劉紅佶 李翔 李祥玉 李華宏 楊鳳嬌 田夢瑤 王泰

補腎活血中藥對SD大鼠慢性高眼壓模型初級視皮質PI3K/AKt通路凋亡相關因子BAX及BCL-2的影響

劉紅佶 李翔 李祥玉 李華宏 楊鳳嬌 田夢瑤 王泰

目的觀察補腎活血中藥對SD大鼠慢性高眼壓(elevated intraocular pressure,EIOP)模型初級視皮質(primary visual cortex,PVC)B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、B細胞淋巴瘤/白血病-2相關x基因(bcl-associated X protein,Bax)的干預作用,探討其作用機理。方法30只SD大鼠隨機分為3組(對照組、給藥組、模型組)。模型組和給藥組采用烙閉上鞏膜靜脈法建立SD大鼠慢性EIOP模型,連續(xù)灌胃8周后處死大鼠,予TONO-PEN筆式眼壓計測量大鼠眼壓、免疫組化檢測PVC Bcl-2、Bax蛋白表達及電鏡下觀察PVC神經元細胞超微結構。結果給藥組與模型組大鼠眼壓在造模后即刻直至造模后8周與造模前相比均升高,說明慢性EIOP模型造模成功;造模后8周眼壓與造模后即刻相比,給藥組有降低趨勢,模型組無明顯變化。免疫組化檢測顯示給藥組Bcl-2蛋白陽性表達最多,其總面積、積分光密度及平均黑度較對照組差異無統(tǒng)計學意義;模型組Bcl-2蛋白表達最少,總面積、積分光密度及平均黑度較對照組及給藥組低。模型組Bax蛋白陽性表達最多,其總面積、積分光密度及平均黑度較給藥組與對照組高,給藥組與對照組無明顯差別。給藥組PVC超微結構較模型組明顯改善。結論補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)能促進EIOP SD大鼠初級視皮質神經元損傷的修復,其機制可能通過作用于PI3K/AKt通路,增強Bcl-2表達、下調Bax表達、改善神經元細胞超微結構及降低眼壓有關。

青光眼; 視功能保護; 初級視皮質; Bcl-2; Bax; 補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)

青光眼是目前世界第二位的不可逆性致盲眼病,其發(fā)病率和致盲率均在不斷上升。在我國,目前至少有500萬名青光眼患者,其中雙目失明患者有79萬人,占盲人總數(shù)的50%[1,2]。2013年,全球40～80歲的青光眼患者約為6430萬,預計2020年將增加到7600萬,而2040年將增加到1億1180萬[3]。既往認為視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGCs)丟失是導致青光眼視功能損害主要原因,新近研究表明青光眼是自RGCs到PVC整個視路均存在形態(tài)和功能改變的神經退行性病變[4,5]。因此,青光眼視功能保護研究應深入到視神經顱內段更廣闊的范疇。

PVC是視覺的最高中樞,青光眼患者尸檢證明與活體影像學表明青光眼病程及嚴重程度與PVC損害呈正相關關系[6,7],但中醫(yī)中藥的干預除我們前期研究外無相關報道[8,9]。本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法[10]制作眼壓穩(wěn)定、持久的SD大鼠EIOP模型,通過觀察補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)對慢性EIOP模型SD大鼠眼壓、PVC Bcl-2、Bax表達及神經元細胞超微結構的影響,探討其保護視功能的作用機理,為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物及實驗分組

標準1級8～12周齡SD大鼠30只(雌雄不拘,體重約160～200g,大鼠及飼料均由成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。納入標準:①無外眼疾病;②雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常;③無歪頸)。SD大鼠購回后,適應性喂養(yǎng)3天,進行眼壓測量,正常眼壓區(qū)間估計,取平均眼壓在9～18mmHg者,隨機分為對照組、模型組、給藥組。

1.2 藥物及試劑

復方丹參片、杞菊地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠);Bax抗體、Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司);3%戊巴比妥鈉(上海化學試劑廠);0.25%氯霉素眼液(天津市萬嘉制藥有限公司);75%消毒酒精(成都市蓉康醫(yī)療保健實業(yè)有限公司);碘伏(杭州楊馳醫(yī)療用品有限公司);0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液(Alcon公司);0.5%鹽酸金霉素眼膏(蕪湖三億信成制藥有限公司);3%戊二醛組織固定液(成都中醫(yī)藥大學病理教研室);FAA固定液(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科)。

2 方法

2.1 模型建立

模型組和給藥組進行單眼(右眼)造模,左眼不做處理。方法如下:(1)0.25%氯霉素眼液滴右眼3天,每日2次;(2)75%酒精浸泡消毒器械備用,予1.5ml/kg麻醉量給大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉;(3)固定大鼠,予碘伏棉簽在眼瞼及其周圍消毒3次,0.25%氯霉素滴眼液沖洗術眼結膜囊,用0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液行術眼表面麻醉,鋪巾;(4)在眼科顯微鏡下進行以下操作:拉開術眼眼瞼,暴露角膜上方球結膜,距上方角鞏膜緣約1～2mm處剪開球結膜,分離筋膜后可在角鞏膜緣后3～4mm見到4～5只暗紅色、粗大的樹枝狀血管,壓迫血管,可見近角膜緣段血管明顯怒張,而遠角膜緣段血管卻血流消失;(5)選擇位于10點、12點和1點處血管,并使用眼科手術止血器對其進行烙閉(烙閉成功標志:血管立即收縮,遠端血流中斷);(6)術后用生理鹽水沖洗術眼結膜囊,整復球結膜,涂鹽酸金霉素眼膏于術眼預防感染,注意保暖,待大鼠麻醉恢復之后送回籠子。造模后,予術眼滴用0.25%氯霉素眼液2次/日,鹽酸金霉素眼膏1次/晚,連續(xù)使用5天。該造模方法應用于模型組與給藥組,而對照組僅僅打開結膜囊未行燒灼上鞏膜靜脈處理,為假烙閉,余操作相同。因為灌胃、麻醉等原因導致8只大鼠死亡。

2.2 給藥方法

每日16:00～18:00給大鼠灌胃1次,連續(xù)8周,方法如下:模型組及對照組每日予3ml生理鹽水灌胃;給藥組每日予(0.96g/kg體重的復方丹參片、3.0g原生藥/kg體重的杞菊地黃丸)3ml混懸液灌胃,相當于20倍成人劑量,每2周稱體重1次,據(jù)體重調整給藥量。

2.3 IOP測量

造模前,連續(xù)測量3天IOP,取平均值作為正常IOP,造模后即刻、2w、4w、6w、8w各測1次IOP。IOP測量時間為2:00 pm～5:00 pm,待測眼鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后,用TONO-PEN筆式眼壓計測量,每回連測3次,取平均值作為該次測定的眼壓值。

2.4 免疫組化檢測

給藥8周后用頸椎脫臼法處死大鼠,開顱完整剝離腦組織,立即放入復合固定液中,同時將該固定液注入大腦縱裂中部。固定72小時后,參照《大鼠腦立體定位圖譜》[11],取左側枕葉17區(qū)腦組織(PVC),標本逐級酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,做10μm連續(xù)切片,烘干備用,Bcl-2及Bax免疫組化染色:Bcl-2及Bax呈細顆粒狀、細絲狀棕黃色著色,尋找Bcl-2、Bax陽性物質最豐富區(qū)域(即“熱點”區(qū),染色顏色最深或染色面積最多的區(qū)域),每張切片選取5個200倍視野的陽性細胞熱點區(qū),用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量PVC部位Bcl-2或Bax陽性染色總面積、積分光密度與平均黑度,求取每張切片5個視野的染色面積總和、積分光密度總和與平均黑度均值。

2.5 電鏡下PVC超微結構觀察

各組隨機選取1只SD大鼠,麻醉、固定、斷頭取腦,將初級視皮質17區(qū)切成2mm 3小塊,放入3%戊二醛組織固定液,4℃冰箱內固定2h,1%鋨酸后固定30min,觀察初級視皮質神經元超微結構。由四川大學華西醫(yī)學中心電鏡室完成。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 補腎活血中藥對慢性EIOP SD大鼠IOP的影響

表1顯示,造模前各組大鼠IOP比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);造模后即刻與造模前相比,對照組IOP無明顯變化(P>0.05),給藥組、模型組IOP較造模前明顯升高(P<0.01),這說明造模成功;造模后8周與造模后即刻相比,給藥組IOP明顯下降(P<0.01),模型組IOP無明顯變化(P>0.05)。

表1 補腎活血中藥對慢性EIOP SD大鼠IOP的影響(單位:mmHg)

注：與造模前比較△P<0.01;與對照組比較▲P<0.01;與造模后即刻比較☆P<0.01

3.2 補腎活血中藥對EIOP大鼠PVC神經元超微結構的影響

圖1顯示,對照組:細胞核(nucleus,N)圓形或卵圓形,胞漿中細胞器豐富,核膜完整;模型組:細胞核輪廓極不規(guī)則,核膜清晰可見,核內染色質固縮,殘存線粒體(mitochondrion,Mi)、內質網(Endoplasmic reticulum,ER)變形、空泡化、破裂,胞漿空泡化;給藥組:部分細胞核形態(tài)欠規(guī)則,核膜清晰可見,核內染色質呈聚集趨勢,線粒體、內質網輕度腫脹、變形,胞漿中細胞器減少。

圖1 PVC神經元細胞超微結構電鏡觀察(×1200)注: 1A:對照組;1B:模型組;1C:給藥組

3.3 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質Bcl-2蛋白表達的影響

表2及圖2顯示,各組以給藥組Bcl-2蛋白表達最多,其總面積、積分光密度及平均黑度值最高;對照組Bcl-2蛋白表達與給藥組無明顯差異(P>0.05);模型組Bcl-2蛋白表達相較對照組及給藥組均明顯偏低,其總面積、積分光密度及平均黑度值均低于對照組及給藥組(P<0.05或P<0.01)。

3.4 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質BAX蛋白表達的影響

表3及圖3顯示,各組以模型組Bax蛋白表達最多,其陽性染色總面積、積分光密度及平均黑度相較對照組及給藥組均明顯偏高(P<0.05),而對照組及給藥組Bax蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。

表2 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質Bcl-2蛋白表達的影響

注：與對照組比較▲P<0.01,△P<0.05;與給藥組比較★P<0.01

圖2 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質Bcl-2蛋白表達的影響(×200)注: 2A:對照組;2B:模型組;2C:給藥組

表3 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質BAX蛋白表達的影響

注：與對照組比較▲P<0.01;與給藥組比較★P<0.01,△P<0.05

圖3 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質Bax蛋白表達的影響(×200)注: 3A:對照組;3B:模型組;3C:給藥組

3.5 補腎活血中藥對慢性EIOP大鼠初級視皮質Bcl-2/Bax的影響

表4顯示,對照組及給藥組Bcl-2/Bax比率均比模型較高(P<0.05);對照組Bcl-2/Bax較給藥組無明顯差異(P<0.05)。

4 討論

近年來,PI3K/Akt信號通路(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,phosphatidylinositol 3-kinase pathway/protein kinase B,PI-3K/Akt)已成為凋亡基因調控熱點,且PI3K/Akt信號通路促進神經元存活的作用已得到許多研究的證實[12-14],但具體作用機理仍不清楚。PI3K/Akt信號通路的主要成員Bcl-2及Bax已被證實在RGCs及視神經損傷中起著重要作用,Bcl-2由Bcl-2基因編碼,是最早發(fā)現(xiàn)的抑制細胞凋亡的蛋白,其定位在線粒體膜、核外膜和內質網外膜的整合蛋白,是一種重要的抑制細胞凋亡的基因,而Bax是Bcl-2家族中最具有促進死亡特征的基因。Bcl-2與Bax基因表達水平的高低與凋亡調控直接相關,細胞內Bax表達升高時,細胞對死亡信號敏感,并加速細胞凋亡;當Bcl-2高表達時,Bax-Bax分開,Bcl-2可與Bax形成異源性二聚體,即中和了Bax-Bax促凋亡的作用,從而抑制細胞凋亡[15,16]。李翔[17]等觀察到慢性EIOP模型大鼠RGCs Bcl-2較空白組明顯降低、Bax較空白組明顯升高。Isenmann[18]等在視神經擠壓傷實驗研究中發(fā)現(xiàn),Bcl-2蛋白在神經節(jié)細胞中呈低水平表達,而Bax蛋白在損傷后表達明顯增高,認為視神經損傷后,Bax的增加與Bcl-2低水平表達導致了RGCs凋亡。以上研究均證明Bax、Bcl-2與青光眼病理損害相關的RGCs凋亡存在密切聯(lián)系,但其研究部位只局限于RGCs、視神經層次。

指標眼數(shù)總面積積分光密度對照組81．35±0．491．34±0．33模型組70．64±0．10▲★0．68±0．16▲★給藥組71．29±0．471．22±0．20F14．2877．176P0．0000．005

注：與對照組比較▲P<0.01;與給藥組比較★P<0.01

本研究檢測各組SD大鼠8周的眼壓變化情況、PVC Bcl-2、Bax蛋白表達水平,計算各組Bcl-2/Bax比率,并觀察PVC神經元電鏡超微結構,發(fā)現(xiàn)烙閉上鞏膜靜脈法制造的慢性EIOP模型可引起SD大鼠眼壓升高、PVC Bcl-2蛋白表達下調、Bax蛋白表達上升、Bcl-2/Bax比率降低、PVC神經元電鏡超微結構異常,補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)可促使SD大鼠慢性EIOP模型眼壓下降、PVC Bcl-2蛋白表達上升、Bax蛋白表達、Bcl-2/Bax比率下降及PVC神經元細胞超微結構改善,說明補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)也可能是通過作用于PI3K/AKt通路在慢性EIOP SD大鼠視皮質受損過程中發(fā)揮視功能保護作用。

前期研究也表明補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)對SD大鼠慢性EIOP模型視網膜、視神經、LGN均有一定的保護作用:可抑制視網膜神經纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和視網膜神經節(jié)細胞層(retinal ganglion cells layer,RGCL)變薄、改善RGCs超微結構,防止RGCs與RNFL損害[19,20],有助于多焦視網膜電圖(multifocal electroretinogram,mfERG)總波及1、2、3、4環(huán)P1波反應密度、總波P1波峰潛時、2環(huán)及3環(huán)N1波反應密度,3環(huán)、4環(huán)N1波峰潛時的恢復[21];上調RGCs抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促進基因Bax[17];提高視神經纖維髓鞘總面積、平均光密度值及積分光密度值,改善視神經超微結構[22];改善LGN神經元細胞密度、神經元剖面積密度、有髓纖維密度、尼氏小體積分光密度等[23]。臨床也證實補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)可改善原發(fā)性青光眼術后眼壓已控制患者的視野、P-VEP及RNFL厚度等指標,從而保護青光眼患者視神經和視功能[24,25]。

本實驗通過研究補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)對PI3K/AKt信號通路的影響,發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓的影響下,初級視皮質抗凋亡基因Bcl-2表達明顯減少,促凋亡基因Bax表達明顯增多?？赡蹷cl-2蛋白表達增多,通過異源二聚體形成抑制了Bax轉位與Bax二聚體形成,從而抑制Bax表達。隨著Bax-Bax二聚體減少,即阻斷了細胞凋亡的信號途徑,從而抑制細胞凋亡。多項研究表明青光眼與帕金森、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側索硬化癥等常見的中樞神經系統(tǒng)疾病具有相同的發(fā)病機制,即“跨突觸或跨神經元變性”[26-29]。跨神經元變性是指一組神經元受到損害后,不僅受損的神經元會發(fā)生改變,其通路遠端與受損神經元突觸聯(lián)系的靶神經元接受的傳入沖動減少,活性降低,亦出現(xiàn)退行性改變[19]。即初級視皮質的受損也許會削弱對其下級神經元RGCs的下行營養(yǎng)支持而加重RGCs病變,故補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)可能通過提高慢性高眼壓模型促使SD大鼠慢性EIOP模型眼壓下降、PVC Bcl-2蛋白表達上升、Bax蛋白表達、Bcl-2/Bax比率下降及PVC神經元細胞超微結構改善而保護受損視皮質,從而減輕PVC的下級神經元RGCs損害,而發(fā)揮保護視功能作用。

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InfluenceofBuShenHuoXueonprimaryvisualcortex'Bcl-2andBaxofPI3K/AKtpathwayinSDratmodelofchronicelevatedintraocularpressure

LIUHong-ji,LIXiang,LIXiang-yu,LIHua-hong,YANGfeng-jiao,TIANmeng-yao,WANGTai

(ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072)

ObjectiveTo observe the effect traditional Chinese medicine(TCM)of BuShenHuoXue(QijuDihuang pills and DaShen tablets)on the expression of primary visual cortex's Bcl-2 and Bax in the SD rat model of chronic EIOP,and preliminarily explore its mechanism.Methods30 SD rats were randomly and equally divided into 3 groups:control group,model group and treatment group.By unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels,the rat model of chronic EIOP was established on model group and treatment group.After given TCM drugs of BuShenHuoXue and normal saline for 8 weeks respectively,the rats were put to death.The intraocular pressure(IOP)of SD rats were measured by handheld tonometer(TONO-PEN),the protein expression of PVC's Bcl-2,Bax were detected by Immuno-histochemistry,Electron microscopy were performed to observe the ultrastructure of PVC's neurons.ResultsIOP in treatment groups and model group from models building until 8 weeks postoperation were higher compared with pre-operation,indcated that the EIOP model was successfully established.There was obviously decrease in treatment group between 8 weeks postoperation and models building,While model group was not obvious change.8 weeks postoperation,Immuno-histochemistry analysis on PVC showed that the positive expression on Bcl-2 protein of treatment group was highest,it's total area,integrated optical density and average density had not obvious difference compared with control group.while model group 's Bcl-2 positive expression(total area,integrated optical density and average density)were slower than treatment group and control group.the positive expression on Bax of model group was highest,it's total area,integrated optical density and average density were higher than treatment group and control group.treatment group had not obvious difference than control group.PVC's ultrastructure of neurons in treatment group was significantly improved compared model group.

ConclusionTCM of BuShenHuoXue(QijuDihuang pills and DaShen tablets)can promote the repairment of neurons cell of PVC in the rat model of chronic EIOP,its mechanism may be through the effect on PI3K/AKt pathway,enhance the expression of Bcl-2,dwonregulate the expression of Bax,improve ultrastructure of neurons cell and reducing IOP.

Glaucoma; Visual function protection; Primary visual cortex; Bcl-2; Bax; TCM of BuShenHuoXue(QijuDihuang pills and DaShen tablets)

國家自然科學基金資助項目(NO:81373695)-補腎活血法調控青光眼RGCs PI3K/Akt信號轉導通路的研究

610072,四川成都,成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

李翔,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.004

R775