[摘 要] 本文以玉米種子成熟胚為外植體進行組織培養(yǎng)，通過對外植體不同切割方式、不同碳源、不同培養(yǎng)基及不同激素的對比分析，建立一套最優(yōu)的再生遺傳轉(zhuǎn)化體系，最終成功誘導(dǎo)出二倍體愈傷組織，并長成為二倍體植株。

[關(guān)鍵詞] 玉米；組織培養(yǎng)；再生體系；愈傷組織

[中圖分類號] S513 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-7909（2017）32-68-2

玉米是主要的糧食和飼用作物，在食品和化工行業(yè)占有重要地位。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，人們欲利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高產(chǎn)量、高品質(zhì)、抗蟲害的玉米新品種。用玉米成熟胚為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，不受季節(jié)影響，獲得植株快速，取材方便，而且外植體大小合適，是適合于玉米遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系[1]。

本文以玉米種子成熟胚為外植體進行組織培養(yǎng)，通過對外植體不同切割方式、不同碳源、不同培養(yǎng)基及不同激素的對比分析，預(yù)建立一套玉米最優(yōu)的再生遺傳轉(zhuǎn)化體系，為玉米轉(zhuǎn)基因及基因功能的研究奠定良好基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取玉米種子成熟胚為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗材料處理。一是浸泡處理，即在無菌水中浸泡3 d；二是種子處理，即種子切分成芽鞘和根鞘為外植體；三是溫度處理，即先將種子置于低溫4 ℃下存放36 h，而后轉(zhuǎn)入高溫34 ℃下誘導(dǎo)3 d。

1.2.2 外植體培養(yǎng)。將外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，無光、25 ℃培養(yǎng)20 d，隨后取出進行繼代培養(yǎng)，并記錄。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，25 ℃、光照2 700～3 000 l x下培養(yǎng)20 d后進行統(tǒng)計；最后將再生植株移至壯苗培養(yǎng)基上，生根后移植即可。

1.2.3 種子切割方式。種子切割方式為橫切和縱切。

1.2.4 碳源的選用。碳源選用麥芽糖和蔗糖。

1.2.5 激素的選用。試驗中選用2，4-D和NAA 2種激素。

1.2.6 愈傷組織的繼代、分化培養(yǎng)。將初代愈傷組織移至繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d，3個周期后挑選最優(yōu)愈傷組織置于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 切割方式對誘導(dǎo)愈傷組織的影響

種子橫切和縱切，誘導(dǎo)率分別為69%和31%?？梢姡瑱M切種子誘導(dǎo)不完全，不易形成愈傷組織，不易脫分化；而縱切種子誘導(dǎo)完全，易形成愈傷組織，容易脫分化。所以，種子縱切方式適合誘導(dǎo)愈傷組織。

2.2 碳源對誘導(dǎo)愈傷組織的結(jié)果

通過不同碳源對愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)可見，N6M培養(yǎng)基出愈塊數(shù)為32，胚性愈傷組織為17，胚愈率為53.1%；MS培養(yǎng)基出愈塊數(shù)為35，胚性愈傷組織為19，胚愈率為54.2%；N6M培養(yǎng)基出愈塊數(shù)為29，胚性愈傷組織為13，胚愈率為44.8%；MSM培養(yǎng)基出愈塊數(shù)為42，胚性愈傷組織為24，胚愈率為57.1%。說明N6M培養(yǎng)基對誘導(dǎo)胚性愈傷組織現(xiàn)象明顯，胚愈率最低，同時也說明麥芽糖作為碳源更適合誘導(dǎo)愈傷組織。

2.3 培養(yǎng)基對誘導(dǎo)愈傷組織的結(jié)果

通過LS、MS、N6 3種培養(yǎng)基對比試驗，結(jié)果顯示：選用的85個全胚中，N6M培養(yǎng)基中出現(xiàn)42個胚性愈傷組織，出愈率為49.4%，愈傷組織生長迅速，胚性超強；MSM培養(yǎng)基中出現(xiàn)17個胚性愈傷組織，出愈率為20.0%，愈傷組織胚性強；N6培養(yǎng)基中出現(xiàn)33個胚性愈傷組織，出愈率為38.8%，愈傷組織慢速生長，胚性弱。所以，N6M培養(yǎng)基最適合誘導(dǎo)。

2.4 激素對誘導(dǎo)愈傷組織的結(jié)果

2.4.1 2，4-D誘導(dǎo)全胚愈傷組織分化的結(jié)果。在全胚數(shù)為24的情況下，2，4-D濃度在2.0 mg/L時，其胚性愈傷組織數(shù)最多7塊，愈胚率為29.15%；當(dāng)2，4-D濃度從2.0 mg/L增加到2.5 mg/L時，愈胚率為25%。說明不同濃度的2，4-D影響外植體愈傷組織繼代培養(yǎng)，但各濃度間褐化率差別不大。本文選擇濃度在2.0 mg/L的2，4-D，較適合全胚愈傷組織的繼代培養(yǎng)，且濃度在0.0 mg/L時，愈傷組織的褐化率最高為75.0%，說明2，4-D濃度升高會抑制愈傷組織的褐化。

2.4.2 NAA誘導(dǎo)全胚愈傷組織分化的結(jié)果。本文將愈傷組織在NAA中誘導(dǎo)處理后，色澤變黃，呈現(xiàn)小粒狀。在胚性愈傷塊數(shù)為20的情況下，NAA濃度為0.4 mg/L時，全胚愈傷組織的分化率為15%；NAA濃度增加到0.5 mg/L時，其分化率為25%。說明分化率越大，愈傷組織分化培養(yǎng)的現(xiàn)象越好。所以；選用NAA的濃度為0.5 mg/L時，最適合分化培養(yǎng)。

3 結(jié)論

本文以玉米種子成熟胚作外植體進行組織培養(yǎng)，通過對外植體選用縱切的切割方式，用麥芽糖作為碳源，在N6M培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，選用0.5 mg/L的NAA激素和2.0 mg/L的2，4-D激素整合分析，建立出一套玉米最優(yōu)的再生遺傳轉(zhuǎn)化體系，最終成功地誘導(dǎo)出二倍體愈傷組織，并長成為二倍體植株。本研究為玉米轉(zhuǎn)基因及基因功能的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]李慧芬，李芬，宋桂茹.玉米優(yōu)良自交系E28愈傷組織繼代及再生[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999（2）：10-12.

[2]付鳳玲，張麗萍，朱楨.玉米自交系轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)建立及轉(zhuǎn)化后篩選與再生[J].四川農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000（2）：97-108.