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        MEG3對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990侵襲及運(yùn)動(dòng)能力的影響

        2017-12-29 01:11:48董偉華陳瑞東胡端敏唐文
        中華胰腺病雜志 2017年6期
        關(guān)鍵詞:小室胰腺癌甲基化

        董偉華 陳瑞東 胡端敏 唐文

        MEG3對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990侵襲及運(yùn)動(dòng)能力的影響

        董偉華 陳瑞東 胡端敏 唐文

        母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3, MEG3)是小鼠母體印記基因Gt12的人類同系物,定位于染色體14q32.3,屬于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA是調(diào)控基因表達(dá)、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工等過程的重要分子[2-3],與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。MEG3在多種正常組織中表達(dá),但在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失[4-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),人胰腺癌SW1990細(xì)胞中MEG3基因表達(dá)缺失,而上調(diào)MEG3表達(dá)后能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。本研究進(jìn)一步觀察MEG3對(duì)SW1990細(xì)胞侵襲及運(yùn)動(dòng)能力的影響。

        一、材料與方法

        1.pcDNA3.0-MEG3質(zhì)粒的構(gòu)建及SW1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染:質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[8]。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、空質(zhì)粒組、MEG3質(zhì)粒組。對(duì)照組細(xì)胞僅加轉(zhuǎn)染試劑,空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒,MEG3質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA 3.0-MEG3質(zhì)粒。

        2.Transwell小室體外運(yùn)動(dòng)及侵襲實(shí)驗(yàn):Transwell小室用于運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn),Transwell小室間隔膜用Metrigel覆蓋凝固后用于侵襲實(shí)驗(yàn)。取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,用無血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整到1×106/ml。Transwell上室加入細(xì)胞懸液200 μl,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μl,置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄Transwell上室液體,用棉簽小心擦去濾膜上方的細(xì)胞,取隔膜用甲醇固定15 min后用0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下選取5 個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)濾膜下方的穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3個(gè)小室,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        3.SW1990細(xì)胞去甲基化處理:將5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-CdR)溶于DMSO中配成50 mmol/L的溶液,以10、100 μmol/L的終濃度處理SW1990細(xì)胞72 h,以等容積DMSO溶液處理72 h的SW1990細(xì)胞作為對(duì)照組。

        4.RT-PCR檢測MEG3 mRNA表達(dá):收集上述各組細(xì)胞,提取總RNA,合成cDNA,行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳凝膠成像。

        二、結(jié)果

        1.各組SW1990細(xì)胞MEG3 mRNA表達(dá):MEG3質(zhì)粒組SW1990細(xì)胞在近200 bp處有一MEG3特異性擴(kuò)增條帶,而空質(zhì)粒組及對(duì)照組SW1990細(xì)胞未見擴(kuò)增條帶。

        2.Transwell小室體外運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn):對(duì)照組、空質(zhì)粒組、MEG3質(zhì)粒組的24 h穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(88.0±4.58)、(86.0±3.61)、(87.3±1.53)個(gè)/200倍視野,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

        3.Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn):對(duì)照組、空質(zhì)粒組、MEG3質(zhì)粒組的24 h穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(75.0±2.65)、(73.7±4.16)、(72.3±3.21)個(gè)/200倍視野,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

        4.去甲基化前后SW1990細(xì)胞MEG3 mRNA表達(dá)水平的變化:去甲基化試劑處理SW1990細(xì)胞后,MEG3 mRNA的表達(dá)水平較未處理對(duì)照組明顯上升(圖2),間接證實(shí)MEG3基因的失活是由于其發(fā)生了超甲基化。

        討論研究發(fā)現(xiàn)MEG3基因在人神經(jīng)纖維瘤、腦膜瘤、骨髓增生異常綜合征和急性粒白血病、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失[8-12],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其原因是MEG3啟動(dòng)子的異常甲基化。神經(jīng)纖維瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理后MEG3基因重新表達(dá)[10,13]。本研究采用5-aza-CdR處理人胰腺癌SW1990細(xì)胞后,細(xì)胞MEG3 mRNA的表達(dá)水平明顯升高,也證實(shí)MEG3基因的失活是由于其啟動(dòng)子發(fā)生了超甲基化。

        圖1 對(duì)照組(A)、空質(zhì)粒組(B)、MEG3質(zhì)粒組(C)穿膜細(xì)胞(左:運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn);右:侵襲實(shí)驗(yàn))

        圖2 對(duì)照組(1),10、100 μmmol/L 5-aza-CdR處理組(2、3),MEG3質(zhì)粒組(4)SW1990細(xì)胞MEG3 mRNA表達(dá)

        胰腺癌是一種治療困難,預(yù)后極差的腫瘤類型,其原因與該腫瘤易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程,在這一過程中,細(xì)胞外基質(zhì)起天然屏障作用,腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附,使之降解,并最終穿越屏障導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞間同質(zhì)性黏附的減弱有利于腫瘤細(xì)胞脫離母體瘤組織,而腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、層粘連蛋白、纖維連接蛋白及Ⅳ型膠原等之間異質(zhì)性黏附的增強(qiáng)則提高了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Tian等[7]和Sun等[14]報(bào)道MEG3與骨肉瘤、乳腺癌的臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,MEG3對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及侵襲能力并無影響,與Lu等[9]的結(jié)論相同。各研究得出結(jié)論的不一致是否與腫瘤細(xì)胞系的不同有關(guān),目前尚不能定論。因此,要得到更準(zhǔn)確的MEG3對(duì)腫瘤遷移與侵襲的影響,還需要在更多的細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證。

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        10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.015

        江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(SJLX-0564)

        215000 江蘇蘇州,蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科

        唐文,Email:louisetangwen@163.com

        2016-11-04)

        冀凱宏)

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