鄭巧利 王鵬茂 張廣何 薛佳平

(同濟大學(xué)浙江學(xué)院，浙江 嘉興 314051)

餐廚垃圾產(chǎn)量高、成分復(fù)雜，可生物降解能力強，資源化利用空間很大，但未經(jīng)妥善處理的餐廚垃圾危害也極大，因此餐廚垃圾進行資源化處理具有十分重要的意義和發(fā)展前景。餐廚垃圾處理技術(shù)主要有飼料化、堆肥化和厭氧消化等，而厭氧消化技術(shù)是目前最常用的餐廚垃圾處理技術(shù)[1]。厭氧消化技術(shù)的重要研究方向之一就是消化過程中厭氧菌的分離培養(yǎng)和鑒定。如金映虹[1]從厭氧消化池活性污泥中采集樣品，利用特定培養(yǎng)基進行厭氧培養(yǎng)，分離篩選得到2株產(chǎn)甲烷菌。汪婷[2]研究了牛糞為消化原料的沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌分子多樣性及產(chǎn)甲烷菌的分離。本文則以餐廚垃圾為研究對象，以餐廚垃圾和污泥聯(lián)合發(fā)酵過程中的消化液為菌種來源，進行培養(yǎng)和初步鑒定。

1 實驗材料和藥品

實驗所用設(shè)備和材料主要有：亨蓋特厭氧滾管機，恒溫培養(yǎng)箱，分析天平，燒杯，錐形瓶，干燥器，量筒，小燒杯，無菌培養(yǎng)皿，無菌吸管，酒精燈，移液管，pH試紙，厭氧試管等。

實驗所用藥品主要有：牛肉浸膏，胰蛋白胨，酵母浸膏，胰蛋白酶，瓊脂，L—半胱氨酸鹽，NaOH，NH4CI，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，CuSO4，F(xiàn)eSO4，H3BO3，CoSO4，Na2S，NaHCO3。

2 菌種來源

餐廚垃圾來自某高校食堂，主要成分是米飯、蔬菜、豬肉，用破碎機破碎后混合均勻。聯(lián)合發(fā)酵污泥取自某河流河底淤泥，接種物來自污水處理廠厭氧消化池。餐廚垃圾、聯(lián)合發(fā)酵污泥、厭氧接種物一起加入細口瓶中，至于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日，取上層消化液作為待研究樣品。

3 實驗方法

3.1 培養(yǎng)基的配制

配制瓊脂培養(yǎng)基200 mL，配方為：NH4Cl 0.2 g，酵母浸膏0.2 g，KH2PO40.08 g，K2HPO40.08 g，胰蛋白胨0.4 g，瓊脂4 g，無機鹽溶液10 mL，微量元素2 mL，超純水定容至200 mL。培養(yǎng)基煮沸10 min后通入無氧N2，驅(qū)氧10 min后加入L—半胱氨酸鹽0.1 g，分裝至厭氧試管中。

在每支瓊脂培養(yǎng)管中，用1 mL注射器分別加入硫化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)和碳酸氫鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)混合試劑0.1 mL、青霉素液0.1 mL、乙酸鈉(2.5 mol/L)0.1 mL、甲酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)0.1 mL、甲醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%)0.1 mL[4]。

3.2 樣品稀釋

取上述餐廚垃圾厭氧消化液進行稀釋，稀釋過程如下：

在錐形瓶中加入無菌水90 mL；取若干支試管分別加入9 mL無菌水，依次排列。

先用10 mL移液管取10 mL厭氧消化原液至錐形瓶中(內(nèi)裝有90 mL無菌水)，充分搖勻、打碎(約5 min)，即稀釋為10-1濃度。

接著用1 mL移液管取1 mL 10-1濃度的樣品至試管(內(nèi)裝有9 mL無菌水)中，充分搖勻,即稀釋為10-2濃度。依此方法進一步得到10-3,10-4稀釋度。

3.3 接種與培養(yǎng)

將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養(yǎng)基試管放置于50 ℃左右的恒溫水浴中，用1 mL無菌注射器分別吸取10-1,10-2,10-3,10-4稀釋度的稀釋液各0.1 mL于融化了的瓊脂培養(yǎng)基試管中，蓋緊試管蓋子后將其平放于厭氧滾管機上迅速滾動，這樣帶菌的培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成瓊脂薄膜。每個稀釋度重復(fù)3次。將厭氧試管置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(見圖1)。培養(yǎng)10 d后，在厭氧管的瓊脂層內(nèi)長出肉眼可見的菌落(見圖2)。

3.4 革蘭氏染色

在潔凈的載玻片中央滴一小滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取少許上述所得厭氧管中的菌體，與玻片上的水滴混合均勻，并涂成薄的菌膜后固定。滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液進行初染，再滴加沙黃(番紅)溶液進行復(fù)染[5],水洗并干燥后采用顯微鏡進行鏡檢(油鏡，10×100倍)，得到結(jié)果見圖3。根據(jù)呈現(xiàn)的顏色判斷該菌屬革蘭氏陽性菌(G+細菌)。

4 結(jié)語

以餐廚垃圾厭氧消化液作為研究對象，將不同稀釋度的消化液接種在特定培養(yǎng)基上，采用亨蓋特(Hungate)厭氧滾管技術(shù)進行分離培養(yǎng)，得到厭氧菌落，經(jīng)革蘭氏染色及顯微鏡觀察確定為革蘭氏陽性菌。