姜巨全，孫開福，楊立娜，陳 金，張正來

松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析

姜巨全，孫開福，楊立娜，陳 金，張正來

（東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

為分析編碼多亞基鈉/氫逆向轉運蛋白Group 2型mrp（mrp2）操縱子耐鹽堿能力，首先構建mrp2自殺質粒pK18mobsacB-mrp2-NcoI，電轉化野生型菌株-松嫩鹽單胞菌（Halomonassongnenensis）NEAU-ST10-39T，基于以上基因敲除原理獲得mrp2敲除菌株。PCR驗證及測序結果表明，成功獲得mrp2敲除菌株，并將其命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2。為進一步驗證突變株正確性，構建重組穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2，轉化敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2，獲得轉化子命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2。耐鹽堿測試顯示，NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2表現出與野生型菌株類似耐鹽堿能力，進一步證實敲除菌株NEAUST10-39T-△mrp2構建正確；隨NaCl濃度和pH升高，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生長受到抑制，表明mrp2對宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽堿條件下生長具有重要作用。電轉化方法可避免pK18mobsacB在三親本接合過程中受體菌抗性篩選、突變株純化弊端，簡化質粒導入宿主程序；NEAU-ST10-39T-△mrp2成功構建為敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因和揭示該基因耐鹽堿機制奠定基礎。

松嫩鹽單胞菌；Group 2型Mrp；基因敲除；耐鹽堿

中度嗜鹽菌（Moderate halophile）是在3%～15%NaCl條件下最適合生長微生物類群[1]。中度嗜鹽菌因其豐富耐鹽堿基因種類及復雜耐鹽堿機制，作為研究耐鹽堿分子機制重要對象備受關注[2-3]，在醫(yī)療環(huán)境改造、生物環(huán)保、污水處理等方面應用廣泛[4-6]。Mrp系統是廣泛存在于包括中度嗜鹽菌在內原核生物中一類單價陽離子/氫離子多亞基逆向轉運蛋白，其在維持胞內Na+，K+和Li+等陽離子及pH平衡等方面起關鍵作用[7-8]。根據編碼基因數量差異，Mrp系統主要分兩大類：①Group 1型Mrp由7個基因（mrpABCDEFG）編碼，其中mrpA僅含1個mrpB結構域，該類Mrp系統主要分布于金黃色葡萄球菌[9]、芽胞桿菌[10-12]和鹽單胞菌[13-14]；②Group 2型Mrp由6個基因（mrpA′CDEFG）編碼，與Group 1型Mrp主要差異是mrpA′除含mrpA結構域外，還含2個mrpB結構域，該類型Mrp系統主要分布于苜蓿中華根瘤菌[15]和霍亂弧菌[16]。

松嫩鹽單胞菌（Halomonassongnenensis）NEAUST10-39T是可在16%NaCl及pH 8堿性環(huán)境中生長的中度嗜鹽菌[17]。從該菌中克隆出的mrp2是Group 2型Mrp系統操縱子，在異源宿主大腸桿菌（Esche?richia coli）中表現高效耐鹽堿能力。為進一步探究mrp2在宿主菌中生理功能，本研究構建mrp2敲除菌株并分析其耐鹽堿能力，結果顯示mrp2對宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽堿條件中生長具有重要作用。本研究首次應用電轉化方法，可避免pK18mob?sacB在三親本接合過程中受體菌抗性篩選、突變株純化弊端，簡化質粒導入宿主程序；同時為敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因和深入揭示其耐鹽堿機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒和引物

主要菌株、質粒及引物如表1所示。

1.1.2 主要儀器及試劑

高速離心機購自Thermo Scientific公司，超低溫冰箱購自Thermo Scientific公司，培養(yǎng)箱購自上海志成生物公司，水浴鍋購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠，電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像儀購自美國SIM公司，pH計購自METTLER TOLEDO公司，高壓滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠，電轉儀購自Eppendorf公司，PCR儀購自Eppendorf公司，紫外-可見光分光光度計購自天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素購自美國AMRESCO公司；核酸和蛋白Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs均購自天根生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒購自Omega公司；Eco RI（15 U·μL-1）、SalⅠ（15 U·μL-1）、NcoⅠ（15 U·μL-1）等限制性內切酶均購自Takara生物公司。

1.1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

HLB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，制備固體平板時加入1.5%瓊脂；NaCl濃度按試驗要求加入；pH調制：pH 5～6，醋酸和醋酸鈉緩沖液（100 mmol·L-1）；pH 7～9，BTP-H2SO4緩沖液（100 mmol·L-1）；pH 10，碳酸鈉和碳酸氫鈉緩沖液（100 mmol·L-1）；松嫩鹽單胞菌（H.songnen?ensis）NEAU-ST10-39T及突變株及其轉化子在液體培養(yǎng)基中145 r·min-1、35 ℃培養(yǎng)24 h。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，pH 7。大腸桿菌（E.coli）DH5α轉化子在含50μg·mL-1氨芐青霉素LBK平板上37℃培養(yǎng)，在LBK液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、37℃培養(yǎng)24 h。

LBK培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，KCl 6.48 g，pH 7，部分試驗中添加NaCl至所需濃度或用BTP-H2SO4緩沖液（pH 7～8.5，100 mmol·L-1）調至所需pH；大腸桿菌（E.coli）KNabc轉化子在含50μg·mL-1氨芐青霉素的LBK平板上37℃培養(yǎng)，在LBK液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、37℃培養(yǎng)24 h。

1.2 方法

1.2.1 電轉化感受態(tài)細胞制備

挑取NEAU-ST10-39T單菌落于5 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中，35℃，145 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h；按2%接種量轉接于200 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h，期間注意監(jiān)測菌體OD600吸光度值；待OD600吸光度值達0.6～0.8后停止培養(yǎng)，冰浴菌液20～30 min；離心收集菌體；去除培養(yǎng)基后用20 mL去離子水重懸菌體，離心，洗滌菌體1次，去除殘留培養(yǎng)基；用20 mL冰預冷10%甘油緩慢將菌體懸浮，離心后，去盡殘液；重復上一步驟；用1.5 mL冰預冷10%甘油將菌體懸浮，并分裝（離心參數4℃，5 000 r·min-1和10 min）。

1.2.2 敲除載體構建

提取pUC-mrp2質粒，NcoI單酶切，將酶切后4.4 kb片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，25℃連接2 h。取適量連接體系，轉化大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細胞。培養(yǎng)后挑取陽性重組子，酶切驗證。

為獲得含有mrp2兩側同源臂片段（截短的mr?pA′和截短的mrpG，即△mrp2）敲除載體，對pUC-mrp2-NcoⅠ和pK18mobsacB質粒分別作SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切，經膠回收、連接、轉化大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細胞和培養(yǎng)后挑取陽性重組子，雙酶切驗證，用于后續(xù)研究。

1.2.3 穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2構建

對穿梭載體pBBR1-MCS5和pUC-mrp2質粒分別SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切，化轉至大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細胞后，雙酶切驗證，得到重組質粒pBBR1-MCS5-mrp2。

1.2.4 mrp2敲除菌株構建及驗證

為獲得mrp2敲除菌株，通過電轉化將pK18 mobsacB-mrp2-NcoI導入NEAU-ST10-39T感受態(tài)細胞，電擊參數為2 500 V、5 ms；在含卡那霉素（50 μg·mL-1）和3%NaCl的HLB固體平板上篩選單交換菌株，35℃過夜培養(yǎng)；逐個挑取菌落分別接入不含有和含有卡那霉素（50μg·mL-1）、10%蔗糖和3%NaCl的HLB培養(yǎng)基對應位置，35℃過夜培養(yǎng)，挑取發(fā)生雙交換菌落菌種保存用于后續(xù)研究。

選擇mrp2操縱子兩端（截短的mrp A′上游和mrpG下游）設計引物，對敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI（△mrp2正對照）、雙交換菌株NEAUST10-39T-△mrp2-3、NEAU-ST10-39T-△mrp2-4、重組質粒pUC-mrp2（mrp2操縱子的正對照）和野生型菌株NEAU-ST10-39T作PCR驗證，體系見表2；經初步驗證正確后，送北京華大基因股份有限公司測序，驗證敲除正確性。

表2 驗證NEAU-ST10-39T-mrp2的PCR反應體系Table 2 PCR reaction mixture of NEAU-ST10-39T-mrp2

1.2.5 mrp2敲除菌株轉化子獲得及驗證

按上述方法，將pBBR1-MCS5-mrp2電轉化敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2感受態(tài)細胞系列篩選，獲得NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2。提取質粒，通過酶切驗證其正確性。

1.2.6 耐鹽堿分析

野生型菌株耐鹽分析：將野生型菌株NEAUST10-39T接種于分別含有0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、6.0%、9.0%、12.0%、15.0%、16.0%和20%NaCl HLB培養(yǎng)基（pH 7），確定野生型菌株在HLB液體培養(yǎng)基中耐鹽范圍。

敲除菌株耐鹽分析：野生型菌株、NEAUST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2和基因敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2分別接種于含有2.0%、6.0%和16.0%NaCl的HLB培養(yǎng)基中（pH 7），檢測其對NaCl耐受差異性。

敲除菌株耐堿分析：將野生型菌株、NEAUST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2和基因敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2分別接種于含2%NaCl不同pH（5～10）HLB培養(yǎng)基，檢測其對堿性pH耐受差異性。

2 結果與分析

2.1 敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI構建

為構建mrp2操縱子敲除載體，應用DNAman 6.0分析pUC-mrp2和自殺質粒pK18mobsacB酶切位點，發(fā)現mrp2含多個Nco I酶切位點，而pUC18載體上無NcoⅠ酶切位點（圖1 A）；且通過SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切可將含有mrp2兩側同源臂（截短的mrpA′和mrpG，即△mrp2）構建到pK18mobsacB相同酶切位點。因此，通過使用NcoⅠ內切酶完全酶切pUC-mrp2，膠回收5 kb最大片段（含△mrp2 pUC18載體）并用T4 DNA連接酶自連（見圖2 A），最終獲含mrp2兩側同源臂（△mrp2）自連質粒pUC-mrp2-NcoⅠ（見圖1A、圖2A）。在此基礎上，用SalⅠ和Eco RⅠ對pUC-mrp2-NcoⅠ和pK18mobsacB作雙酶切，將pUC-mrp2-NcoⅠ酶切產物的1.8 kb小片段（△mrp2）與pK18mobsacB雙酶切產物（1個5.7 kb載體片段）連接，最后獲得mrp2敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoⅠ（圖1A、圖2A）。經SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切驗證，該載體構建正確（見圖2A）。

圖1 松嫩鹽單胞菌NEAU-ST10-39T中mrp2操縱子敲除Fig.1 Schematicsillustrating theknockout of mrp2 operon from Halomonassongnenensis NEAU-ST10-39T

圖2 自殺載體p K18mobsacB-mrp2-NcoⅠ構建及其雙酶切驗證Fig.2 Construction of thesuicideplasmid p K18mobsacB-mrp2-NcoⅠand itsverification by doubleenzymatic digestion

2.2 穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2構建

分析DNAman 6.0對pUC-mrp2和穿梭質粒pB?BR1MCS-5酶切位點，發(fā)現可通過SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切將pUC-mrp2中帶有啟動子和終止子mrp2操縱子構建到穿梭質粒pBBR1-MCS5。因此，用SalⅠ和Eco RⅠ分別對pUC-mrp2和pBBR1-MCS5雙酶切（見圖3A），回收pUC-mrp2雙酶切大片段（6.7 kb）和pBBR1-MCS5雙酶切片段（4.8 kb）并用T4 DNA連接酶連接，轉化連接產物至大腸桿菌（E.coli）KNabc，最后獲得穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2（見圖3A）。經SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切驗證，證明該載體構建正確（見圖2B）。

2.3 mrp2單交換菌株篩選

為構建mrp2的敲除菌株，首先誘導mrp2兩側同源臂片段（△mrp2）與野生型菌株同源序列單交換（原理如圖1B～C）。為此，mrp2敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI通過電轉化導入野生型菌株NEAU-ST10-39T感受態(tài)細胞，將轉化子及未經電轉化感受態(tài)細胞（負對照）均勻涂布在含卡那霉素（50 μg·mL-1）和3%NaCl的HLB固體平板上，經過35℃過夜培養(yǎng)，在涂布轉化子平板上出現幾十個扁平、光滑、不透明黃色菌落，與野生型菌株NEAU-ST10-39T菌落特征一致；對比發(fā)現，在涂布未經電轉化感受態(tài)細胞平板上，無菌落出現。表明mrp2兩側同源臂片段（△mrp2）與野生型菌株同源序列發(fā)生單交換，即第1次同源重組（原理見圖2C）。

2.4 mrp2雙交換菌株篩選

為最終構建mrp2敲除菌株，需用10%蔗糖篩選壓力脅迫單交換菌株發(fā)生雙交換，促使突變株清除其基因組中自殺質粒pK18mobsacB（原理見圖1D）。為此，挑取生長菌落一一對應分別接種在含有卡那霉素（50μg·mL-1）、10%蔗糖和3%NaCl的HLB固體平板上（見圖4A）和含有10%蔗糖和3%NaCl的HLB固體平板上（見圖4B），35℃培養(yǎng)24 h，發(fā)現兩個菌落在圖4A所示平板上不生長，在圖4B所示相應位置上生長良好，表明這2個菌落為雙交換菌株，按其接種順序命名為NEAUST10-39T-△mrp2-3和NEAU-ST10-39T-△mrp2-4，挑取菌落并接種于含有3%NaCl的HLB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后收集菌體保存于-80℃用于后續(xù)試驗。

圖3 穿梭載體p BBR1-MCS5-mrp2的構建及其雙酶切驗證Fig.3 Construction of the recombinant plasmid p BBR1-MCS5-mrp2 and itsverification by doubleenzymatic digestion

圖4 NEAU-ST10-39T的mrp2操縱子敲除菌株篩選Fig.4 Screening of the mrp2-knockout mutantsof NEAU-ST10-39T

2.5 mrp2的敲除菌株PCR驗證

為驗證所獲雙交換菌株是否為mrp2敲除菌株，設計引物（見表1）對敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI（△mrp2正對照）、雙交換菌株NEAUST10-39T-△mrp2-3、NEAU-ST10-39T-△mrp2-4、重組質粒pUC-mrp2（mrp2操縱子正對照）和野生菌NEAU-ST10-39T作PCR驗證（見圖5）。發(fā)現pK18 mobsacB-mrp2-Nco I（△mrp2正對照）、NEAU-ST10-39T-△mrp2-3和NEAU-ST10-39T-△mrp2-4的PCR產物均約為700 bp；pUC-mrp2（mrp2操縱子正對照）和NEAU-ST10-39TPCR產物均約為5 600 bp。為進一步驗證以上2株雙交換株是否為mrp2敲除菌株，最后將NEAU-ST10-39T-△mrp2-3和NEAUST10-39T-△mrp2-4的PCR產物送至北京華大基因股份有限公司測序，序列結果用DNAman 6.0作比對分析，最終確定均為mrp2敲除菌株。選取NEAU-ST10-39T-△mrp2-3命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2，作為mrp2的敲除菌株用于后續(xù)試驗。

圖5 NEAU-ST10-39T的mrp2操縱子的敲除菌株的PCR驗證Fig.5 Verification of the mrp2-knockout mutant of NEAU-ST10-39T by PCR

2.6 轉化子NEAU-ST10-39T-mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2構建

為進一步驗證NEAU-ST10-39T-△mrp2是否為mrp2的敲除菌株，需分析mrp2操縱子是否可互補該突變株。為此，將pBBR1-MCS5-mrp2電轉化導入NEAU-ST10-39T-△mrp2感受態(tài)細胞，在含有慶大霉素（50μg·mL-1）和3%NaCl的HLB固體平板上，挑取單菌落提取質粒，并經SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切驗證，發(fā)現轉化子構建正確，將其命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2。

2.7 耐鹽堿分析

為分析野生型菌株的耐鹽能力，將野生型菌株NEAU-ST10-39T接種于分別含有不同濃度NaCl的HLB培養(yǎng)基（pH 7），確定野生型菌株在HLB液體培養(yǎng)基耐鹽范圍為0.5%～16%NaCl（見圖6A）。在此基礎上，分別分析野生型菌株、NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2和敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2對NaCl和堿性pH耐受差異性。發(fā)現NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2表現出與野生型菌株類似耐鹽能力（見圖6B、6C），進一步證實敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2構建正確。在pH 7，2.0%NaCl濃度條件下，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2的生長情況與野生型菌株、NEAU-ST10-39T-△mrp2/pB?BR1-MCS5-mrp2生長情況無差異；6.0%和16.0%NaCl濃度時，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生長情況受抑制（見圖6B），表明mrp2對宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽條件下生長具有重要作用。在含有2%NaCl的HLB培養(yǎng)基中，pH 6、7條件下，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2與野生型菌株NEAU-ST10-39T生長表現無差異；pH 8條件下，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生長受抑制（見圖6C），表明mrp2對宿主菌NEAU-ST10-39T在堿性條件下生長具有重要作用。

圖6 NEAU-ST10-39T的mrp2操縱子的敲除菌株耐鹽堿測試Fig.6 Growth test for salt toleranceand alkalinep H resistanceof the mrp2-knockout mutant of NEAU-ST10-39T

3 討論與結論

中度嗜鹽菌基因敲除十分困難，尤其是革蘭氏陽性中度嗜鹽菌。目前，基因敲除成功僅限于革蘭氏陰性鹽單胞菌屬（Halomonas），并利用三親本接合方式導入外源基因[14]，使用電轉化導入方式敲除未見報道。三親本接合轉化敲除質粒方法，可避免導入雙鏈DNA易被受體菌限制性內切酶降解風險，但所用受體菌必須具有抗生素抗性，難以實現敲除菌株與大腸桿菌分離純化。電轉化方法操作可避免操作過程中大腸桿菌污染，操作簡單，工作強度小，試驗周期較短。目前，一般使用S-G培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜鹽菌，利于嗜鹽菌快速生長。生長在S-G培養(yǎng)基嗜鹽菌形成細胞壁較厚，阻礙質粒等外源DNA轉化[18]。因此，本研究在參照革蘭氏陰性菌和鹽單胞菌的電轉化感受態(tài)細胞制備方法基礎上[19-20]，選擇含3%NaCl的HLB培養(yǎng)基制備NEAU-ST10-39T電轉化感受態(tài)細胞，成功將敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoⅠ并使穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2導入野生型菌株。本研究將電轉化方法首次應用于鹽單胞菌基因敲除，對敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因具有重要指導意義。

松嫩鹽單胞菌（Halomonas songnenensis）NEAUST10-39T是一株可在16%NaCl及pH 8堿性環(huán)境下生長中的度嗜鹽菌[17]。為分析其高效耐鹽堿機制，篩選耐鹽堿基因，發(fā)現mrp2是一個編碼Group 2型Mrp系統操縱子，其在異源宿主大腸桿菌（Esche?richia coli）中表現高效耐鹽堿能力，與已報道的多亞基鈉/氫逆向轉運蛋白（Mrp系統的同源物）Sa_Mnh[9]、 Bh_Mrp[11]、 Bs_Mrp[10,12]、 Hz_Mrp[13]、Hs_Mrp[14]、Sm_Pha1[15]一致。

為進一步探究mrp2在宿主菌中生理功能，本研究構建mrp2敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI，采用電轉化方法導入野生型菌株NEAUST10-39T，通過PCR驗證和穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2互補試驗，成功構建敲除菌株NEAUST10-39T-△mrp2。耐鹽堿分析，發(fā)現mrp2操縱子對宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽堿條件下生長具有重要作用。在非嗜鹽菌和耐鹽菌中，Mrp系統敲除顯著影響其生理功能，如Bs_ Mrp[10,12]、Sm_Pha1等敲除導致耐鹽堿能力顯著下降，甚至喪失[15]。然而，革蘭氏陰性中度嗜鹽菌的鹽單胞菌Y2敲除Mrp系統，使宿主在高鹽堿條件下生長受到顯著抑制。與本研究結果一致，因中度嗜鹽菌長期處于高鹽堿環(huán)境，被迫進化更多數量和類型鈉/氫逆向轉運蛋白應對外界極端環(huán)境變化。因此，NEAU-ST10-39T-△mrp2成功構建，為敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因和揭示基因耐鹽堿機制奠定基礎。

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Construction of Group 2-mrp-knockout mutant of Halomonas songne?nensis and analysis on its halo-alkaline-tolerant capacity

/JIANG uquan,SUN Kaifu,YANG Lina,CHEN Jin,ZHANG Zhenglai
(School of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to analyze of the halo-alkaline-tolerant capacity of mrp2 operon encoding a Group 2 multi-subunit Na+/H+antiporter in the host Halomonas songnenensis NEAU-ST10-39T,the suicide plasmid of mrp2,p K18mobsac B-mrp2-NcoI,was constructed and then electroporated into the wild type NEAU-ST10-39T.Finally,the mrp2-knockout mutant designated NEAU-ST10-39T-△mrp2 wasobtained by using the homologous recombination and counter-selection on the plate containing 10%sucrose.PCR verification and sequencing analysis showed that mrp2 succeeded in being knockout in the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2.For the confirmation of this result,mrp2 was constructed into a broad-host-range shuttle vector,p BBR1-MCS5,and the resultant construct designated p BBR1-MCS5-mrp2 was electroporated into the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2.The resultant transformant was designated NEAU-ST10-39T-△mrp2/p BBR1-MCS5-mrp2.Growth test for the halo-alkaline tolerance showed that the transformant NEAU-ST10-39T-△mrp2/p BBR1-MCS5-mrp2 exhibited the similar growth to the wild type strain NEAU-ST10-39T.In contrast,the growth of the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2 was inhibited under the highly-saline or highly alkaline conditions,revealing that mrp2 played a critical role in the halo-alkaline tolerance of the host NEAU-ST10-39T.Successful application of gene knockout through the electroporation and construction of the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2 will be very helpful for carrying out the knockout of other halo-alkaline tolerant genes from Halomonas genus and further analysis of the halo-alkaline tolerance of mrp2 in the host NEAU-ST10-39T.

Halomonas songnenensis;Group 2 mrp;knockout;halo-alkaline-tolerance

Q933；Q751

A

1005-9369（2017）12-0011-10

時間2017-12-18 13:40:08 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171218.1339.006.html

姜巨全,孫開福,楊立娜,等.松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析[J].東北農業(yè)大學學報,2017,48(12):11-20.

Jiang Juquan,Sun Kaifu,Yang Lina,et al.Construction of Group 2-mrp-knockout mutant of Halomonas songnenensis and analysis on its halo-alkaline-tolerant capacity[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(12):11-20.(in Chinese with English abstract)

2017-05-05

國家自然科學基金項目（31570045）；黑龍江省自然科學基金項目（C201417）；博士后科研啟動資金（LBH-Q14022）

姜巨全（1977-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向主要為分子微生物學與生物制藥。E-mail：jjqdainty@163.com.