【摘要】：目前微生物制藥作為一種技術(shù)被人們漸漸重視。微生物也在很多制藥中起了關(guān)鍵性的作用，不僅節(jié)約了成本、還提高了效率。例如紫杉醇：紫杉醇是細(xì)胞有絲分裂抑制劑，被用于癌癥治療（主要是卵巢癌和乳腺癌）。原始得到紫杉醇的方法就是從紅豆杉科植物紅豆杉的干燥根、枝葉以及樹皮中提取，因此給紅豆杉帶來了滅頂之災(zāi)。使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇就解決了這個(gè)歷史的難題。

【關(guān)鍵詞】：微生物制藥；紫杉醇；紅豆杉；微生物發(fā)酵法

目前微生物制藥作為微生物學(xué)一個(gè)比較熱門的分支被人們所熟知。微生物制藥就是微生物在其生命活動過程中產(chǎn)生的，能以極低濃度抑制或影響其他生物機(jī)能的低分子量代謝物。微生物制藥利用微生物技術(shù)，通過高度工程化的新型綜合技術(shù)，以利用微生物反應(yīng)過程為基礎(chǔ)，依賴于微生物機(jī)體在反應(yīng)器內(nèi)的生長繁殖及代謝過程來合成一定產(chǎn)物，通過分離純化技術(shù)進(jìn)行提取精制，并最終制劑成型來實(shí)現(xiàn)藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)。

1.紫杉醇的簡介

紫杉醇是美國北卡羅萊納州三角研究所的Wall博士和Wani博士于1967年發(fā)現(xiàn)的。之后，他們又從太平洋紅豆杉中分離出了這種化合物并發(fā)現(xiàn)它具有廣泛的抗惡性腫瘤作用。因?yàn)橥ㄟ^Zemplen醇解作用紫杉醇可被分解成可結(jié)晶的兩部分，在1970年這兩位三角研究所的科學(xué)家通過X射線衍射分析并測定了其結(jié)構(gòu)，并在1971年發(fā)表了這一研究成果。

1.1紫杉醇的物理化學(xué)性質(zhì)

化學(xué)名稱 ： 5β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯] [1]

分子式 ： C47H51NO14

分子量 ： 853.92

物理性質(zhì) ： 白色結(jié)晶體粉末。無臭，無味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。

醫(yī)學(xué)用途：被用于癌癥治療（主要是卵巢癌和乳腺癌）。

1.2藥理作用

真核細(xì)胞的一種組成成分是微管。在一般狀態(tài)下，微管和微管蛋白二聚體之間有一種微妙的動態(tài)平衡。紫杉醇可以使這二者之間失去平衡，促進(jìn)和誘導(dǎo)微管蛋白聚合，使微管穩(wěn)定。這一系列動作導(dǎo)致細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂時(shí)不能形成紡錘體和紡錘絲，抑制了細(xì)胞分裂和增殖，從而對抗腫瘤起到作用。

體外研究表明，紫杉醇濃度依賴性的、可逆性地結(jié)合在微管上，尤其是結(jié)合到N端微管蛋白的P亞基上，這一作用使聚合所需的微管蛋白的濃度降低了，使動態(tài)平衡向著微管裝配的方向移動，增加微管聚合的速率和產(chǎn)量。紫杉醇誘導(dǎo)形成的微管較短，并且比不用紫杉醇時(shí)正常形成的微管屈曲性約大十倍。紫杉醇以1：1的比例結(jié)合到微管上，表明藥物在微管上只有一個(gè)結(jié)合部位。另外，紫杉醇抑制有絲分裂所必需的微管網(wǎng)的正常動態(tài)再生，防止正常的有絲分裂紡錘體的形成，導(dǎo)致染色體的斷裂，并抑制細(xì)胞的復(fù)制，可阻斷細(xì)胞于細(xì)胞周期G2和M期，使癌細(xì)胞復(fù)制受阻斷而死亡。

1.3來源

來源：紅豆杉科植物紅豆杉的干燥根、枝葉以及樹皮。

如果單純以紅豆杉作為提取紫杉醇的原料的話，每提取一公斤的紫杉醇就需要活剝10噸樹皮[2]。而且紅豆杉的生長十分緩慢，差不多上百年才能成材，我國曾在20世紀(jì)90年代大肆砍伐紅豆杉，使野生紅豆杉差不多滅絕。然而紅豆杉作為一種再生時(shí)間較長的植物，其總又量是非常有限的。因此，采用其他方式代替是非常重要的。

2.紫杉醇制取方法

2.1天然萃取法

將大量的原料投入提取罐內(nèi)，再加甲醇浸提，循環(huán)浸提完成后，將浸提液排入浸提液儲罐中，經(jīng)蒸汽吹渣、濃縮等工藝后進(jìn)行萃取。再次濃縮后蒸發(fā)干燥，取出產(chǎn)品，涼干，敲碎，經(jīng)檢驗(yàn)合格后即成為紫杉醇浸膏，用鐵桶封裝，入庫陰涼保存。但是需要大批量的原料，對珍惜木材紅豆杉的傷害大。

2.2人工合成法

紫杉醇的分子式為：C47H51NO14是萜類環(huán)狀結(jié)構(gòu)的天然次生代謝物。主要由紫杉烷環(huán)和側(cè)鏈組成。研究其生物合成，對于人為定向的提高合成效率及克隆組合，形成關(guān)鍵的酶的基因，提高紫杉醇的產(chǎn)量意義重大。但是目前還沒有找到一些起關(guān)鍵作用的酶。

2.3半人工合成法

從紅豆杉植物中分離得到的10---去乙酰漿果赤霉素Ⅲ （巴卡亭Ⅲ），顯然活性低于紫杉醇，但可以從紅豆杉針葉中提取。該物質(zhì)經(jīng)過四步化學(xué)過程可合成紫杉醇。為解決紫杉醇新來源途徑，取得重大進(jìn)展。以NICOLAOU博士為首的美國研究小組在1994年報(bào)道通過化學(xué)方法全合成紫杉醇的結(jié)果。但化學(xué)合成從實(shí)質(zhì)意義上說還沒有取得徹底的突破，目前還不具備應(yīng)用價(jià)值。

2.4微生物發(fā)酵法

STTERLE等從短葉紅豆杉韌皮部分， 分離得到一種寄生真菌（taxo myces an dreanae）.可以在特定的培養(yǎng)基中產(chǎn)生紫杉醇及相關(guān)烴合物。為紫杉醇的制備開辟了一條新的道路。

3.實(shí)驗(yàn)室微生物發(fā)酵法制紫杉醇的具體流程

實(shí)驗(yàn)材料：紅豆杉樹皮

實(shí)驗(yàn)步驟：

3.1內(nèi)生真菌的分離

3.1.1對植物組織表面進(jìn)行消毒，以控制其表面真菌的生長，使內(nèi)生菌得以分離。其分離方法是先用水沖洗以剪碎的植物材料，然后在75%乙醇中浸泡3min后，最后用無菌水沖洗。

3.1.2分離所用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。為了防止細(xì)菌污染可在培養(yǎng)基中加抗菌素，如鏈霉素、四環(huán)素等。恒溫箱中28℃培養(yǎng)3-4d后觀察。（在分離內(nèi)生真菌時(shí)常添加一些宿主植物的提取液，以滿足內(nèi)生真菌的一些特殊的營養(yǎng)需求）

3.2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存

待培養(yǎng)基上初步長出菌落后，選擇長勢較好的菌落，挑取菌絲到PAD平板上純化，根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法鑒定菌種。純化的菌株在PAD斜面4℃下保存、備用。

3.3發(fā)酵培養(yǎng)（關(guān)鍵步驟）

從PAD平板上切取5mm×5mm小塊菌落，接種至裝有150ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于28℃，100r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10-14d.

3.4發(fā)酵產(chǎn)物的處理

紫杉醇的提取、純化、含量測定。常用的有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、 乙酸乙酯等。

提取原則：能夠充分萃取出發(fā)酵液和菌絲中的紫杉醇。

4.優(yōu)劣分析

4.1優(yōu)勢

（1）內(nèi)生菌存活繁殖能力強(qiáng)：內(nèi)生真菌可以在簡單的培養(yǎng)基上得到良好生長

（2）發(fā)酵產(chǎn)物多：產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物

（3）發(fā)酵周期短：一般在兩周左右

（4）可操控性強(qiáng)：可以在生物反應(yīng)器中人為控制各種參數(shù)

（5）菌種性能選擇性強(qiáng)：可以通過誘變育種等手段來提高菌種性能

4.2劣勢

（1）缺乏良好的合適發(fā)酵的工業(yè)菌株。

（2）由于發(fā)酵條件的限制，單位培養(yǎng)液中紫杉醇的含量低。

（3）目前依然停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒有用于工業(yè)制藥。

5.近期突破及期望

通過研究還發(fā)現(xiàn)：根是除樹皮外紫杉醇含量最高的器官。人們利用發(fā)根農(nóng)桿菌（agrobac terium rhizogenes ）浸然紅豆杉植物外植體誘導(dǎo)生根。這一辦法不需外援激素，發(fā)根生長迅速，遺傳性狀穩(wěn)定而受到重視。如能把尋找合成紫杉醇或其類似衍生物，從微生物合成途徑中，定向得到關(guān)鍵酶和克隆紅豆杉相關(guān)基因結(jié)合起來，可使這一方法得到突破。

參考文獻(xiàn)：

[1]林福呈，劉小紅，王洪凱.等；紫杉醇及其產(chǎn)生菌的研究現(xiàn)狀與展望；《微生物學(xué)報(bào)》， 2003，43（4）：534-538.

[2]李志良，駱雪蘭.等；從中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中分離鑒定紫杉醇[J]；天然產(chǎn)物研究與開發(fā)；2003年05期.

[3]周東坡，平文祥，孫劍秋.等；紫杉醇產(chǎn)生菌分離的研究；《微生物學(xué)雜志》 ， 2001，21（1）：18-19.

[4]王建鋒，呂華鷹，蘇文金.植物內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究；《微生物學(xué)通報(bào)》 ， 2000，27（1）：58-60.