祖建成 雍 江 胡建軍 劉 宇 趙夭望 何 軍

尿道下裂患兒染色體及核型分析

祖建成 雍 江 胡建軍 劉 宇 趙夭望 何 軍

目的通過對尿道下裂患兒染色體核型分析和SRY基因檢測，初步明確染色體核型、SRY基因缺失情況和尿道下裂之間的關(guān)系。方法采用染色體核型Leica CytoVision?自動細胞遺傳學(xué)分析系統(tǒng)進行染色體核型分析。采用PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳方法對SRY基因進行檢測。結(jié)果137例尿道下裂患兒中，檢測出染色體異常 10例（7．29%），其中Ⅰ型 2例（2／46，4．3%），Ⅱ型 3例（3／41，7．3%），Ⅲ型2例（2／26，7．6%），Ⅳ型 3例（3／24，12．5%），1例患兒 SRY檢測陰性，染色體檢測 45，XY，－21［10］／46，XY，r（21）［5］／46，XY，r（21；21）［13］，行雙側(cè)睪丸活檢，雙側(cè)活檢均有睪丸組織和卵巢組織，為DSD（disorders of sex development），其余病例未發(fā)現(xiàn)有SRY異常。結(jié)論染色體和核型改變是尿道下裂形成的主要原因之一，已確定可引起尿道下裂的染色體畸變有十余種，對于外生殖器分化模糊，如伴尿道下裂、陰蒂肥大呈陰莖樣，根據(jù)生殖器外觀常難以正確決定性別的患者，通過性染色體檢查有助于做出明確診斷，并根據(jù)染色體檢查結(jié)果和臨床其它檢查，明確是否DSD。

尿道下裂；染色體；核型分析

男性外生殖器發(fā)育是一個復(fù)雜過程，始于Y染色體的遺傳啟動，同時與決定細胞分化、激素信號傳導(dǎo)、酶活性、組織重塑所需的性別決定基因（sexdetermining region on Y chromosome，SRY）及其蛋白產(chǎn)物－睪丸決定因子（testis determination factor，TDF）相關(guān)。染色體和核型改變是尿道下裂形成的原因，目前已確定可引起尿道下裂的染色體畸變有十余種，相關(guān)的染色體有 1、4、6、8、11、13、19、20、21、X、Y等十余條［1］。對于外生殖器分化模糊，如尿道下裂，陰蒂肥大呈陰莖樣，生殖器外觀常難以正確決定性別的患者，通過性染色體的檢查有助于做出DSD診斷。本研究通過對尿道下裂患兒進行染色體核型分析和SRY基因檢測，明確染色體核型、SRY基因缺失情況與尿道下裂之間的關(guān)系，并對是否DSD進行明確診斷。

材料與方法

一、研究對象

收集2012年1月至2013年4月本院收治的尿道下裂患兒137人，年齡最大13歲，最小的2．2歲，平均年齡4．6歲。按黃澄如《實用小兒泌尿外科學(xué)》分型標(biāo)準［2］：Ⅰ型（陰莖頭型、冠狀溝型）46例，Ⅱ型（陰莖型）41例，Ⅲ型（陰莖根部和陰莖陰囊型）26例，Ⅳ型（陰囊型、會陰型）24例。

二、方法

1．熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）：收集尿道下裂患兒新鮮血液標(biāo)本，進行染色體核型檢測：將DNA探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子耦聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合，檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析，判斷單個堿基突變［3］。

2．SRY檢測：提取患兒DNA，并將提取物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測為大于50 kb的人總DNA，采用 PCR技術(shù)對此進行 SRY基因檢測［4］。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用陽性例數(shù)或陽性率表示，尿道下裂各組之間的比較用R×C表χ2檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

137例尿道下裂患兒中，染色體異常10例（7．29%），其中1例患兒SRY（－），染色體核型45，XY，－21［10］／46，XY，r（21）［5］／46，XY，r（21；21）［13］，睪丸活檢提示為 DSD，其余均為 SRY（＋），見表1。染色體核型改變見于Ⅰ型2例（2／46，4．3%），Ⅱ型 3例（3／41，7．3%），Ⅲ型 2例（2／26，7．6%），Ⅳ型3例（3／24，12．5%），見表2。

表1 尿道下裂染色體核型改變情況Table 1 Chromosomal and karyotypic changes of hypospadias

表2 不同類型尿道下裂染色體核型改變情況（n）Table 2 Chromosomal and karyotypic changes in different types of hypospadias（n）

討 論

種族繁衍延續(xù)的物質(zhì)基礎(chǔ)是性別決定和分化。生物體內(nèi)染色體（主要是性染色體）的完整性決定性別，染色體畸變和尿道下裂存在一定的相關(guān)性［1］。我們的研究表明尿道下裂患兒染色體畸變發(fā)生率不高。夏愛麗等［5］研究表明：大Y染色體核型可引起尿道下裂，Y染色體微結(jié)構(gòu)變化對生育有影響。沈婉英［6］報告大Y染色體在人群中占13．81%?，F(xiàn)知Y染色體長臂（Yq）遠端的2／3為結(jié)構(gòu)異色質(zhì)，是Y染色體發(fā)生長度變化的最常見部位。但長度變化的病因尚未清楚，有人認為與易位、缺失、復(fù)制等有關(guān)，也有人認為是染色質(zhì)中DNA重復(fù)過度所致。隨著輔助生殖技術(shù)迅速發(fā)展和熒光原位雜交技術(shù)等新技術(shù)的應(yīng)用，染色體的診斷水平提高，異常檢出率隨之增加［7，8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，尿道下裂患兒染色體核型改變中存在大Y的改變，其突變頻率并不很高（1／137），說明大Y染色體可能是尿道下裂發(fā)病的風(fēng)險因素。

性器官發(fā)育過程還需要有基因和激素的共同作用，最終決定或形成睪丸（雄性）或卵巢（雌性）。哺乳動物性別決定中SRY起關(guān)鍵作用，Yp11．3是SRY定位點，其存在一個外顯子，無內(nèi)含子，編碼一種DNA結(jié)合蛋白，以轉(zhuǎn)錄因子形式存在于睪丸Sertoli細胞核中。該蛋白被分為3個區(qū)域，其中間的約80個氨基酸殘基稱為HMG box（highmobility group box，HMG box），是主要的功能域。HMG box能特異性識別并結(jié)合核心序列AACAAAG，并能使與之結(jié)合的DNA彎曲成某一角度。當(dāng)編碼HMG box基因發(fā)生突變時，SRY蛋白結(jié)合DNA的活性將會改變。蛋白N端的絲氨酸殘基磷酸化后可增強與DNA結(jié)合活性，HMG box兩端還攜帶有兩個獨立的核定位信號［9］。SRY蛋白產(chǎn)物睪丸決定因子（TDF），啟動睪丸分化，抑制睪丸發(fā)育負調(diào)節(jié)，SRY突變將導(dǎo)致XY性逆轉(zhuǎn)等性別異常的形成和發(fā)育［10］。

Harley VR等［11］研究報道4例XY女性反轉(zhuǎn)病人，發(fā)現(xiàn)SRY的信號位點處均發(fā)生了錯義突變。研究表明突變的SRY蛋白僅有部分定位在胞質(zhì)，而野生型蛋白則限制在核內(nèi)。每個信號都獨立引導(dǎo)一種載體蛋白進行核運輸，任何一個發(fā)生突變都會影響核內(nèi)濃集的程度和效率。人類性腺嵴形成于受精后33 d左右，第41天SRY能在XY胚胎中檢測，第44天高峰時可辨認睪丸索。第52天Sertoli細胞包圍生殖細胞，并在Sertoli細胞核中持續(xù)低水平表達SRY［12］。這與其在性腺分化早期睪丸決定因子的作用相一致，SRY突變與性反轉(zhuǎn)患者有關(guān)。DNA序列分析顯示大多數(shù)XX男性反轉(zhuǎn)患者中存在SRY，而僅有大約15%的XY女性患者中發(fā)現(xiàn)SRY的點突變或缺失。這一結(jié)論支持SRY是睪丸決定因子，同時也表明除SRY外還存在其他的性別決定基因的突變［12］。幾乎所有攜帶SRY突變的XY女性患者均有完全性腺發(fā)育不良，這與SRY在睪丸形成早期起關(guān)鍵作用相一致，這些患者的外生殖器和正常女性一樣，由于完全的性腺發(fā)育不良和卵巢功能喪失，臨床上表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)，50%的病例伴發(fā)性腺腫瘤（性腺胚胎細胞瘤和無性細胞瘤），手術(shù)中需常規(guī)切除性腺［13］。SRY的突變大多是新生突變，錯義突變則集中于基因的中心區(qū)，即編碼HMG box的序列。這強烈支持DNA結(jié)合基序的重要作用。但并不是所有SRY突變都導(dǎo)致完全的性反轉(zhuǎn)。Jordan和Brian K等［14］在1例家族性SRY突變的病例中，發(fā)現(xiàn)XY女性反轉(zhuǎn)患者父親也攜帶相同SRY突變，但卻有正常表型和生育能力，認為這可能與修飾基因的影響有關(guān)，患者與她父親攜帶不同的修飾等位基因會導(dǎo)致不同的表型。本研究發(fā)現(xiàn)，尿道下裂患兒的SRY幾乎陽性，僅DSD的患兒SRY出現(xiàn)陰性結(jié)果。我們推斷，尿道下裂患兒在胚胎發(fā)育的起始期，作為性別啟動的SRY并沒有出現(xiàn)問題，尿道下裂患兒從一開始是按男性生殖器發(fā)育，尿道發(fā)育的障礙可能和SRY級聯(lián)的下級基因突變相關(guān)，或者是多基因聯(lián)合作用的結(jié)果。

染色體和其核型的改變是尿道下裂形成的原因，對于外生殖器分化模糊，我們需要通過性染色體及核型的檢查以做出明確診斷，并結(jié)合臨床其它檢查，明確DSD診斷。

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Chromosomal and karyotypic testing of hypospadias

．
Zu Jiancheng，Yong Jiang，Hu Jiangjun，Liu Yu，Zhao Yaowang，He Jun．
Department of Urology，Hunan Children's Hospital，Changsha 410007，China．Corresponding author：He Jun，Email：hjys840808＠163．com

ObjectiveTo preliminarily determine the relationship between chromosomal and karyotypic detection and hypospadias．MethodsThe chromosomes and karyotypeswere detected by an automatic analyzer．ResultsChromosomal detection of hypospadias was abnormal（10／137，7．29%）．And the clinical types were I（2／46，4．3%），Ⅱ（3／41，7．3%），Ⅲ（2／26，7．6%）andⅣ（3／24，12．5%）．SRY detection was negative（n＝1）with a genotype of45，xy21／46，xyr（21）／46，xy，r（21；21），bilateral testicular biopsy revealed both testicular and ovarian tissues．The diagnosiswas disorder of sex development．ConclusionChromosome and karyotype changesmay predispose to the formation of hypospadias．So far a dozen types chromosomal aberrations have been identified．For differentiating vague external genitalias，such as hypospadias and penislike clitoral enlargement，gender is often difficult to determine．An examination of sex chromosomes helps to make a definite diagnosis．Based upon the results of chromosomal testing and clinical examinations，disorder of sex development is ascertained．

Hypospadias；Chromosomes；Karyotyping

10．3969／j．issn．1671—6353．2017．06．012

湖南省科技廳資助項目（2008RS4030）

湖南省兒童醫(yī)院泌尿外科（湖南省長沙市，410007）

何軍，Email：hjys840808＠163．com

2017—01—22）

本文引用格式：祖建成，雍江，胡建軍，等．尿道下裂患兒染色體及核型分析［J］．臨床小兒外科雜志，2017，16（6）：580—582．

10．3969／j．issn．1671—6353．2017．06．012．

Citing this article as：Zu JC，Yong J，Hu JJ，et al．Chromosomal and karyotypic testing of hypospadias［J］．JClin Ped Sur，2017，16（6）：580—582．DOI：10．3969／j．issn．1671—6353．2017．06．012．