng)毒株ADV-DL125。攻毒后每2周對水貂進(jìn)行指尖采血，收集各組水貂的全血和血清樣本。

2.2 水貂血清中抗ADV抗體的檢測 采用間接ELISA法檢測各組水貂體內(nèi)的抗體水平，以ADV病毒包被，HRP標(biāo)記兔抗水貂IgG作為二抗。

2.3 水貂血清中抗原抗體復(fù)合物的檢測 按照籍玉林等[7]建立的聚乙二醇沉淀比濁法檢測水貂血清中抗原抗體復(fù)合物的含量。

將水貂血清稀釋30倍，取酶標(biāo)板每只水貂樣本取兩孔，1孔加203 μL硼酸鹽緩沖液，2孔加203 μL PBS，兩孔各加7 μL血清。4 ℃作用1 h，室溫30 min。450 nm下讀數(shù)。1孔的值減去2孔的值即為該水貂血清中抗原抗體復(fù)合物的含量。

2.4 水貂血清中γ球蛋白含量檢測 將醋酸纖維素膜切成8×2 cm的長條浸于巴比妥緩沖液中完全浸透，用濾紙吸去多余液體，于無光面1.5 cm處呈線狀點(diǎn)樣，血清滲入膜內(nèi)后，將薄膜搭于濾紙橋上。點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣端靠近負(fù)極。電壓90～120 V,電流0.4～0.6 mA/Cm通電45～60 min，直至電泳帶展開25～35 mm。將薄膜浸于染色液中，5～10 min后取出用漂洗液漂洗數(shù)次，至背景無色。將洗完的薄膜用濾紙吸干，剪下各蛋白帶，分別浸于4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液中，振搖數(shù)次，于580～620 nm波長處測各光密度值。蛋白帶(由正極到負(fù)極)依次為A、α1、α2、β、γ。光密度綜合為T=A+α1+α2+β+γ，γ球蛋白(%)=γ/T×100%。

2.5 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群檢測 取500 μL新鮮抗凝血加入5 mL 10倍稀釋的紅細(xì)胞裂解液，37 ℃作用10 min，1000 r離心5 min，棄去上層紅色液體，用含有10%血清的 RPMI1640營養(yǎng)液吹吸沉淀，洗滌1～2次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取經(jīng)計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞2×106個(gè)，用含0.2%血清及0.02%疊氮鈉的PBS(FACS)洗滌兩次，每次800 g離心5 min。用100 mL FACS重懸后每管加入5 μL 10倍稀釋的鼠抗人CD8+抗體，4 ℃孵育1 h，以小鼠純化IgG為同型對照。800 g離心5 min，用FACS洗滌兩次。用100 μL FACS重懸后每管加入10 μL 10倍稀釋的FITC標(biāo)記兔抗鼠抗體，4 ℃孵育1 h。用FACS洗滌2次后，加入300 μL FACS吹打混勻過膜，經(jīng)流式細(xì)胞儀讀數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 水貂血清中抗ADV抗體檢測 圖1為不同時(shí)間段各組水貂血清中的抗體水平，攻毒當(dāng)天各組血清中抗體水平都比較低，而且pcDNA3.1-ADV-428組、pcDNA3.1-ADV-428-487組和滅活苗組抗體水平都比兩個(gè)對照組高。隨著時(shí)間增加各組水貂血清中的抗體水平都顯著增長，且滅活苗組的抗體水平一直高于其他組。在第24周之前pcDNA3.1-ADV-428組、pcDNA3.1-ADV-428-487組的抗體水平一直高于空載體組和PBS組，從24周開始兩對照組的抗體水平超過兩實(shí)驗(yàn)組。

*表示與PBS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與PBS組差異極顯著(P<0.01)。#表示與pcDNA3.1空載體組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與pcDNA3.1空載體組相比差異極顯著(P<0.01)*Express the difference was significant compared with the PBS group(P<0.05),** Express the difference was extremely significant compared with the PBS group(P<0.01). # Express the difference was significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.05), ## Express the difference was extremely significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.01)圖1 水貂抗體水平變化Fig 1 The level of antibody in the serum from the mink change test

3.2 水貂血清中抗原抗體復(fù)合物的檢測 圖2為各組水貂血清中抗原抗體復(fù)合物的含量變化，攻毒當(dāng)天各組水貂血清中的抗原抗體復(fù)合物的含量都比較低且滅活苗組明顯高于其他組。從第8周開始滅活苗組、空載體組、PBS組的抗原抗體復(fù)合物含量開始顯著升高，而pcDNA3.1-ADV-428組、pcDNA3.1-ADV-428-487組一直處于緩慢增長的趨勢且30周之前含量一直未超過0.3。

*表示與PBS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與PBS組差異極顯著(P<0.01)。#表示與pcDNA3.1空載體組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與pcDNA3.1空載體組相比差異極顯著(P<0.01)*Express the difference was significant compared with the PBS group(P<0.05),** Express the difference was extremely significant compared with the PBS group(P<0.01).# Express the difference was significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.05),## Express the difference was extremely significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.01)圖2 水貂血清中抗原抗體復(fù)合物含量變化Fig 2 The result of CIC in the serum from the mink change test

3.3 水貂血清中γ球蛋白含量檢測 圖3為各組水貂血清中γ球蛋白的含量變化，免疫后各組水貂血清中的γ球蛋白初始含量均在10%左右，隨著攻毒時(shí)間增長各組γ球蛋白含量也隨之增長。滅活苗組、空載體組和PBS組水貂血清中的γ球蛋白含量在第8周開始顯著增長且在第18周三組的γ球蛋白的含量均超過了40%。而pcDNA3.1-ADV-428組和pcDNA3.1-ADV-428-487組水貂血清中的γ球蛋白含量一直未超過40%。

*表示與PBS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與PBS組差異極顯著(P<0.01)。#表示與pcDNA3.1空載體組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與pcDNA3.1空載體組相比差異極顯著(P<0.01)*Express the difference was significant compared with the PBS group(P<0.05),** Express the difference was extremely significant compared with the PBS group(P<0.01). # Express the difference was significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.05),## Express the difference was extremely significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.01)圖3 水貂血清中γ球蛋白含量變化Fig 3 The level of γ globulin in the serum from the mink change test

3.4 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群檢測 結(jié)果如圖4所示，攻毒當(dāng)天各組水貂血清中的CD8+T淋巴細(xì)胞均在20%左右，從第4周開始各組CD8+細(xì)胞含量顯著升高，到第12周為止各組一直處于增長趨勢。第18周往后各組CD8+細(xì)胞含量呈緩慢下降趨勢。在24周之前pcDNA3.1-ADV-428組和pcDNA3.1-ADV-428-487組中的CD8+細(xì)胞含量一直低于其他三組。

*表示與PBS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與PBS組差異極顯著(P<0.01)。#表示與pcDNA3.1空載體組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與pcDNA3.1空載體組相比差異極顯著(P<0.01)*Express the difference was significant compared with the PBS group(P<0.05),** Express the difference was extremely significant compared with the PBS group(P<0.01).# Express the difference was significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.05),## Express the difference was extremely significant compared with the pcDNA3.1 null carrier group(P<0.01)圖4 水貂外周血CD8+ T淋巴細(xì)胞亞群含量變化Fig 4 The quantification of CD8+ cells in PBMC from the mink change test

4 討論與總結(jié)

水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的一種慢性的淋巴增殖性疾病[8]，病毒破壞水貂機(jī)體免疫系統(tǒng)，降低水貂抵抗力[9]。水貂機(jī)體在感染ADV后產(chǎn)生的大量非中和抗體并不能中和病毒，反而與病毒結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物[10]，抗原抗體復(fù)合物隨血液在機(jī)體內(nèi)循環(huán)到達(dá)腎小球壁和動(dòng)脈壁進(jìn)行沉積引起水貂的動(dòng)脈炎和腎小球腎炎[11]。目前，尚無可以有效防治水貂阿留申病的疫苗，該病的防治只能采用定期檢疫及時(shí)處死病貂的手段[12]。

水貂在感染水貂阿留申病毒后，體內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞的含量顯著升高[13]；同時(shí)血清中γ球蛋白的含量也會(huì)急劇增加[14]，感染后γ球蛋白占總蛋白的百分比往往會(huì)超過40%。所以檢測CD8+淋巴細(xì)胞和γ球蛋白的含量是判定水貂是否感染阿留申病的重要指標(biāo)。除此以外考慮到抗原抗體復(fù)合物在水貂機(jī)體內(nèi)所引起的特殊反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)所使用的核酸疫苗在構(gòu)建時(shí)切除了疑似介導(dǎo)抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生的位點(diǎn)(428～446位點(diǎn))[15]，所以對攻毒后水貂血清中的抗原抗體復(fù)合物含量也進(jìn)行了檢測，期望更全面的的評(píng)估所構(gòu)建疫苗的防治效果。

從結(jié)果中我們可以看出，在水貂攻毒第0周pcDNA3.1-ADV-428組和pcDNA3.1-ADV-428-487組的水貂均已產(chǎn)生了抗體且含量都比空載體組和PBS組高，說明兩種核酸疫苗均能引起水貂的免疫反應(yīng)，且隨著攻毒時(shí)間的增長抗體水平一直在穩(wěn)步提高；在抗原抗體復(fù)合物的檢測中，pcDNA3.1-ADV-428組和pcDNA3.1-ADV-428-487組的水貂血清中的抗原抗體復(fù)合物的含量一直低于其他三組，且增長的趨勢比較緩慢，而且pcDNA3.1-ADV-428-487組的含量一直略低于pcDNA3.1-ADV-428組，說明核酸疫苗pcDNA3.1-ADV-428和pcDNA3.1-ADV-428-487對抗原抗體復(fù)合物的形成有一定抑制作用；血清中γ球蛋白的檢測結(jié)果顯示，在攻毒當(dāng)天五組水貂的γ球蛋白含量均在正常水平10%左右，隨著時(shí)間增長滅活苗組、空載體組和PBS組最終γ球蛋白所占比例均超過了40%，而兩核酸疫苗組一直維持在40%以下且pcDNA3.1-ADV-428-487組的含量一直略低于pcDNA3.1-ADV-428組，說明兩種核酸疫苗對水貂起到了一定的保護(hù)作用；CD8+淋巴細(xì)胞的檢測中，各組CD8+淋巴細(xì)胞的含量都隨著攻毒時(shí)間的增加而增加，在第24周之前pcDNA3.1-ADV-428組和pcDNA3.1-ADV-428-487組的CD8+淋巴細(xì)胞的含量一直低于其他三組，但是在24周之后pcDNA3.1-ADV-428和pcDNA3.1-ADV-428-487兩組的CD8+淋巴細(xì)胞含量開始略高于空載體組和PBS組。

總而言之，pcDNA3.1-ADV-428和pcDNA3.1-ADV-428-487兩種核酸疫苗，都對水貂有一定的保護(hù)力，展現(xiàn)了良好的疫苗潛質(zhì)，且pcDNA3.1-ADV-428-487還要優(yōu)于pcDNA3.1-ADV-428，但是通過以上實(shí)驗(yàn)分析還不能全面的評(píng)價(jià)兩種核酸疫苗的保護(hù)效果，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

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PreliminaryImmuneEffectEvaluationofTwoADVRecombinantDNAVaccines

SUN Li-jie1, LIU Dong-xu2, LI Jian-ming1, LENG Xue1, SHI Kun1, LI Dong1, DU Rui3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.JilinAgricultureScienceandTechnologyCollege,Jilin132000,China;3.GraduateSchoolofJilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China

DURui,E-mail:durui197107@sina.com

In this study, recombinant DNA two nucleic acid vaccines constructed by intramuscular inoculation to mink body immune(pcDNA3.1-ADV-428 and pcDNA3.1-ADV-428-487). Mink were challenged experiment when after the completion of immunization, then every two weeks for blood collection of mink fingertips. The whole blood CD8+lymphocyte subsets detection by flow cytometry; detection of antibody levels in serum by indirect ELISA; serum protein electrophoresis was used to detect the γ globulin percentage of total protein in serum and the application of polyethylene glycol precipitation determination of antigen antibody complexes in serum of mink, the immunogenicity of two nucleic acid vaccines was evaluated preliminarily. The experimental results showed that the data of pcDNA3.1-ADV-428 and pcDNA3.1-ADV-428-487 were better than those of the control group, the protective effect of pcDNA3.1-ADV-428-487 was better than that of pcDNA3.1-ADV-428, two nucleic acid vaccines had shown good vaccine potential.

mink Aleutian disease;nucleic acid vaccine;immunization;antigen antibody complex;γ globulin;lymphocyte

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.01

2017-03-07

A

1002-1280 (2017) 12-0001-06

S859.797

國家自然基金(31372436)；吉林省科技廳科技支撐計(jì)劃(20160209006YY)

孫利杰，碩士研究生，從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病的研究。

杜 銳。E-mail：durui197107@sina.com

(編輯：李文平)