馬 驕，陳奕環(huán)，楊成成，宋金奕，夏 巧，傅英姿

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

0 引言

手性是自然界的一種普遍現(xiàn)象。構(gòu)成生物體的基本物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等都是手性分子[1-2]。手性化合物與生命過(guò)程聯(lián)系緊密，不同構(gòu)型的手性異構(gòu)體在生物體內(nèi)的藥理作用、生理活動(dòng)、代謝過(guò)程等都有著明顯的差異，但由于手性對(duì)映異構(gòu)體有著相似的物化性質(zhì)，很難將其區(qū)分開，因此，發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏的手性識(shí)別方法至關(guān)重要[3-4]。酪氨酸(tyrosine,Tyr)作為一種非必需氨基酸，常被用作原料藥和食品添加劑，是酪氨酸酶單酚酶功能的催化底物，也是很多試劑藥物(比如抗生素、腎上腺素、多巴等)的合成前體。酪氨酸是最終形成優(yōu)黑素和褐黑素的主要原料，可減輕白癜風(fēng)癥狀，且與美白化妝品的研發(fā)息息相關(guān)[5-6]。作為一種手性氨基酸，酪氨酸具有D/L兩種構(gòu)型。L-Tyr在生命系統(tǒng)中有重要的作用，若缺乏L-Tyr可能會(huì)導(dǎo)致抑郁等心理疾病，但過(guò)量則會(huì)增加姐妹染色的交換幾率，從而致使遺傳性疾病的產(chǎn)生[7-8]。D-Tyr作為L(zhǎng)-Tyr的對(duì)映異構(gòu)體不天然存在，主要用于生化研究。手性氨基酸的研究有著重要的意義，現(xiàn)如今已經(jīng)有許多方法對(duì)酪氨酸對(duì)映體進(jìn)行檢測(cè)和手性識(shí)別，其中包括分子印跡[9]、質(zhì)譜法[10]、熒光法[11]和電化學(xué)[12]等方法。而電化學(xué)手性傳感器具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、選擇性好、操作便捷、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸發(fā)展成一種重要的手性識(shí)別方法[13]。

還原氧化石墨烯(rGO)是一種是由碳原子以sp2雜化方式連接而成的二維材料，具有大的比表面、高的導(dǎo)電性及生產(chǎn)的成本低等優(yōu)點(diǎn)，在納米技術(shù)、傳感器、電催化等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[13]。納米金屬合金具有獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，且在催化、生物傳感等領(lǐng)域表現(xiàn)出比單金屬納米材料更好的催化特性[14-15]。金鉑合金納米粒子(Au-PtNPs)呈現(xiàn)出良好的生物相容性和導(dǎo)電性并且具有較大的比表面積，作為電極修飾材料在電化學(xué)手性識(shí)別研究中有著好的應(yīng)用前景[16]。環(huán)糊精(CD)具有外緣親水內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)，能與許多分子形成包合物，常被用作手性選擇劑[17]。 而β-環(huán)糊精(β-CD)作為環(huán)糊精的衍生物之一，具有外親水、內(nèi)疏水的特殊性質(zhì)，使其可通過(guò)范德華力、疏水作用、氫鍵等分子間作用力選擇性地與目標(biāo)分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的主客體包合物，因此它具有很好的分子識(shí)別性能[18]。

該實(shí)驗(yàn)合成了金鉑納米合金與還原氧化石墨烯納米復(fù)合材料 (Au-PtNPs/rGO),并將其修飾于玻碳電極表面，隨后將手性選擇劑β-環(huán)糊精(β-CD)滴涂在上訴修飾電極表面，得到β-CD/Au-PtNPs/rGO修飾電極并研究了其對(duì)酪氨酸對(duì)映體的電化學(xué)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

四水氯金酸，六水氯鉑酸及硼氫化鈉購(gòu)買于Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,美國(guó))，D/L-酪氨酸，氧化石墨烯和β-環(huán)糊精分別購(gòu)自百靈威科技有限公司（中國(guó)，北京），納米先鋒試劑公司（中國(guó)，南京）和上海晶純生化科技股份有限公司（中國(guó)，上海）。工作緩沖溶液為0.1mol/L磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.4）制備的 5.0×10-3mol/L鐵氰化鉀溶液。其余化學(xué)試劑均為分析純，可直接使用無(wú)需進(jìn)一步純化。所有實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

所有電化學(xué)測(cè)試都在CHI440A電化學(xué)工作站（上海辰華，中國(guó)）上進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)三電極體系中，鉑絲電極做為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，玻碳電極和修飾過(guò)的玻碳電極均為工作電極。掃描電子顯微鏡照片由掃描電子顯微鏡S-4800（SEM，日立，日本）測(cè)得。

1.2 制備Au-PtNPs/rGO復(fù)合材料

還原石墨烯和金鉑納米復(fù)合材料的制備參照文獻(xiàn)方法并有稍許變動(dòng)[19]。具體操作如下：3 mg氧化石墨烯加入3mL水中，超聲0.5 h使其分散均勻，隨后將1mL六水氯鉑酸(1%)和1mL四水氯金酸(1%)加入到棕色的氧化石墨烯溶液中，在持續(xù)攪拌條件下，向上述混合溶液逐滴加入10mL新制備硼氫化鈉(0.48mol/L)溶液。室溫條件下，攪拌24 h。在反應(yīng)過(guò)程中可觀察到溶液顏色由淺棕色漸變?yōu)楹谏?，表明氧化石墨烯被成功還原。最后，反復(fù)多次離心分離所得溶液，并用二次蒸餾水洗滌晾干。所得產(chǎn)品標(biāo)記為Au-PtNPs/rGO。

1.3 傳感界面的制備

裸玻碳電極（GCE,Φ=4mm）分別用1.0、0.3和0.05 nm的Al2O3拋光粉打磨拋光，并依次在乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗5min，除去Al2O3粉末。自然晾干后取10μLAu-PtNPs/rGO分散液滴涂到干凈的玻碳電極表面，室溫下晾干。隨后，取相同量的0.5mg/mLβ-CD滴涂于上述修飾電極上，于室溫下晾干，備用。進(jìn)行測(cè)試時(shí)，修飾電極用二次蒸餾水沖洗以除去表面未作用的材料，于室溫下晾干使用。電極構(gòu)建示意圖如圖1所示。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 納米材料表征

圖1 傳感界面構(gòu)建過(guò)程圖Fig.1 Procedures for the preparation ofβ-CD/Au-PtNPs/rGO nanohybrids and the sensing platform

GO及Au-PtNPs/rGO復(fù)合納米材料的表面形貌可由掃描電子顯微鏡技術(shù)(SEM)進(jìn)行表征。圖2A為氧化石墨烯(GO)的SEM圖，從圖中可以看到GO表面有輕微起伏不平的皺紋，與已有文獻(xiàn)報(bào)道相符。將氯鉑酸、氯金酸和GO混合還原后(圖2B)，可發(fā)現(xiàn)在石墨烯片層上附著有大量的金鉑納米顆粒，且金鉑納米顆粒分散均勻。為進(jìn)一步表征Au-PtNPs/rGO復(fù)合納米材料上附著的Au-Pt納米顆粒，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了X-射線能譜 （EDX）對(duì)復(fù)合材料的金屬元素進(jìn)行了分析(圖2C)，結(jié)果證實(shí)金、鉑兩種金屬元素的存在，從而表明了Au-PtNPs/rGO復(fù)合納米材料的成功合成。

圖2 (A)GO,(B)Au-PtNPs/rGO的SEM形貌;(C)Au-PtNPs/rGO的EDX圖像Fig.2 SEM images of(A)GO,(B)Au-PtNPs/rGO and(C)EDX image of Au-PtNPs/rGO

2.2 不同修飾界面的電化學(xué)響應(yīng)

圖3 不同材料與工作溶液的電化學(xué)響應(yīng)：(a)裸玻碳電極，(b)Au-PtNPs/rGO，(c)β-CD/Au-PtNPs/rGOFig.3 CVs of different electrodes:(a)bare glassy carbon electrode,(b)Au-PtNPs/rGO and(c)β-CD/Au-PtNPs/rGO

采用循環(huán)伏安技術(shù)(CV)研究了不同界面在5 mmol/L的鐵氰化鉀緩沖溶液(pH=7.4)中的電化學(xué)行為(掃速 0.1 V/s，范圍-0.2V 到 0.6V)，圖 3記錄了每步修飾過(guò)程的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以看出裸玻碳電極呈現(xiàn)出一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰 (曲線a)，而Au-PtNPs/rGO修飾電極(曲線b)的峰電流比裸玻碳電極(曲線a)高，這是由于Au、Pt納米粒子和rGO具有良好的電子傳輸能力。由于β-CD阻礙電子傳遞，因此，β-CD/Au-PtNPs/rGO修飾電極(曲線c)的峰電流比Au-PtNPs/rGO修飾電極(曲線b)的低。這一結(jié)果也說(shuō)明了修飾電極的成功構(gòu)建。

2.3 傳感器界面對(duì)酪氨酸對(duì)映體的選擇性作用

應(yīng)用差分脈沖伏安 (DPV)技術(shù)測(cè)試了5 mmol/L酪氨酸(溶于0.25mol/L硫酸)對(duì)映體與不同修飾電極作用時(shí)的電化學(xué)行為。如圖4所示，酪氨酸對(duì)映體在0.8～1.0 V電位范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)氧化峰。在裸GCE(圖4A)上，D-酪氨酸(曲線a)和L-酪氨酸(曲線b)的電流響應(yīng)曲線幾乎重合，說(shuō)明裸GCE不能有效區(qū)分酪氨酸對(duì)映體。在Au-PtNPs/rGO/GCE(圖 4B)上，D-酪氨酸和 L-酪氨酸的氧化峰出現(xiàn)不明顯的細(xì)微差異，但在Au-PtNPs/rGO/GCE上酪氨酸對(duì)映體的峰電流相對(duì)裸GCE有明顯升高，這是由于Au-PtNPs/rGO復(fù)合材料促進(jìn)了電極表面的電子傳輸。在β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE修飾電極上(圖4C)，氧化峰出現(xiàn)了明顯的電流差異，且電流差（ΔIp=IpL-Tyr-IpD-Tyr）為9.5μA。這表明β-CD在對(duì)酪氨酸對(duì)映體的選擇作用中起著重要作用，且Au-PtNPs/rGO起到了促進(jìn)電子傳遞的作用，從而對(duì)酪氨酸對(duì)映體的選擇作用有信號(hào)放大的效果。并且從圖中可以看出， 相比于 D-Tyr，β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE對(duì)L-Tyr的選擇作用更強(qiáng)。

圖4 手性傳感界面對(duì)5mmol/L(a)D-Tyr和(b)L-Tyr的DPV響應(yīng)：(A)裸GCE，(B)Au-PtNPs/rGO/GCE，(C)β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCEFig.4 DPVsof5mmol/L(a)D-Tyrand(b)L-Tyron(A)bareGCE,((B)Au-PtNPs/rGO/GCE and(C)β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE

可能的機(jī)理設(shè)想如下：酪氨酸對(duì)映體與β-CD作用時(shí)，其分子可能被包絡(luò)在β-CD的疏水腔內(nèi)部[20]，由于Tyr對(duì)映體兩種構(gòu)型的空間結(jié)構(gòu)存在差異，致使它們與β-CD之間的作用力(如：范德華力、氫鍵等)不一樣，而L-Tyr可能跟β-CD的腔體大小更匹配，導(dǎo)致β-CD對(duì)L-Tyr具有更強(qiáng)的選擇作用。

2.4 線性

為了進(jìn)一步研究電流響應(yīng)與酪氨酸對(duì)映體濃度的關(guān)系，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行了β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE修飾電極與一系列濃度的酪氨酸對(duì)映體作用后的差分脈沖伏安測(cè)試。如圖5所示，在0.1 mmol/L至5.0mmol/L濃度范圍內(nèi)，D-Tyr（曲線 a）和 L-Tyr（曲線 b）的電流響應(yīng)值與其濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，且二者的線性方程分別為IpD-Tyr(μA)=(7.74±0.50)+(9.62±0.18)cD-Tyr(r2=0.9991)和 IpL-Tyr(μA)=(10.51± 1.11)+(10.91±0.39)cL-Tyr(r2=0.9946)。同時(shí)，在該濃度范圍內(nèi)，LTyr的電流響應(yīng)始終大于D-Tyr，由此說(shuō)明該傳感器可以在0.1mmol/L至5.0mmol/L濃度范圍內(nèi)用于酪氨酸對(duì)映異構(gòu)體的識(shí)別和檢測(cè)。

圖5 β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE對(duì)不同濃度酪氨酸對(duì)映體的DPV響應(yīng)：(a)D-Tyr，(b)L-TyrFig.5 Calibration curves of the stereos elective sensor for Tyrenantiomers discrimination:(a)D-Tyr and(b)L-Tyr

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)將β-CD自組裝在Au-PtNPs/rGO復(fù)合材料修飾的玻碳電極表面，構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的電化學(xué)傳感界面，并將其用于與D-Tyr與LTyr的手性識(shí)別研究。實(shí)驗(yàn)中由于D-Tyr和L-Tyr的空間結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致其與β-CD的作用程度不同，因此在DPV中得到不同的峰電流，從而可以進(jìn)行手性識(shí)別研究。該傳感器不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸對(duì)映體的選擇性識(shí)別，而且為其他手性氨基酸或手性小分子與β-CD的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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