丁 永，趙郁聰*

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 輕工科學與工程學院，陜西 西安 710021）

透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的動力學模型

丁 永1，趙郁聰2*

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 輕工科學與工程學院，陜西 西安 710021）

構(gòu)建透明質(zhì)酸發(fā)酵動力學模型可反⒊發(fā)酵過程中菌體生長量、基質(zhì)消耗量及透明質(zhì)酸產(chǎn)量之間的變化規(guī)律。采用獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）進行搖瓶發(fā)酵，利用MATLAB軟件對透明質(zhì)酸含量、還原糖殘量、菌體量的實驗數(shù)據(jù)進行了非線性規(guī)劃，建立了透明質(zhì)酸生成動力學的模型。對擬合值與實驗值進行比較，發(fā)現(xiàn)其吻合度較好，相對誤差＜5%。本模型適用于培養(yǎng)基初糖質(zhì)量濃度＜30 g/L的分批發(fā)酵，為透明質(zhì)酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)放大、發(fā)酵過程的工藝設(shè)計和管理控制提供科學的依據(jù)。

透明質(zhì)酸；獸疫鏈球菌；發(fā)酵動力學

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以β-1,3-糖苷鍵和β-1,4-糖苷鍵連接而成的二糖單位重復構(gòu)成的直鏈粘多糖[1]。廣泛存在于高等動物的結(jié)締組織和微生物莢膜中。HA的生理功能多種多樣，如其良好的粘彈性在關(guān)節(jié)腔中可起到潤滑和保護的作用；可使細胞之間黏合在一起，保證了正常的細胞代謝及組織保水作用，并保護細胞不受病原菌的侵害，在皮膚中起到保持水分的作用，使皮膚具有良好的彈性和韌性。近年來用HA治療骨關(guān)節(jié)疾病以及HA對疼痛和炎癥的緩解作用，預防術(shù)后粘連和對軟組織修復的顯著效果[2]。透明質(zhì)酸-納米銀復合凝膠在臨床創(chuàng)傷包縛材料領(lǐng)Ⅱ有潛在的應(yīng)用價值[3]，透明質(zhì)酸在癌癥轉(zhuǎn)移控制藥物及新⒈藥物載體設(shè)計有廣泛應(yīng)用[4]。

傳統(tǒng)獲得HA的方法是動物組織提取法，但該方法存在原料不足、工藝復雜、純度低、生產(chǎn)成本昂貴等缺點。1983年日本資生堂成功開發(fā)出微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的HA，從此克服了組織提取法的諸多缺點，成為現(xiàn)下國外主流的生產(chǎn)方法[5]。目前國內(nèi)的HA生產(chǎn)廠家大多還采取組織提取法，但收率低、提純難、成本高、質(zhì)量差、難以大規(guī)模生產(chǎn)，無法滿足國內(nèi)市場的需求，還需從國外大量進口。本研究通過對獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC-39920生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵動力學進行研究，旨在為透明質(zhì)酸的放大實驗、發(fā)酵過程的工藝設(shè)計和管理控制提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）：陜西科技大學食品與生物工程學院誘變保藏（原始菌株編號：ATCC-39920，來源于美國國家菌種保藏中心），實驗室保藏號Sz560。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，滅菌前調(diào)整pH7.0、121℃滅菌20min；血瓊脂平板（70 mm血平板）：華美生物有限公司；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏10 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，K2HPO41.5g/L，滅菌前調(diào)整pH7.0、121℃滅菌20min，冷卻至溫度低于50℃，無菌條件下加入1%優(yōu)級小牛血清；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母浸粉20 g/L，小牛血清1%，MgSO42.0 g/L，KH2PO41.6 g/L，F(xiàn)eSO40.005 g/L。調(diào)pH 7.0、121℃滅菌20 min備用。

1.1.3 材料

氫氧化鈉、葡萄糖（均分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（均生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、標準透明質(zhì)酸（均為分析純）：美國Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RDX-280型不銹鋼電熱手提式滅菌消毒器：上海申安醫(yī)療器械廠；Q/BKYY10-91型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療儀器廠；HQL300柜式恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；TDH-1恒溫空氣搖床：江蘇太倉儀器廠；J2-Mc高速冷凍離心機、DU640紫外-可見分光光度計：美國Beckman公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取10 mL液體培養(yǎng)基于試管中，滅菌后加入1%的小牛血清，菌種用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于試管中，置于37℃靜置培養(yǎng)24～36 h；重復操作活化兩次。

1.3.2 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)從斜面上挑取一環(huán)菌體，接于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，200 r/min、37℃培養(yǎng)12～24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子接入裝有50 mL發(fā)酵液的500 mL三角瓶中，接種量為5%，200 r/min、37℃培養(yǎng)14 h。1.3.4取樣檢測

每2 h取一次樣品，在10 000 r/min條件下離心10 min，離心后分離上清液與沉淀分別置于4℃冰箱中保存，待檢測備用并作好記錄[6]。

1.3.5 計算公式

在平衡生長條件下，微生物細胞的生長速率rX的計算公式為：

式中：X為微生物細胞濃度，g/L；μ為微生物比生長速率，h-1。

由表４可以看出，解釋變量與解釋變量和，以及解釋變量和之間都存在高度線性相關(guān)性．盡管方程整體線性回歸擬合很好，但變量的參數(shù)t值并不顯著，表明模型確實存在嚴重的多重共線性．

1.3.6 測定方法

菌體生長量的測定：按照參考文獻[7]的方法測定。還原糖濃度測定：采用DNS法[6]。透明質(zhì)酸濃度檢測方法：采用CTAB濁度法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獸疫鏈球菌菌落和菌體特征

圖1 發(fā)酵菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of fermentation strains

2.1.1 菌落形態(tài)由圖1可知，菌落形態(tài)為圓形、表面干燥、褶皺、邊緣粗糙、顏色為乳白色并有凸起。

2.1.2 菌體發(fā)酵過程形態(tài)變化

圖2 不同發(fā)酵階段的菌體形態(tài)Fig.2 Mycelial morphology of different fermentation phases

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，菌體數(shù)量逐漸增加，并且由最初的單個菌體變成之后的多個個體相連的長鏈形式，培養(yǎng)初期菌體莢膜比較明顯，從9 h之后莢膜明顯的消失，其主要原因可能是菌體進入穩(wěn)定期后透明質(zhì)酸釋放到周圍環(huán)境中，莢膜也隨之消失。

2.2 獸疫鏈球菌發(fā)酵動力學研究[9]

圖3 獸疫鏈球菌發(fā)酵過程曲線Fig.3 Fermentation curve ofStreptococcus zooepidemicus

由圖3可知，在0～1 h期間，菌體處于適應(yīng)期，菌體數(shù)量沒有顯著增加，葡萄糖的消耗也很??；在2～5 h期間，菌體處于對數(shù)生長期，菌體體積及數(shù)量急劇增加，葡萄糖殘量急劇下降；在6 h以后的時間段里，菌體進入穩(wěn)定期及衰退期，殘?zhí)橇孔兓静蛔兞?。透明質(zhì)酸含量曲線為鐘形曲線，中間會有一個峰值。在前期，隨著菌體量的增加，HA含量逐漸增加；在8～12 h期間，含量達到最大值，此時期菌體正好進入穩(wěn)定期，莢膜中的HA基本都已釋放到培養(yǎng)基中去，隨后的時間段里，HA分子降解，分子量降低，HA含量降低。由此可知，透明質(zhì)酸主要是在穩(wěn)定期產(chǎn)生。

2.2.1 菌體生長動力學模型的建立[10-12]

在獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的過程中，產(chǎn)物包括透明質(zhì)酸、乳酸、乙酸等，乙酸的濃度相當?shù)?，已忽略不計。在發(fā)酵過程中，葡萄糖為唯一限制性底物，乳酸為唯一限制性產(chǎn)物。由圖3可知，HA和乳酸的生成與菌體的生長相偶聯(lián)，但當乳酸積累到一定濃度時，HA的合成速度明顯變慢，說明乳酸對HA的合成具有強烈的抑制作用。同時，乳酸的產(chǎn)生對細胞繼續(xù)合成乳酸也會產(chǎn)生抑制作用[13]。所以結(jié)合Andrew和Hinshelwood模型，發(fā)現(xiàn)下面的動力學模型能較好的擬合：

式中：μmax為菌體最大比生長速率，h-1；KS為底物半飽和常數(shù)，g/L；Ki為底物抑制常數(shù)，g/L；K1為乳酸對菌體生長的抑制常數(shù)；PLA為乳酸濃度，g/L。

2.2.2 底物消耗動力學模型

發(fā)酵過程中底物的消耗主要用于以下3個方面：一是用于菌體細胞生長；二是合成代謝產(chǎn)物；三是用于維持細胞生長代謝所需的基本能量。底物的消耗與微生物菌體生長及代謝產(chǎn)物的形成有著密切的關(guān)系。以此，建立動力學模型為：

式中：YX/S為細胞生成得率系數(shù)，即細胞生成速率與底物消耗速率之比；YP/S為產(chǎn)物形成得率系數(shù)，即產(chǎn)物形成速率與底物消耗速率之比；mS為維持細胞結(jié)構(gòu)和生命活動所需能量的細胞維持系數(shù)，g/（g·s）。

2.2.3 透明質(zhì)酸產(chǎn)物生成動力學模型

由圖3可知，透明質(zhì)酸的發(fā)酵為生長偶聯(lián)型過程，可以用下面的動力學模型對其進行模擬：

式中：PHA為HA的質(zhì)量濃度，g/L；PLA為乳酸的質(zhì)量濃度，g/L；αHA為HA的偶聯(lián)常數(shù)；K2為乳酸對HA合成的抑制常數(shù)。

2.3 模型參數(shù)求解

根據(jù)測定結(jié)果，應(yīng)用MATLAB軟件對其進行非線性規(guī)劃，求得模型參數(shù)。

表1 動力學模型參數(shù)模擬值Table 1 Simulation values of kinetics model parameters

由此，得到本實驗的發(fā)酵動力學模型：

（1）菌體生長動力學模型為：

（2）底物消耗動力學模型為：

（3）透明質(zhì)酸生成動力學模型為：

2.4 發(fā)酵動力學模型的擬合值與實驗值的比較[14-15]

模型建立后，其適用性還有待通過進一步的發(fā)酵結(jié)果對模型進行驗證。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，菌體生長曲線為典型的S型曲線。0～4h為適應(yīng)期；4～16 h為對數(shù)生長期，HA含量峰值就出現(xiàn)在此時期；16 h之后為穩(wěn)定期，菌體數(shù)量變化不大，HA的含量也不再增加。

圖4 菌體生長動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.4 Comparison of fitted values of kinetics model and experimental values of biomass

圖5 透明質(zhì)酸含量動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.5 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of hyaluronic acid production

圖6 底物消耗動力學模型擬合值與實驗值的比較Fig.6 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of substrate consumption

圖7 乳酸生成動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.7 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of lactic acid production

由圖5～圖7可知，所建模型能較好地反應(yīng)出獸疫鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸的過程，底物的消耗，乳酸生成的擬合值與實驗值吻合度好，相對誤差＜5%。

3 結(jié)論

本實驗基于大量的發(fā)酵數(shù)據(jù)，通過計算機軟件對透明質(zhì)酸發(fā)酵動力學模型進行了非線性規(guī)劃，建立了透明質(zhì)酸發(fā)酵動力學的模型。除少量實驗數(shù)據(jù)偏差較大之外，擬合值與實驗值較吻合，達到了實驗的目的。

菌體生長動力學模型顯示菌體生長受到兩方面的抑制因素，一項為底物抑制，另一項為產(chǎn)物乳酸的抑制。透明質(zhì)酸生成動力學模型可知在乳酸產(chǎn)量較低時，透明質(zhì)酸的量與生物量呈正比例關(guān)系；當乳酸量與透明質(zhì)酸量積累到一定濃度時，HA的合成速度明顯變慢，說明HA的合成與菌體的生長相偶聯(lián)并受到乳酸的抑制作用。

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Kinetic model of the hyaluronic acid fermentation process

DING Yong1,ZHAO Yucong2*
（1.School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China;2.School of Light Industry,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China）

The construction of hyaluronic acid fermentation kinetics model can reflect the change rules between the biomass variation,substrate consumption and hyaluronic acid production in the fermentation process.The hyaluronic acid was fermented in shake flask byStreptococcus zooepidemicus,the hyaluronic acid content,reducing sugar residue content and bacterial amount were conducted with nonlinear programme,and the kinetic model of hyaluronic acid production was established by MATLAB software.The fitted value was coincided with the experimental value,and the relative error was less than 5%.The model was applicable to the batch fermentation in the medium with initial glucose concentration less than 30 g/L,and it could provide scientific basis for the industrial production amplification of hyaluronic acid,fermentation technology design and operation management.

hyaluronic acid;Streptococcus zooepidemicus;fermentation kinetics

TQ929.2

0254-5071（2017）12-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.026

2017-10-04

陜西省教育廳專項科研計劃項目（14JK1089）

丁 永（1974-），男，講師，博士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：趙郁聰（1975-），女，副教授，博士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。