莫偉鵬，劉遠(yuǎn)超，胡惠萍**，黃龍花，梁曉薇，謝意珍，旦真次仁

（1.廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；

3.林芝市科技開發(fā)交流服務(wù)中心，西藏 林芝 860000）

白肉靈芝菌絲體生物學(xué)特性的初步研究*

莫偉鵬1，劉遠(yuǎn)超1，胡惠萍1**，黃龍花1，梁曉薇1，謝意珍2，旦真次仁3

（1.廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；

3.林芝市科技開發(fā)交流服務(wù)中心，西藏 林芝 860000）

研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)白肉靈芝（Ganoderma leucocontextum）菌絲體生長(zhǎng)速度的影響。結(jié)果表明，白肉靈芝菌絲體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)溫度是25℃，最適pH是3.0，適宜的碳源是蔗糖和淀粉，適宜的氮源是酵母粉和牛肉膏，最佳碳氮源濃度組合是淀粉3%、蔗糖1.5%、酵母粉0.2%、牛肉膏0.2%。

白肉靈芝；生物學(xué)特性；溫度；pH；碳源；氮源

白肉靈芝（Ganoderma leucocontextum）菌蓋腎形、半圓形或扇形，大部分紅至紅褐色，幼嫩時(shí)及成熟時(shí)邊緣白至淺黃色、逐漸黃至紅褐色，成熟后接近菌柄部分暗紅褐色、暗紫紅褐色或幾乎黑紅褐色，具漆樣光澤，具同心環(huán)紋，常有弱的放射狀皺紋；菌肉白色，干后白至近白色或微帶奶油色，軟木栓質(zhì)至木栓質(zhì)；夏秋季散生至群生長(zhǎng)于青岡樹腐木上，?？拷鼧涓苫縖1]。分布于西藏與四川等西南地區(qū)[2]，是筆者團(tuán)隊(duì)新近發(fā)現(xiàn)的分布廣泛、具有藥用價(jià)值的種類。其在降血脂與降血糖等方面具有顯著作用[3-5]，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；斯ぴ耘郲6]，但菌種大多為野外采集分離得到，并直接初篩利用，對(duì)菌種的選擇缺乏科學(xué)的評(píng)價(jià)體系，目前國內(nèi)對(duì)白肉靈芝菌絲體培養(yǎng)條件的研究尚不完善，制約著優(yōu)良菌種的發(fā)掘和利用。碳源、氮源是菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而培養(yǎng)環(huán)境的pH直接影響著菌絲體的生長(zhǎng)微環(huán)境，現(xiàn)有的研究尚未對(duì)碳氮源進(jìn)行細(xì)致的研究[7]，本研究對(duì)白肉靈芝菌絲體培養(yǎng)條件即溫度、pH、碳源和氮源進(jìn)行了試驗(yàn)，為白肉靈芝的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

白肉靈芝I150021，由廣東省微生物研究所食用菌研究發(fā)展中心提供。25℃活化后轉(zhuǎn)接至綜合PDA平板上制成母種待用。

1.1.2 培養(yǎng)基

加富綜合PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、維生素B110 mg·L-1、瓊脂2%。

無碳源培養(yǎng)基即碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK1，無氮源培養(yǎng)基即碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK2，見表1。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方Tab.1 Formulation of the base medium

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基滅菌后倒入9 cm培養(yǎng)皿，每個(gè)定量20 mL制成平板培養(yǎng)基，將白肉靈芝斜面菌種轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)10 d后得到其平板菌種，用直徑5 mm打孔器在平板上同一半徑處打孔，得到完整菌塊分別接種到相應(yīng)的平板培養(yǎng)基中央，置于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.2.2 溫度對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

按照1.2.1方法制作加富綜合PDA平板培養(yǎng)基，接種白肉靈芝平板菌種后，分別置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃五個(gè)溫度梯度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d，每處理5個(gè)平行，十字劃線法測(cè)量菌落直徑，按照菌絲體日均生長(zhǎng)速度（mm·d-1）為菌落增長(zhǎng)長(zhǎng)度（mm） 除以培養(yǎng)天數(shù)（d），利用Excel2016軟件做圖，SPSS23軟件計(jì)算各處理組間的差異顯著性。

1.2.3 pH對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

設(shè)定 pH 為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5共12個(gè)梯度。對(duì)已滅菌的加富綜合PDA培養(yǎng)基保溫于50℃，在pH計(jì)（奧豪斯儀器公司，主機(jī)型號(hào)ST3100，電極型號(hào)ST230，中國） 實(shí)時(shí)測(cè)量下，利用 2 mol·L-1氫氧化鈉溶液和 2 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)備相應(yīng)pH后倒制平板。采用1.2.1的方法培養(yǎng)，用1.2.2的方法分析結(jié)果。

1.2.4 碳源對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK1中分別添加2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、淀粉，組合成供試培養(yǎng)基，制成直徑9 cm、定量20 mL的平板培養(yǎng)基，碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK1為對(duì)照組，接入菌齡一致的5 mm母種菌塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。采用1.2.2的方法分析結(jié)果。

1.2.5 氮源對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK2中分別添加0.2%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、 (NH4)2SO4、NH4NO3、麥麩、谷氨酸，組合成供試培養(yǎng)基，接種及培養(yǎng)方法同1.2.4。用1.2.2的方法分析結(jié)果。

1.2.6 最佳碳氮源濃度組合

選定適宜碳氮源和最適pH后，采用 L9(34)正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，組合成供試培養(yǎng)基，見表2。其中根據(jù)碳源、氮源試驗(yàn)結(jié)果分別選取2個(gè)適宜碳源、氮源作為試驗(yàn)的四因素，每因素設(shè)計(jì)3個(gè)含量水平，得到9個(gè)試驗(yàn)組，每組5個(gè)平行。培養(yǎng)和分析方法同1.2.4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Levels table of orthogonal test factor

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同溫度對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響見表3和圖1。

表3和圖1數(shù)據(jù)表明，白肉靈芝菌絲體在15℃～30℃，生長(zhǎng)速度大體是隨溫度升高而加快，最高達(dá)到3.93 mm·d-1，在28℃附近開始降低，隨著溫度繼續(xù)升高，生長(zhǎng)速度顯著下降，到30℃時(shí)菌絲體生長(zhǎng)速度極慢，為0.75 mm·d-1。

2.2 pH對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響見表4和圖2。

表3 不同溫度對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.3 Influence of different temperatures on the mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum

圖1 不同溫度中白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的變化Fig.1 Change of mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum in different temperatures

表4 不同pH對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.4 Effect of different pH on the mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum

圖2 不同pH中白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的變化Fig.2 Change of mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum in different pH

表4和圖2結(jié)果表明，菌絲體在pH從2.0到7.5的條件下均可以生長(zhǎng)，在pH2.0～3.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度呈加快趨勢(shì)，且pH3.0時(shí)生長(zhǎng)速度達(dá)到最高。在pH3.0～5.5范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度基本持平，隨后開始顯著下降。在pH6.0～7.0范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度與pH為2.5時(shí)處于同一水平，pH繼續(xù)升高至7.5后生長(zhǎng)速度持續(xù)下降。

2.3 碳源對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響見表5和圖3。

表5 不同碳源對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.5 Effect of different carbon sources on the mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum

表5和圖3結(jié)果表明，在不同的碳源培養(yǎng)基條件下，白肉靈芝的菌絲均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度有差異，以淀粉為碳源的培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度最快，為5.24 mm·d-1，以果糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)速度為4.30 mm·d-1和4.38 mm·d-1。對(duì)照組中，菌絲生長(zhǎng)速度較慢，為3.57 mm·d-1，而在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，說明乳糖能抑制菌絲的生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)表明適宜的碳源為淀粉和蔗糖。

圖3 不同碳源中白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度變化Fig.3 Change of mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum in different carbon sources

2.4 氮源對(duì)白肉靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響見表6和圖4。

表6 不同氮源對(duì)白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.6 Effect of different nitrogen sources on the mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum

圖4 不同氮源中白肉靈芝菌絲生長(zhǎng)速度變化Fig.4 Change of mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum in different nitrogen sources

表6和圖4結(jié)果表明，白肉靈芝菌絲在不同的氮源培養(yǎng)基上均可以生長(zhǎng)但有差異，其中在麥麩為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到6.84 mm·d-1，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)極弱，其次是酵母粉、牛肉膏和蛋白胨，生長(zhǎng)速度都超過5 mm·d-1，而酵母粉和牛肉膏培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)要略強(qiáng)于蛋白胨培養(yǎng)基，添加了谷氨酸為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度為2.10 mm·d-1，弱于對(duì)照培養(yǎng)基（3.16 mm·d-1），表明谷氨酸能夠抑制菌絲體的生長(zhǎng)，因此適宜的氮源為麥麩和酵母粉。

2.5 最佳碳氮源濃度組合

選用L9(34)正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，確定碳氮源最佳濃度組合，試驗(yàn)結(jié)果見表7，使用DPS 7.05軟件運(yùn)行方差和極差分析，得到各處理的差異顯著性，以及各因子的影響效果，并運(yùn)用SPSS 23進(jìn)行單變量多因素分析，并對(duì)各因素的水平繪制直觀圖，結(jié)果見表8和表9。

由表8和表9可知，各項(xiàng)變異來源（碳氮源）的F值在完全隨機(jī)組合模型及隨機(jī)區(qū)組模型下均具有顯著性差異。Duncan新復(fù)極差計(jì)算結(jié)果和在碳源、氮源各水平下菌絲體生長(zhǎng)量的直觀圖見表10和圖5。

由表10可知，蔗糖和淀粉的極差值分別居于第一、第二，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響最大，隨后是牛肉膏，酵母粉的影響最小。由表7可知碳氮源最佳組合為處理9，即淀粉3%、蔗糖1.5%、酵母粉0.2%、牛肉膏0.2%，即A3B3C2D1，而由圖5可知，碳氮源最佳組合為淀粉3%、蔗糖1.5%、酵母膏0.3%、牛肉膏0.2%，即A3B3C3D1。

3 結(jié)論與討論

碳氮源為真菌菌絲體提供了生長(zhǎng)和代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，碳元素構(gòu)成了細(xì)胞的基本骨架和能量，而氮元素則是合成蛋白質(zhì)、核酸的重要基礎(chǔ)。本文得到白肉靈芝最佳碳氮源組合為淀粉3%、蔗糖1.5%、酵母粉0.2%、牛肉膏0.2%。通過碳氮源的篩選試驗(yàn)可知，白肉靈芝菌絲體對(duì)碳源的利用范圍較廣泛，葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖均能用于菌絲體的培養(yǎng)，通過對(duì)照發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝分別在無碳源和乳糖的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)很弱，在蔗糖和淀粉的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，故其適宜的碳源為蔗糖和淀粉。通過氮源篩選試驗(yàn)可知白肉靈芝在蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、麥麩為氮源的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，以牛肉膏和酵母粉最佳，與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)谷氨酸不適合作為氮源，可能的原因是谷氨酸的酸性難以使瓊脂凝固導(dǎo)致培養(yǎng)基含水量過多，從而抑制菌絲體的生長(zhǎng)。

表7 白肉靈芝菌絲體L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 L9(34)orthogonal experiment results of Ganoderma leucocontextum mycelium

表8 碳氮源正交試驗(yàn)方差分析表（完全隨機(jī)組合模型）Tab.8 Orthogonal experiment ANOVA table of carbon and nitrogen sources(Completely random combination model)

表9 白肉靈芝碳氮源正交實(shí)驗(yàn)方差分析表（隨機(jī)區(qū)組模型）Tab.9 Orthogonal experiment ANOVA table of carbon and nitrogen sources(Random block model)

表10 Duncan新復(fù)極差計(jì)算結(jié)果Tab.10 Calculate result of Duncan’s new multiple range test

正交試驗(yàn)不同軟件的分析結(jié)果，對(duì)氮源的種類和含量稍有出入，即酵母粉的最佳組合略有不同，可能是由于SPSS軟件估算值的準(zhǔn)確性不足導(dǎo)致的，也有可能是因?yàn)檎辉囼?yàn)的局限性，但是2種軟件的分析結(jié)果均認(rèn)為蔗糖和淀粉對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)影響最大。

溫度的篩選結(jié)果與白肉靈芝野外生長(zhǎng)環(huán)境基本吻合，經(jīng)過多次試驗(yàn)得到驗(yàn)證，pH單因素的篩選結(jié)果表明白肉靈芝菌絲體在生長(zhǎng)過程中具有強(qiáng)耐酸性，適宜生長(zhǎng)的pH范圍為3.0～5.5，最適pH為3.0。據(jù)報(bào)道其他靈芝菌株的菌絲體適宜生長(zhǎng)在偏酸培養(yǎng)基下，pH范圍為5.5～6.5[8-10]。因此，白肉靈芝在耐酸性上與其他靈芝存在明顯差異。具體原因目前尚未有相關(guān)報(bào)道，需待進(jìn)一步研究。

在白肉靈芝的栽培中，筆者發(fā)現(xiàn)它比普通赤芝的抗逆性稍差，從其菌絲的生物學(xué)特性來看，按照常規(guī)pH進(jìn)行生產(chǎn)可能是導(dǎo)致其抗逆性差的原因之一。而且在菌絲生長(zhǎng)階段耐酸性強(qiáng)，不代表在子實(shí)體生長(zhǎng)階段有相似的特點(diǎn)，下一步將針對(duì)白肉靈芝的子實(shí)體生長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證研究。

圖5 在碳源、氮源各水平下菌絲體生長(zhǎng)量的直觀圖Fig.5 An intuitive figure of mycelium growth under different levels of carbon and nitrogen sources

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日本：榆黃蘑成為國際食用菌市場(chǎng)搶手品種

據(jù)《日本經(jīng)濟(jì)新聞》報(bào)道，日本北海道南幌町鎮(zhèn)一家菇房?jī)?nèi)，榆黃蘑長(zhǎng)勢(shì)喜人，員工欣喜不已。據(jù)了解，榆黃蘑因抗疲勞、耐缺氧和抗氧化等食用功效在國際食用菌市場(chǎng)較為搶手，尤其深受日本、歐洲、北美洲等國家消費(fèi)者青睞。據(jù)相關(guān)負(fù)責(zé)人介紹，榆黃蘑味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，可入藥，其富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此外，榆黃蘑脂肪含量低，但不飽和脂肪酸含量卻很高，經(jīng)常食用可有效降低血脂、預(yù)防肥胖和心血管疾病。

中國食用菌商務(wù)網(wǎng) 2017.11.02

Preliminary Study on Biological Characteristics of Ganoderma leucocontextum

MO Wei-peng1,LIU Yuan-chao1,HU Hui-ping1,HUANG Long-hua1,LIANG Xiao-wei1,XIE Yi-zhen2,TAMDRIN Tsering3,
(1.Guangdong Institute of Microbiology,State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application,Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology,Guangzhou 510070,China;2.Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co.Ltd.,Guangzhou 510663,China;3.The Technological Developmnet Exchange Service Center of Linzhi,Linzhi 860000,China)

The effects of different culture conditions on the mycelium growth rate of Ganoderma leucocontextum were studied.The results showed that the optimum culture temperature of G.leucocontextum mycelium was 25℃,the suitable pH value was 3.0,the suitable carbon source was sucrose and starch,the suitable nitrogen source was yeast,and beef extract and the optimum concentration combination of carbon and nitrogen sources was starch 3%,sucrose 1.5%and beef extract 0.2%.

Ganoderma leucocontextum;biological characteristics;temperature;pH;carbon source;nitrogen source

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0033-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.007

市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（201508020095）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016B020212008）。

莫偉鵬（1992-），男，本科，助理研究員，主要從事食（藥）用菌栽培研究工作。E-mail:704268018＠qq.com

**通信作者：胡惠萍（1974-），女，本科，高級(jí)工程師，主要從事食（藥）用菌野生資源、育種和馴化等方面研究工作。E-mail:hhp201＠126.com

2017-09-20