楊豐源 沈陽(yáng)科技學(xué)院

甘草細(xì)胞生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)的探討

楊豐源 沈陽(yáng)科技學(xué)院

當(dāng)今社會(huì)，生物反應(yīng)器的種類(lèi)越來(lái)越多，對(duì)于不同種類(lèi)的植物，要采取不同的植物組織培養(yǎng)體系，設(shè)計(jì)適合這種植物的生物反應(yīng)器，從而達(dá)到預(yù)期的培養(yǎng)效果。本文簡(jiǎn)單的介紹了甘草細(xì)胞在生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程，包括前期材料的準(zhǔn)備，以及培養(yǎng)液中殘?zhí)堑臏y(cè)定，得出了甘草細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)等相關(guān)結(jié)論，以供甘草細(xì)胞的生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)提供參考。

甘草細(xì)胞 生物反應(yīng)器 殘?zhí)?/p>

甘草的藥用在世界范圍內(nèi)有著悠久歷史，而中國(guó)對(duì)于甘草的采集和藥用歷史更是長(zhǎng)達(dá)將近五千年之久。甘草在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著很高的地位，根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論的相關(guān)記載，甘草可以使其他中草藥的藥用功效得到加強(qiáng)，所以在幾乎所有的中醫(yī)藥方成分里都存在甘草。目前，由于甘草資源的減少，甘草行業(yè)面臨著巨大的挑戰(zhàn)，利用植物的組織培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)甘草進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)工作迫在眉睫。

1.材料和方法

1.1 前期材料的準(zhǔn)備

甘草懸浮細(xì)胞系需要經(jīng)過(guò)四次的懸浮繼代培養(yǎng)，所培養(yǎng)出來(lái)的第四代甘草細(xì)胞可作為接種材料，應(yīng)用在生物反應(yīng)器之中，并選用自行研發(fā)設(shè)計(jì)出的連續(xù)攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)甘草細(xì)胞的放大培養(yǎng)，同時(shí)還要選取已經(jīng)除去連續(xù)給養(yǎng)系統(tǒng)之外的相同類(lèi)型的生物反應(yīng)器進(jìn)行甘草細(xì)胞的培養(yǎng)。在對(duì)照培養(yǎng)方面，則要選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的搖瓶式培養(yǎng)。從甘草細(xì)胞進(jìn)行接種的第一天開(kāi)始，每隔三天進(jìn)行一次取樣，一直持續(xù)到培養(yǎng)工作完成為止。所取的樣品要放在低溫的環(huán)境中保存，以用于對(duì)培養(yǎng)液底物中糖、銨根離子、磷酸根離子、硝酸根離子濃度的測(cè)定。在每次進(jìn)行取樣的同時(shí)，還要使用JPBJ-608測(cè)定培養(yǎng)液的溶氧值，使用PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH值。所取的樣品在經(jīng)過(guò)低溫離心處理之后，上層清液要收集并加以保存，下層使用濾膜進(jìn)行真空抽濾處理，稱(chēng)量出樣品的濕重，然后使用60攝氏度的烘箱烘烤24小時(shí)至恒重狀態(tài)，稱(chēng)量出樣品的干重。

1.2 培養(yǎng)液中殘?zhí)堑臏y(cè)定

測(cè)定培養(yǎng)液中糖的殘余量，首先要制備出標(biāo)準(zhǔn)曲線。取出50mg經(jīng)過(guò)干燥處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，向其中加水使其成為1.0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。從中精密量取出0.1mL～1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)液，并放置在10mL的容量瓶中，使用蒸餾水將其稀釋到刻度線位置，搖勻之后精密取出1mL，放到刻度試管里，然后加5%苯酚液約1mL和5mL的濃硫酸，在室溫狀態(tài)放置40分鐘，以1mL的蒸餾水、1mL的苯酚液、5mL的濃硫酸混合液根據(jù)上述的操作做空白。在UV-2201紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，在490nm處測(cè)定出吸收度，對(duì)所測(cè)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，回歸方程是Y=9.533x-0.0141(R2=0.9916)。

2.結(jié)果與討論

2.1 甘草細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

在液體培養(yǎng)基里面添加生長(zhǎng)激素及褐化抑制劑的過(guò)程中，甘草懸浮細(xì)胞可以安全存活和生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)的速度很快。同固體培養(yǎng)基中愈傷組織的生長(zhǎng)情況相比，懸浮培養(yǎng)方式的延滯期要短很多。在固體培養(yǎng)基內(nèi)，愈傷組織在生長(zhǎng)時(shí)由于和培養(yǎng)基的接觸面積相對(duì)較小，其傳質(zhì)的效率較低；而懸浮培養(yǎng)時(shí)的傳質(zhì)效率則要比愈傷組織高很多，其延滯期也相對(duì)較短。在搖瓶培養(yǎng)方式和生物反應(yīng)器的批量培養(yǎng)方式中，隨著懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的進(jìn)行，細(xì)胞的生物量也在不斷增加，在培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)元素也會(huì)大量消耗掉，溶氧量越來(lái)越少，同時(shí)由于細(xì)胞在生長(zhǎng)中逐漸出現(xiàn)破裂、消亡等狀況，培養(yǎng)到后期之后存活的細(xì)胞生物量也會(huì)大量下降。

2.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)

細(xì)胞培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基在滅菌過(guò)程中，蔗糖由于受熱會(huì)分解成葡萄糖和果糖，之后果糖會(huì)再次轉(zhuǎn)化成葡萄糖，最終都是以葡萄糖的存在形式被植物細(xì)胞給吸收和利用。葡萄糖在進(jìn)入到植物細(xì)胞中之后，一部分會(huì)成為細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成部分，另一部分會(huì)由于呼吸作用成為能源和碳源以供細(xì)胞生命活動(dòng)所用。在搖瓶培養(yǎng)和反應(yīng)器分批培養(yǎng)的前21天，糖會(huì)逐漸被甘草細(xì)胞在代謝和生長(zhǎng)過(guò)程中所吸收和消耗，細(xì)胞生物量會(huì)隨之增加，培養(yǎng)基中的糖濃度也會(huì)隨之減少，這些都體現(xiàn)出了碳源的重要性。造培養(yǎng)21天之后，糖的濃度開(kāi)始呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這是由于部分細(xì)胞發(fā)生了自溶所導(dǎo)致的。在反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)灌注的培養(yǎng)中，糖濃度會(huì)在第六天到第十八天有一定幅度的降低，這說(shuō)明這個(gè)時(shí)間段內(nèi)糖的代謝速率在加快，這和甘草細(xì)胞生物量在快速積累有關(guān)。

綜上所述，這種以過(guò)程的變量和參數(shù)恒定不變作為培養(yǎng)目的的操作方式，在甘草細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中能夠以改變影響細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分組成來(lái)對(duì)細(xì)胞代謝的活性變化和組成進(jìn)行研究，這種穩(wěn)定形態(tài)的甘草細(xì)胞也能根據(jù)質(zhì)量的平衡來(lái)給培養(yǎng)過(guò)程中反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的速率及參數(shù)測(cè)定提供便捷。研究人員們需要繼續(xù)在甘草細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)工作進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，從而給甘草的大規(guī)模生產(chǎn)提供幫助。

[1]李雅麗，孟婷婷，王毛毛，李曉雪，李蓉蓉，郭曉強(qiáng).甘草細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的放大培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51(03):302-306.(2015-03-24)[2017-08-17].

[2]郭松波.甘草細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)及活性成分分析[D].天津科技大學(xué)，2013