摘 要：細(xì)胞固化技術(shù)是利用介質(zhì)將活細(xì)胞固定在反映溶液中，且盡可能完整的保存細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)。針對(duì)細(xì)胞固定過(guò)程中遇到的細(xì)胞破裂、細(xì)胞過(guò)渡收縮、細(xì)胞核固定性差等問(wèn)題，本文采用原子力顯微鏡對(duì)甲醇、戊二醛、丙酮固定的腎細(xì)胞進(jìn)行形貌測(cè)量。經(jīng)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)戊二醛對(duì)腎細(xì)胞的固化能夠更完整的保存細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞固化；原子力顯微鏡；細(xì)胞測(cè)量

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.24.251

1 引言

原子力顯微鏡是通過(guò)檢測(cè)待測(cè)樣品表面和一個(gè)微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來(lái)研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的“推”、“拉”、“刻劃”、“切割”、“搬運(yùn)”等操作功能[1]。還可以實(shí)現(xiàn)樣品的表面成像、粗糙度測(cè)量、高度測(cè)量等檢測(cè)功能。傳統(tǒng)觀測(cè)細(xì)胞的儀器為光學(xué)顯微鏡，其分辨率在微米級(jí)別，且不能準(zhǔn)確的得出所觀測(cè)細(xì)胞的尺寸、粗糙度、高度等信息。而原子力顯微鏡具有納米級(jí)分辨率，可在空氣或者各種近生理?xiàng)l件下工作，直接探測(cè)生物細(xì)胞的高度、直徑、體積、彈性等信息，能夠在微/納尺度上更加詳細(xì)地了解和掌握生物細(xì)胞的表面形貌、結(jié)構(gòu)特征、功能及特性等。這種優(yōu)勢(shì)使其正逐漸發(fā)展為細(xì)胞生物學(xué)研究中的有效工具。但是，因細(xì)胞具有一定的柔性，直接在生理溶液中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行原子力顯微鏡成像，會(huì)有成像分辨率不高、細(xì)胞膜表面蛋白成像不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此為獲得較高的細(xì)胞表面成像的分辨率，我們常會(huì)利用固化劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固化處理，雖然經(jīng)固化劑處理后，細(xì)胞失去了活性，但對(duì)于細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜表面褶皺、細(xì)胞器、微絨毛等研究卻有不可或缺的作用。

2 固化細(xì)胞形貌成像

傳統(tǒng)的細(xì)胞固定劑有95%酒精、乙醚酒精液、甲醇、冰醋酸、無(wú)水酒精、丙酮、Carnoy固定液、10%中性緩沖甲醛液等多個(gè)種類(lèi)。但由于乙醚、丙酮等具有揮發(fā)性和毒性，對(duì)人身體有害，已很少用于常規(guī)細(xì)胞學(xué)的固定。常用的細(xì)胞固定劑多為醛類(lèi)固定劑，且以甲醛類(lèi)和戊二醛最為常用。本文采用最常用的固定劑，丙酮、2.5%戊二醛、甲醇對(duì)腎細(xì)胞進(jìn)行固定，并獲得固定后的腎細(xì)胞形貌圖像。

2.1 生理溶液下觀察腎細(xì)胞

正常腎細(xì)胞是在37攝氏度環(huán)境中，貼壁生長(zhǎng)于培養(yǎng)液中。本實(shí)驗(yàn)是將貼壁生長(zhǎng)兩天的腎細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，并更換新的培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液是不可或缺的重要步驟，可以防止細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中死亡的漂浮細(xì)胞或雜質(zhì)刮到探針針尖上，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1為正常生理溶液下腎細(xì)胞形貌圖像?？梢?jiàn)細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)良好，細(xì)胞表面較光滑，細(xì)胞之間通過(guò)觸角聯(lián)系密切。但掃描過(guò)程中會(huì)有拉線(xiàn)情況出現(xiàn)，影響成像質(zhì)量。

2.2 觀察2.5%戊二醛固定劑固化的腎細(xì)胞

2.5%戊二醛固定劑是常用的細(xì)胞固定劑，該固定劑固定速度快、穿透性強(qiáng)，可以很好的保存細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。2.5%戊二醛固定劑配制方法：量取25%的戊二醛溶液10ml，置于三角燒瓶中，加入雙蒸餾水40ml，0.2mol/L磷酸緩沖液50ml，充分混勻[2]。圖2為2.5%戊二醛固定劑固化后的腎細(xì)胞形貌圖像?？梢?jiàn)2.5%戊二醛固定劑處理后的腎細(xì)胞，表面相對(duì)平滑，沒(méi)有明顯的孔洞，細(xì)胞邊緣較清晰。與正常生理溶液下觀察到的腎細(xì)胞形貌圖像差別不大。

2.3 觀察甲醇固定劑固化的腎細(xì)胞

甲醇固定劑具有固定時(shí)間快，細(xì)胞收縮小，細(xì)胞核保存較好，結(jié)構(gòu)清晰等優(yōu)點(diǎn)。圖3為甲醇固定劑固定后的腎細(xì)胞形貌圖像。圖4為

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甲醇固定劑固定腎細(xì)胞后，腎細(xì)胞的邊緣形貌圖像。由甲醇固定劑處理后的腎細(xì)胞形貌圖可見(jiàn)，細(xì)胞表面侵蝕出許多孔洞樣結(jié)構(gòu)。說(shuō)明甲醇侵蝕了腎細(xì)胞的細(xì)胞膜，使腎細(xì)胞產(chǎn)生了損傷。從圖4可以清晰的看到細(xì)胞的邊緣細(xì)微結(jié)構(gòu)，說(shuō)明腎細(xì)胞的微絨毛固化的相當(dāng)清晰完好。

2.4 觀察丙酮固定劑固化的腎細(xì)胞

丙酮處理后的腎細(xì)胞形貌如圖5所示?？汕逦挠^察到細(xì)胞表面有多處皸裂的痕跡，且細(xì)胞邊緣不清晰，說(shuō)明細(xì)胞脫水嚴(yán)重，在固化的過(guò)程中受到極大的損傷。由圖6可見(jiàn)，細(xì)胞邊緣觸角收縮為一團(tuán)。與正常生理溶液中的活細(xì)胞相比，經(jīng)丙酮固化后的腎細(xì)胞形貌結(jié)構(gòu)變化較大。

3 結(jié)論

細(xì)胞形貌、結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能有著重要的聯(lián)系，原子力顯微鏡對(duì)細(xì)胞表面形貌學(xué)研究與臨床研究的關(guān)系越來(lái)越密切，并具有廣闊的應(yīng)用前景。本文通過(guò)原子力顯微鏡對(duì)生理溶液下腎細(xì)胞、2.5%戊二醇固定劑固定的腎細(xì)胞、甲醇固定劑固定的腎細(xì)胞、丙酮固定劑固定的腎細(xì)胞進(jìn)行形貌測(cè)量。經(jīng)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)甲醇固定劑會(huì)很好的固定細(xì)胞邊緣的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但是卻會(huì)侵蝕細(xì)胞表面，使細(xì)胞表面產(chǎn)生孔洞樣結(jié)構(gòu)。丙酮固定劑會(huì)使細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞表面會(huì)發(fā)生皸裂，且細(xì)胞邊緣觸角會(huì)收縮成團(tuán)，腎細(xì)胞形貌較生理溶液中的細(xì)胞變化較大。而2.5%戊二醛固定劑對(duì)腎細(xì)胞的固化能夠更完整的保存細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞更接近于生理溶液中活細(xì)胞的形貌結(jié)構(gòu)狀態(tài)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于進(jìn)一步研究細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的褶皺，細(xì)胞表面的層狀脂肪物，微端絲和微絨毛[3]等，2.5%戊二醛固定劑固定細(xì)胞樣品是很好的細(xì)胞樣品制備方式。

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作者簡(jiǎn)介：張文曉（1988-），女，滿(mǎn)族，吉林梅河口人，碩士研究生，實(shí)習(xí)研究員，研究方向：納米操縱及測(cè)量。endprint