李如意 ，林 也 ，魏艷霞 ，李 鑫 ，邵 峰 ，黃惠勇 ，秦裕輝 ，蔡 雄 ，劉平安 *，宋厚盼 *

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

冬蟲夏草對免疫抑制模型小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究

李如意1,2，林 也1，魏艷霞1，李 鑫1，邵 峰1，黃惠勇1，秦裕輝1，蔡 雄1，劉平安1,2*，宋厚盼1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

目的研究冬蟲夏草對免疫抑制模型小鼠的免疫功能調(diào)節(jié)作用。方法通過腹腔注射環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，觀察小鼠日常狀態(tài)、體質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)變化，全自動血液流變測試儀檢測血液免疫細胞改變，ELISA法檢測脾臟中IL-2、IL-6、TNF-α及INF-γ細胞因子含量變化。結果冬蟲夏草可改善免疫抑制小鼠日常狀態(tài)，提升體質(zhì)量、飲食飲水量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增多白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板的數(shù)量，提高IL-2、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量，以上指標與模型組比較，差異均具統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。結論冬蟲夏草對免疫抑制模型小鼠的免疫功能有促進作用。

冬蟲夏草；環(huán)磷酰胺；免疫功能

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis （Berk.） Sacc.)，又名夏草冬蟲、蟲草，是一種麥角菌科蟲草屬真菌，是寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體[1-2]。冬蟲夏草味甘，性溫，歸肺、腎經(jīng)，具有補腎益肺、止血化痰等功效，主要包含糖類、氨基酸、核苷酸、脂肪酸、無機元素、維生素等化學成分[3-4]。現(xiàn)代藥理學研究表明，冬蟲夏草具有顯著的降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化、抗炎等活性[5-6]。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是一種細胞毒性化療藥物，亦屬于烷化劑類的免疫抑制劑，是免疫毒理學中制備免疫抑制模型的常用藥物[7-8]。本課題組前期對CTX致小鼠免疫功能低下的給藥劑量(40、60、80、120、160 mg/kg) 進行了篩選 ， 結 果 表 明80 mg/kg劑量CTX誘導的小鼠免疫功能抑制模型最為理想。本研究采用80 mg/kg劑量的CTX制備小鼠免疫抑制模型，探討冬蟲夏草對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，旨在為冬蟲夏草臨床應用于提高機體免疫功能提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康的ICR小鼠（購自湖南斯萊克景達動物中心），雄性，體質(zhì)量15～18 g，合格證號：43004700017174。

1.1.2 試劑 注射用環(huán)磷酰胺 （批號14021925，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司），RIPA裂解液（批號P0013B，碧云天生物技術公司），IL-2、IL-6、TNF-α 及 INF-γ 細胞因子ELISA檢測試劑盒（批號201603，武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 受試藥物 將匹多莫德分散片（批號H140309，北京朗依制藥有限公司）研磨成粉，蒸餾水充分溶解，配制 5 mg/mL。將冬蟲夏草藥材（批號20120121，杭州華東制藥有限公司）研成細粉，加蒸餾水加熱攪拌，配制成 25 mg/mL的冬蟲夏草混懸液。稱取環(huán)磷酰胺粉末，加生理鹽水充分溶解、混勻配制得8 mg/mL的環(huán)磷酰胺藥液。

1.1.4 儀器 YP4100W型電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；5417R小型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；iMark型酶標儀，BIO-RAD公司；SA-6600型全自動血液流變測試儀，湖南蓉申科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模[9]健康雄性ICR小鼠40只，適應性喂養(yǎng)4 d后，隨機分成正常組、模型組、陽性藥組（匹多莫德組）和冬蟲夏草組4組，每組10只，自由進食、飲水。實驗期間每天固定時間點稱量小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠毛發(fā)、行為活動及精神狀態(tài)等日常體征。除正常組外，其余各組小鼠在第1、3、5天進行給藥造模，以80 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺藥液，正常對照組則腹腔注射生理鹽水。

1.2.2 干預方法 自實驗第1天，陽性藥組灌胃給予匹多莫德藥液(100 mg/kg)，冬蟲夏草組灌胃給予冬蟲夏草藥液0.5 g/(kg·d)，正常組和模型組則給予等體積的蒸餾水，連續(xù)干預7 d。

1.3 指標檢測

1.3.1 一般狀態(tài) 每天早上于固定時間點測定各組小鼠的飲食量、飲水量、體質(zhì)量，觀察小鼠外觀、精神狀態(tài)等變化情況。

1.3.2 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)測定 小鼠末次給藥后12 h，禁食不禁水，稱量體質(zhì)量、眼球采血后，脫頸處死，剖取胸腺和脾臟，濾紙吸取表面殘血及多余水分，稱取濕重，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.3.3 血細胞檢測 小鼠于末次給藥后禁食不禁水12 h，眼球取血，采用EDTA-K2抗凝血，全自動生化分析儀檢測血細胞。

1.3.4 細胞因子檢測 取小鼠脾臟剪碎、研磨，裂解液裂解30 min后以12 000 r/min于4℃離心5 min，將上清液移入新的EP管中，分裝凍存入-80℃冰箱。取上清液置于37℃水浴快速融解，嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法操作檢測 IL-2、IL-6、TNF-α及INF-γ細胞因子含量。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 各組小鼠的一般狀態(tài)

2.1.1 一般表現(xiàn) 與正常組比較，模型組小鼠毛發(fā)干枯、色澤暗淡、脫毛，在第6天均出現(xiàn)豎毛情況；小鼠扎堆，活動減少，精神倦怠。給予冬蟲夏草后，小鼠的毛發(fā)干枯、色澤暗淡、脫毛情況均明顯改善，無豎毛情況出現(xiàn)，小鼠扎堆減少，活動、精神等狀態(tài)與正常組小鼠無明顯差別。

2.1.2 各組小鼠體質(zhì)量的變化 與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量從第2天開始明顯下降(P＜0.01)，一直延續(xù)降至第6天；冬蟲夏草可使免疫抑制小鼠體質(zhì)量增加，在給藥的第6天，冬蟲夏草組小鼠體質(zhì)量明顯提升，與模型組比較P＜0.05。見表1。

表1 各組小鼠的體質(zhì)量 (g，±s，n=10)

表1 各組小鼠的體質(zhì)量 (g，±s，n=10)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組匹多莫德組冬蟲夏草組F P 1 d 25.57±1.07 23.90±1.22**23.97±1.10 24.17±0.90 0.29 0.83 2 d 25.57±1.37 23.97±1.19**24.29±1.14 24.55±1.33 2.93 0.047 4 d 27.67±1.89 24.31±1.46**25.10±1.16 25.43±1.37 9.00 0.00 6 d 29.89±2.00 24.41±1.69**25.86±1.09#26.09±1.10#23.11 0.00

2.1.3 各組小鼠飲食飲水量的改變 與正常組比較，模型組小鼠的平均飲食飲水量均明顯減少 (P＜0.01)；冬蟲夏草可使模型小鼠飲食飲水量均顯著提升(與模型組比較，P＜0.05 或 P＜0.01)。 見表 2。

2.2 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的比較

與正常組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯降低(P＜0.01)；給予冬蟲夏草后，與模型組比較（P＜0.05）。小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05），見表 2。

2.3 各組小鼠血細胞主要指標的比較

與正常組比較，模型組小鼠的白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板等血細胞均明顯減少(P＜0.05或 P＜0.01)；與模型組比較，冬蟲夏草組小鼠的白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板數(shù)量均明顯升高 (P＜0.05或P＜0.01)。 見表 3。

表2 各組小鼠的飲食飲水量和臟器指數(shù) (±s，n=10)

表2 各組小鼠的飲食飲水量和臟器指數(shù) (±s，n=10)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組匹多莫德組冬蟲夏草組F P飲食量/g 5.83±0.34 3.99±041**4.62±0.29##4.88±0.23##27.78 0.00飲水量/g 7.16±0.57 4.44±0.48**5.46±0.43#5.51±0.51#20.59 0.00胸腺指數(shù)/mg·g-1 2.36±0.32 0.56±0.14**0.79±0.19#0.80±0.25#116.70 0.00脾臟指數(shù)/mg·g-1 3.96±0.54 2.35±0.59**2.82±0.44#2.92±0.44#17.49 0.00

表3 各組小鼠血液主要指標的比較 (±s，n=10)

表3 各組小鼠血液主要指標的比較 (±s，n=10)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組匹多莫德組冬蟲夏草組F P白細胞×109·L-1 5.00±0.71 1.26±0.14**1.72±0.39#1.72±0.42#124.2 0.00中性粒細/×109·L-1 0.57±0.40 0.02±0.00*0.16±0.05##0.08±0.02##10.07 0.00淋巴細胞/×109·L-1 4.35±0.76 1.08±0.16**1.52±0.19##1.45±0.14#105.6 0.00紅細胞/×1012·L-1 9.26±0.43 7.10±0.44**8.53±0.45#7.56±0.42#39.7 0.00血紅蛋白濃度/g·L-1 154.33±6.14 115.53±6.73**123.10±5.63#122.00±6.82#69.2 0.00血小板/×109·L-1 1279.11±279.51 763.75±124.49**972.30±164.83#949.60±200.00#10.6 0.00

2.4 各組小鼠細胞因子含量的比較

與正常組比較，模型組 IL-2、IL-6、TNF-α 及IFN-γ含量明顯下降(P＜0.01)；與模型組比較，冬蟲夏草顯著提高了這些細胞因子的含量（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠細胞因子含量的比較 (±s，n=10)

表4 各組小鼠細胞因子含量的比較 (±s，n=10)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組匹多莫德組冬蟲夏草組F P IL-2/pg·mL-1 2008.90±171.02 1665.47±122.74**1829.54±135.95#1803.48±150.88#9.29 0.00 IL-6/pg·mL-1 81.54±8.13 59.91±8.18**68.34±7.59#67.51±7.03#12.99 0.00 TNF-α/ng·L-1 502.94±38.74 403.97±32.73**441.00±33.36#436.65±32.19#13.91 0.00 IFN-γ/ng·L-1 1330.97±116.60 1102.22±109.38**1234.80±115.94#1208.01±104.97#6.70 0.001

3 討論

胸腺是T細胞發(fā)育和成熟的重要器官，脾臟是最大的外周淋巴器官，富含T細胞、B細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)能比較客觀反映免疫器官的發(fā)育和免疫細胞的功能狀況，是機體非特異性免疫的一個方面[10]4-10。本研究中，模型組小鼠在注射環(huán)磷酰胺后的第6天出現(xiàn)明顯不同于正常小鼠的體征，體質(zhì)量減輕，飲食飲水量減少，解剖后發(fā)現(xiàn)小鼠的脾臟與胸腺明顯縮小，這些體征狀態(tài)的變化可直觀反映出小鼠免疫功能下降。而給予冬蟲夏草后發(fā)現(xiàn)，小鼠的毛發(fā)、精神等狀態(tài)有所恢復，體質(zhì)量增加，飲食飲水增多，脾臟與胸腺均增大，說明冬蟲夏草可改善小鼠免疫功能低下的情況。

白細胞（包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞等）為固有免疫細胞，在免疫系統(tǒng)中具有重要作用，可直接反映機體免疫功能的水平[10]59-62；紅細胞參與機體免疫調(diào)控，1953年有學者已發(fā)現(xiàn)紅細胞有促進白細胞吞噬作用，具有黏附免疫復合物的功能，是機體對病原體防御的重要部分[11]；血小板是血液中數(shù)量最多的具有免疫功能的細胞，研究表明，血小板參與炎性病變。此外，血小板觸發(fā)補體級聯(lián)反應，促進吞噬細胞的清除作用，亦可通過直接或間接地趨化吸引吞噬細胞，進而實現(xiàn)對病原體的清除[12]。IL-2除了能刺激 T淋巴細胞生長外，也可使NK細胞激活、分化及增殖，亦可促進B細胞增殖及分泌抗體。IL-6在多種細胞功能調(diào)節(jié)方面具有重要的作用，其作用表現(xiàn)為促進B、T淋巴細胞增殖分化。TNF-α可使白細胞在炎癥局部聚集，刺激單核細胞、血管內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生細胞因子，被公認為是一種促炎細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)。IFN-γ具有干擾病毒感染和復制、激活巨噬細胞、活化T細胞和NK細胞，調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等功能[10]32-37。本實驗通過檢測這些免疫細胞數(shù)量和細胞因子的含量，探討冬蟲夏草對小鼠的免疫功能的影響。實驗結果顯示，冬蟲夏草可使這些免疫細胞數(shù)量增多，細胞因子含量提升，與模型組存在明顯差別，表明冬蟲夏草具有增強機體特異性與非特異性免疫的功能的作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，疾病的發(fā)生通常伴隨著免疫功能低下情況。免疫功能低下是由于免疫系統(tǒng)功能失調(diào)而導致機體對于病原微生物及其毒素的侵襲不能發(fā)揮正常的保護作用，致使機體易感染而患病。目前對免疫低下患者主要采用一些細胞因子、T細胞調(diào)節(jié)劑等治療，但因副作用大而在臨床上使用受限。本實驗研究了冬蟲夏草對免疫抑制模型小鼠免疫功能的影響，結果提示冬蟲夏草能改善小鼠的免疫功能抑制情況，促進機體的非特異性和特異性免疫功能，其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用可能與其含有多糖和蟲草素等有效活性成分有關，其機制尚待進一步研究。本研究可為冬蟲夏草應用于臨床防治免疫系統(tǒng)疾病提供科學依據(jù)。

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Effect of Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.in Regulating Immune Function of Immunosuppressive Model Mice

LI Ruyi1,2,LIN Ye1,WEI Yanxia1,LI Xin1,SHAO Feng1,HUANG Huiyong1,QIN Yuhui1,CAI Xiong1,LIU Pingan1,2*,SONG Houpan1*
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostic and Therapeutic Research in Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study the immunological function regulation of Cordyceps sinensis in immunosuppressive mice model.MethodsImmunosuppressive mice model was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide.Mouse daily state,body weight,thymus index and spleen index were observed,blood immune cells was detected by automatic hemorheology tester,the content of IL-2,IL-6,TNF-α and INF-γ in the spleen were analysed by ELISA.ResultsCordyceps sinensis can improve the rice daily state;increase body weight,drinking water,thymus index and spleen index;increase the number of leukocytes,neutrophils,lymphocytes,erythrocytes,hemoglobin and platelets;increase the content of IL-2,IL-6,TNF-α and IFN-γ.The above indicators had significant differences,compared with the model group (P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionCordyceps sinensis can enhance the immune function in immunosuppressive model mice.

Cordyceps sinensis;cyclophosphamide;immune function

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.12.005

本文引用：李如意，林 也，魏艷霞，李 鑫，邵 峰，黃惠勇，秦裕輝，蔡 雄，劉平安，宋厚盼.冬蟲夏草對免疫抑制模型小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（12）：1316-1319.

2017-01-14

湖南省科技重大專項(2014FJ1007)；湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程醫(yī)學學科骨干人才培養(yǎng)對象項目；湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷國家重點學科開放基金項目(2015ZYZD16),(2015ZYZD19)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(15B179)；湖南省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(201780)。

李如意，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎研究。

* 劉平安，男，副教授，博士，E-mail:liupa@hnctcm.edu.cn；宋厚盼，男，講師，E-mail:songhp@hnctcm.edu.cn。

（本文編輯 楊 瑛）