(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 830052；2.和靜畜牧獸醫(yī)站，新疆和靜 841300；3.昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆昭蘇 835604)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.021

中國(guó)新疆部分地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染的差異性及系統(tǒng)發(fā)育分析

劉世芳1，郭慶勇1，聞秀秀1，張夢(mèng)園1，黨娜娜2，阿拉西·阿濱3，巴音查汗1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 830052；2.和靜畜牧獸醫(yī)站，新疆和靜 841300；3.昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆昭蘇 835604)

目的分析新疆南北疆馬泰勒蟲(chóng)感染的差異性及地方流行株遺傳進(jìn)化距離，研究馬泰勒蟲(chóng)遺傳多樣性及其感染率。方法采自南北疆478份疑似馬匹的血樣，經(jīng)馬泰勒蟲(chóng)PCR方法檢測(cè)，分析馬泰勒蟲(chóng)感染情況并應(yīng)用最大似然法(ML)基于18 S rRNA基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果在所采集的樣品中，中國(guó)新疆北疆地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染陽(yáng)性率為13.96%(25/179)，中國(guó)新疆南疆地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染陽(yáng)性率為27.09%(78/299)。印度、南非、西班牙、伊朗等地方株聚為一支，擴(kuò)增的18S rRNA基因(MF398476、MF398477)與瑞典地方株聚為一支。結(jié)論中國(guó)新疆南疆馬泰勒蟲(chóng)感染率高于北疆，南北疆馬泰勒蟲(chóng)感染存在顯著性差異(P=0.001<0.05)，在不同年齡段馬匹的感染無(wú)顯著性差異(P>0.05)；擴(kuò)增的馬泰勒蟲(chóng)阿勒泰、托克遜地方流行株(MF398477、MF398476)與瑞士地方株(KM046918.1)親緣關(guān)系最近。

馬泰勒蟲(chóng)；感染；系統(tǒng)發(fā)育

0 引 言

【研究意義】馬泰勒蟲(chóng)是由硬蜱傳播的頂復(fù)門血液內(nèi)寄生蟲(chóng)，主要寄生于馬、騾、驢和斑馬等動(dòng)物的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)及紅細(xì)胞內(nèi)[1]。引起馬臨床呈現(xiàn)稽留熱、貧血、出血、黃染、呼吸困難等癥狀[2-4]， OIE將其列為B類疫病，我國(guó)將其列為二類疫病[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬泰勒蟲(chóng)病呈世界性分布，據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)報(bào)道，僅2011年全世界27個(gè)國(guó)家已有馬泰勒蟲(chóng)病的流行[6-7]。據(jù)報(bào)道，全球約90%的馬屬動(dòng)物分布在馬泰勒蟲(chóng)病流行地區(qū)[8-9]，急性病例死亡率可達(dá)10%以上[10]，嚴(yán)重影響馬匹健康。該病在中國(guó)普遍流行，在中國(guó)新疆的流行區(qū)域主要集中在伊犁、阿勒泰和巴音郭楞州等[11]。多年來(lái)馬泰勒蟲(chóng)在歸類上一直存在分歧[12-13]。1998年根據(jù)其在硬蜱體內(nèi)的發(fā)育周期和在宿主馬體內(nèi)的淋巴細(xì)胞發(fā)育階段與其他泰勒蟲(chóng)種具有高度的遺傳相似性，而將其歸類為泰勒屬[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)新疆地區(qū)的馬泰勒蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)室已積累多年相關(guān)資料，基于對(duì)南北疆的馬泰勒蟲(chóng)的感染沒(méi)有相關(guān)對(duì)比分析，對(duì)其感染作出相關(guān)對(duì)比分析，同時(shí)近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，其系統(tǒng)發(fā)育介于泰勒蟲(chóng)屬和巴貝蟲(chóng)屬之間，應(yīng)將其定位于兩屬之間的位置[15]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究采用分子生物學(xué)方法，對(duì)所采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)和分析，探討南北疆部分地區(qū)馬匹對(duì)馬泰勒蟲(chóng)感染的差異性及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。為新疆馬泰勒蟲(chóng)的分布及其地方蟲(chóng)株的進(jìn)化關(guān)系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品

2017年3～5月分別在中國(guó)新疆巴音郭楞州和靜縣7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)、阿勒泰2個(gè)縣、吐魯番托克遜縣和伊犁昭蘇種馬場(chǎng)等區(qū)域分別采集了馬血樣288份、58份、11份、121份，共計(jì)478份，待檢。

1.1.2 試劑

樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；pEASY-T1 Clong Kit試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；EasyTap、EasyTap Buffer、dNTP等均購(gòu)自Takara生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 馬泰勒蟲(chóng)全基因組核酸的提取

嚴(yán)格參照基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書提取DNA，-20 ℃?zhèn)溆帽４妗?/p>

1.2.2 PCR目的片段的擴(kuò)增及測(cè)序

引物參照羅金等[16]擴(kuò)增馬泰勒蟲(chóng)18S RNA基因的目的區(qū)段，上游引物：5'- TTTGGGCTGTTTACAGTTGC-3'；下游引物：5'- CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG-3'；由上海生工生物工程有限公司合成。采用25 μL反應(yīng)體系以全血基因組DNA為模板，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將陽(yáng)性樣品(北疆的阿勒泰部分樣品、南疆的托克遜部分樣品)的PCR產(chǎn)物，使用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)一步連接到pEASY-T1 Cloning Kit載體，導(dǎo)入Trans1感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)單菌落，再經(jīng)PCR鑒定，陽(yáng)性樣本送新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育

將測(cè)序獲得的序列經(jīng)NCBI(blast)分析，確定為馬泰勒蟲(chóng)基因序列后，將并將阿勒泰、托克遜地區(qū)測(cè)序結(jié)果分別上傳到Genbank，登陸號(hào)分別為MF398476、MF398477。并與GenBank上登錄的馬泰勒蟲(chóng)不同地方株18S rRNA基因序列，采用DNAStar軟件中MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì)，采用 Mega 6.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析不同國(guó)家、不同區(qū)域間馬泰勒蟲(chóng)的同源性及差異。用于進(jìn)化分析的18S rRNA基因序列登錄號(hào)分別為L(zhǎng)C704749.1、EU642508.1、AY150062.2、JQ657703.1、JQ657703.1、AF704748.1、KF704749.1、AB515315.1、KM046918.1、KF429797.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)PCR擴(kuò)增18 S rRNA基因

對(duì)所采集的馬全血基因組DNA進(jìn)行了馬泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因擴(kuò)增，采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；成功擴(kuò)增出了531 bp的陽(yáng)性條帶，與預(yù)計(jì)大小相符，詳見(jiàn)圖1。南北疆部分樣品PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。圖1，圖2

M： DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2000；1-2：馬泰勒蟲(chóng)PCR產(chǎn)物；3：陰性對(duì)照

M： DNA Marker DL 2000；1-2：TheileriaequiPCR Products ；2：Negative control

圖1 馬泰勒蟲(chóng)PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 PCR amplification results of Theileria equi

M：DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2000；1-23：馬泰勒蟲(chóng)PCR產(chǎn)物；24：陰性對(duì)照

M：DNA Marker DL 2000；1-23：TheileriaequiPCR positive；24：Negative control

圖2 南北疆部分馬泰勒蟲(chóng)PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 PCR amplification results of Theileria equi in northern and southern

2.2 新疆南、北疆地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

對(duì)北疆阿勒泰、昭蘇地區(qū)和南疆和靜、托克遜地區(qū)所采集的樣品進(jìn)行馬泰勒蟲(chóng)PCR檢測(cè)、對(duì)比。研究表明，所檢測(cè)的478份馬全血中有107份感染馬泰勒蟲(chóng)，感染陽(yáng)性率為22.38%(107/478)。北疆地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染陽(yáng)性率為13.96%(25/179)，其中采集于阿勒泰部分區(qū)域、昭蘇縣的馬泰勒蟲(chóng)感染陽(yáng)性率分別為12.06%(7/58)、14.87%(18/121)；南疆地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染陽(yáng)性率為27.09%(78/299)，其中和靜、托克遜馬泰勒蟲(chóng)感染陽(yáng)性率分別為27.08%(78/288)、36.36%(4/11)。表1

1～4歲、5～8歲、≥9歲感染率分別為25.74%、20.94%、20.00%。表2

2.3 新疆南、北疆不同年齡馬感染泰勒蟲(chóng)情況

試驗(yàn)對(duì)北疆、南疆部分地區(qū)馬匹感染馬泰勒蟲(chóng)情況使用spss 20.0[17]進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)北疆、南疆馬泰勒蟲(chóng)感染存在顯著性差異(P=0.001<0.05)；阿勒泰、昭蘇、和靜、托克遜四個(gè)地區(qū)進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)阿勒泰與和靜、昭蘇與和靜分別存在顯著性差異(P=0.012<0.05；P=0.007<0.05)，不同年齡段馬泰勒蟲(chóng)感染無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表3，表4

表1 不同地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染率
Table 1 The infection rate in different regions of Theileria equi

地區(qū)District樣品數(shù)(份)Sample(portion)陽(yáng)性數(shù)(份)Positivenumber(portion)感染率Prevalence(%)合計(jì)Total北疆Northern阿勒泰58712.06(7/58)昭蘇1211814.87(18/121)13.96%(25/179)南疆Southern和靜2887827.08(78/288)托克遜11436.36(4/11)27.09%(81/299)合計(jì)47813528.24(135/478)

表2 不同年齡段馬泰勒蟲(chóng)感染率
Table 2 Infection rate of Theileria equi in different ages

感染率Prevalence(%)年齡 Agegroup1～4歲5～8歲≥9歲地區(qū)District阿勒泰6.25(2/32)20(4/20)16.67(1/6)昭蘇37.03(10/27)10.34(6/58)5.5(2/36)和靜27.83(27/97)26.54(30/113)26.92(21/78)托克遜36.36(4/11)00合計(jì)25.74(43/167)20.94(40/191)20.00(24/120)

表3 不同地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染統(tǒng)計(jì)
Table 3 Statistical analysis of infection in different regions of Theileria equi

地區(qū)District北疆 Northern南疆 Southern阿勒泰Aletai昭蘇Zhaosu和靜Hejing托克遜Toksun阿勒泰AletaiP=0.6710.0120.074昭蘇Zhaosu0.0070.099和靜Hejing0.465托克遜Toksun總計(jì)TotalP=0.01

表4 不同年齡段馬泰勒蟲(chóng)感染統(tǒng)計(jì)
Table 4 Statistical analysis of infection in different age of Theileria equi

年齡段Agegroup1～4歲5～8歲≥9歲1～4歲0.2780.2505～8歲0.846≥9歲

2.4 系統(tǒng)發(fā)育

將阿勒泰(MF398476)、托克遜(MF398477)地方珠測(cè)序獲得馬泰勒蟲(chóng)18S rRNA 基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Genbank上瑞典馬泰勒蟲(chóng)地方株登錄號(hào)為KM046918.1同源性為100%。選取不同國(guó)家馬泰勒蟲(chóng)18S r RNA基因序列(登錄號(hào)分別為：LC704749.1、EU642508.1、AY150062.2、JQ657703.1、JQ657703.1、AF704748.1、KF704749.1、AB515315.1、KM046918.1、KF429797.1)應(yīng)用MEGA6構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，印度、南非、西班牙、伊朗等地方株分為一支，擴(kuò)增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)與瑞典地方株分為一支。說(shuō)明擴(kuò)增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)與瑞典地方株親緣關(guān)系最近。圖3

圖3 18S rRNA基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)
Fig.3 Phylogenetic tree of 18 S rRNA gene nucleotide sequence

3 討 論

新疆南、北疆氣候差異明顯，分別形成了獨(dú)特的地域特點(diǎn)。新疆草地資源豐富，為馬泰勒蟲(chóng)的傳播媒介硬蜱孳生提供了有利條件，導(dǎo)致馬泰勒蟲(chóng)的感染逐年上升[18]，嚴(yán)重制約了馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研究對(duì)采自北疆伊犁昭蘇種馬場(chǎng)、阿勒泰，南疆巴州和靜縣、托克遜縣共478份馬全血樣品進(jìn)行了馬泰勒蟲(chóng)感染情況檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)馬泰勒蟲(chóng)總感染率為22.38%(107/478)，北疆地區(qū)感染率為13.96%(25/179)，南疆地區(qū)感染陽(yáng)性率為27.09%(78/299)，該結(jié)果與李佳[19]檢測(cè)馬泰勒蟲(chóng)感染南疆高于北疆的情況基本一致。

檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，北疆、南疆馬泰勒蟲(chóng)感染存在顯著性差異(P<0.05)，由于馬泰勒蟲(chóng)經(jīng)硬蜱傳播的，故馬泰勒蟲(chóng)感染與南北疆馬泰勒蟲(chóng)的傳播媒介(硬蜱)的區(qū)系分布相關(guān)。近年來(lái)，北疆地區(qū)融雪時(shí)間較晚，溫度較低，硬蜱活動(dòng)受限制，馬泰勒蟲(chóng)傳播受阻，感染率顯得比南疆低。對(duì)采自不同年齡段馬匹的感染情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)1～4、5～8和9歲以上的馬感染馬泰勒蟲(chóng)差異均不顯著，與前期試驗(yàn)研究結(jié)果相一致[20]。 馬泰勒蟲(chóng)可在其體內(nèi)攜帶(“帶蟲(chóng)馬”)長(zhǎng)達(dá)7年之久[21], 因此每個(gè)年齡段的馬匹都有很高的感染率。

國(guó)內(nèi)對(duì)馬泰勒蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化分析較少，僅羅金[22]、薛艷[23]對(duì)貴州、甘肅地區(qū)的馬泰勒蟲(chóng)進(jìn)行了相關(guān)遺傳進(jìn)化分析。試驗(yàn)對(duì)南北疆地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)的18S rRNA基因序列進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果表明，印度、南非、西班牙、伊朗等地方株聚為一支，擴(kuò)增的18S rRNA基因(MF398476、MF398477)與瑞典地方株聚為一支。表明擴(kuò)增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)與瑞典地方株親緣關(guān)系最近。說(shuō)明新疆的馬泰勒蟲(chóng)與瑞士馬泰勒蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中處于同一種系,它們有著更近的親緣關(guān)系,在分類學(xué)中處于同樣的地位。阿勒泰地區(qū)和托克遜地區(qū)的流行蟲(chóng)株存在差異性，這由于南北疆地區(qū)環(huán)境差異較大，蜱種也存在很大的差異性；也可能和區(qū)域間馬屬動(dòng)物的進(jìn)出口貿(mào)易有關(guān)，還可能和動(dòng)物的遷徙以及皮革貿(mào)易中蜱的傳播作用有關(guān)[23]。

提高對(duì)馬泰勒蟲(chóng)的感染情況對(duì)比，北疆高于南疆的這種分布特點(diǎn)將對(duì)其流行病學(xué)調(diào)查有著重要的意義，同時(shí)可為該病的監(jiān)控提出重點(diǎn)。在防控該病時(shí)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)是其傳播媒介蜱。硬蜱對(duì)天氣的變化有強(qiáng)烈的敏感性，當(dāng)氣溫較低或雨天后，硬蜱的數(shù)量都會(huì)急劇下降，馬泰勒蟲(chóng)的感染也隨之下降，滅蜱成為阻斷該病傳播的有效途徑，更要加強(qiáng)馬泰勒蟲(chóng)病的綜合防控水平。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)馬全血樣品進(jìn)行馬泰勒蟲(chóng)感染情況檢測(cè)，馬泰勒蟲(chóng)總感染率為22.38%(107/478)，中國(guó)新疆北疆地區(qū)感染率為13.96%(25/179)，南疆地區(qū)感染陽(yáng)性率為27.09%(78/299)，南疆地區(qū)感染率高于北疆，可能是南北疆氣候差異較大，北疆地區(qū)冰雪融化時(shí)間較晚，其傳播媒介硬蜱活動(dòng)受限；不同年齡段馬匹間感染差異均不顯著，可能的原因是采樣馬的年齡主要集中到3～9歲，而在這個(gè)年齡階段馬較易感染馬泰勒蟲(chóng)故差異不顯著。擴(kuò)增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析比較發(fā)現(xiàn)與瑞典地方株親緣關(guān)系最近。

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DifferencesinTheileriaequiInfectionandItsPhylogeneticDevelopmentAnalysisinSomeAreasofXinjiang

LIU Shi-fang1, GUO Qing-yong1, WEN Xiu-xiu1, ZHANG Meng-yuan1,DANG Na-na2, Alax Abing3, Bayinchahan1

(1.CollegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.HejingAnimalHusbandryandVeterinaryStation,HejingXinjiang841300,China;3.ZhaosuAnimalHusbandryandVeterinaryStation,ZhaosuXinjiang835604,China)

ObjectiveTo understand the situation ofTheileriaequiand the genetic distance of local endemic strains strain ofTheileriaequiin Xinjiang.Method478 horse blood samples were collected from Southern and Northern Xinjiang, and Equine Theileriosis was investigated by PCR, the 18S rRNA gene was analyzed and the phylogeny tree was constructed based on Maximum Likelihood algorithm.ResultThe result showed that the infection rate in Northern Xinjiang was 13.96% (25/179), and the infection rate in Southern Xinjiang was 27.09% (78/299)； It was thought that the strains in India, South Africa, Spain, Iran and other places clustered into one branch and the strains with the genes (MF398476, MF398477) and Swedish local strains clustered into another branch.ConclusionThe infection rate of Equine Theileriosis between Northern and Southern Xinjiang displayed significant difference(P=0.001<0.05)，but there was no significant difference(P>0.05)in different age groups. The amplified Theileria equi in Altay and Tuokexun endemic strains (MF398477, MF398476) and the local strains of Switzerland (KM046918.1) had the closest relationship. The test provided a data to support the control of Equine Theileriosis and the accurate classifying status ofTheileriaequi.

Theileriaequi; northern and southern Xinjiang; phylogeny

Supported by: National Natural Science Foundation-Xinjiang Joint Fund Key Projects"The Equine Piroplasmosis Epidemic Regularity and Advantages of Ticks in Xinjiang: Biological Characteristics and Detection Techniques of Vectors Research" (U1403283)and Research and Innovation Projects of Graduate Students of Xinjiang Agricultural University "Screening and treatment of Chinese and Western medicine for Theileriosis Equi" (XJAUGRI2016-009)

Bayinchahan(1964-),female,Bazhou,Xinjiang,Master. research field:Parasitic immunology and molecular biology of protozoa. (E-mail)bynch@hotmail.com，2514062881@qq.com

S852.7

A

1001-4330(2017)11-2130-08

2017-09-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目-新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目“新疆馬梨形蟲(chóng)病流行規(guī)律及其優(yōu)勢(shì)媒介蜱生物學(xué)特性和檢測(cè)技術(shù)的研究”(U1403283)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目課題“馬泰勒蟲(chóng)病中西藥物效果篩選及治療”(XJAUGRI2016-009)

劉世芳(1990-)，男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)，(E-mail)727640930@qq.com

巴音查汗(1964-)，女，新疆巴州人，教授，研究方向?yàn)榧纳x(chóng)免疫學(xué)及原蟲(chóng)分子生物學(xué)，(E-mail)bynch@hotmail.com，2514062881@qq.com