鄭 鑫，陶春雨，徐嘉潞，陳妍胥，謝鯤鵬

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081）

3種生長素對蛹蟲草液體發(fā)酵的影響

鄭 鑫，陶春雨，徐嘉潞，陳妍胥，謝鯤鵬*

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081）

研究了3種生長素，吲哚丁酸（IBA）、α-萘乙酸（NAA）、2,4-D在不同濃度下對蛹蟲草液體培養(yǎng)的影響。通過測定不同濃度下蛹蟲草生物量以及胞內(nèi)、胞外多糖的含量，確定了3種生長素使用的最佳質(zhì)量濃度，并對各濃度下蛹蟲草的生長情況進(jìn)行了分析與討論。結(jié)果表明，在生物量方面，IBA的質(zhì)量濃度為3 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大為21.50 g，比對照組提高了11.30%。NAA的質(zhì)量濃度為1 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大為16.20 g，比對照組提高了32.80%。2,4-D對蛹蟲草生物量的累積起抑制作用。在胞外多糖方面，IBA和2,4-D均起抑制作用，NAA在1 mg·L-1時(shí)起抑制作用，但其質(zhì)量濃度為5 mg·L-1時(shí)，胞外多糖累積量達(dá)到最大為85.60 mg，比對照組提高了80.30%。在胞內(nèi)多糖方面，3種生長素均起促進(jìn)作用。當(dāng)加入質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的NAA時(shí)，胞內(nèi)多糖累積量達(dá)到最大為117.93 mg，比對照組提高了275.36%。

生長素；蛹蟲草；液體培養(yǎng)；蟲草多糖

蛹蟲草（Cordyceps militaris） 又叫北冬蟲夏草，是1種能寄生于多種鱗翅目昆蟲蛹和幼蟲的蟲草菌[1]，為子囊菌亞門（Ascomycotina） 子囊菌綱（Ascomycetes） 肉座菌目 （Hypocreaceae） 蟲草屬（Cordyceps） 真菌，蛹蟲草可代替冬蟲夏草入藥[2]。從蛹蟲草中提取的活性物質(zhì)具有降血壓、抗腫瘤、抗疲勞和調(diào)節(jié)免疫功能等重要作用[3]。其中，蟲草多糖是蛹蟲草的主要活性成分[4]。因野生蛹蟲草較為稀少，導(dǎo)致其價(jià)格昂貴。植物生長調(diào)節(jié)劑是在植物激素基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一類人工合成的化學(xué)物質(zhì)，具有與植物天然激素相同的活性作用[5]。IBA可影響植物生根過程中部分生理生化變化[6]。NAA是1種外源生長調(diào)節(jié)激素，2,4-D和NAA在低濃度下有促進(jìn)作物生長發(fā)育作用[7-8]。

目前已有學(xué)者將生長素用于巨大口蘑、香菇、黑木耳、白靈菇、平菇[9-13]的培養(yǎng)，但其在蛹蟲草液體發(fā)酵方面的研究還鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

蛹蟲草菌種，由遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

吲哚丁酸、α-萘乙酸、2,4-D（分析純），由遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、維生素B110 mg，pH6。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、維生素B110 mg，pH6。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌株活化

將保藏的菌種接于新制的斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d。待菌種長滿斜面后，用接種鏟取出2 cm2的斜面菌種接于100 mL液體培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱靜置48 h，再置于25℃、120 r·min-1搖床上震蕩培養(yǎng)5 d，制備液體菌種用于下一步試驗(yàn)。

1.3.2 液體培養(yǎng)

分別將各生長素添加到液體培養(yǎng)基中，使各生長素的終濃度分別為 0、1 mg·L-1、3 mg·L-1、5 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，250 mL三角瓶裝液100 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫后按5%接種量接入液體菌種，于25℃、120 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)3 d。

1.4 測定方法

1.4.1 菌絲體生物量的測定

濕重：取20 mL培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心20 min，水洗，再離心，重復(fù)3次。收集菌絲體，電子天平稱量。

干重：按上述方法離心、水洗，沉淀物60℃烘干至恒重，冷卻到常溫，電子天平稱量[14]。

1.4.2 多糖的提取和測定

胞外多糖的提?。喝∨囵B(yǎng)液，減壓濃縮至20%，加入3倍體積95%乙醇醇析12 h，沉淀多糖，4 000 r·min-1離心10 min，沉淀用無水乙醇、丙酮各洗1次，60℃烘干，得灰白色粗多糖[15]。

胞內(nèi)多糖的提?。簩⒑娓珊蟮木z體粉碎，稱5 g粉末加入25 mL蒸餾水，95℃～100℃水浴浸提2 h后，用蒸餾水定容至25 mL，加入3倍體積的無水乙醇，4℃靜置沉淀 12 h，4 000 r·min-1離心 10 min，棄上清，沉淀為多糖[16]。

多糖的檢測：苯酚-硫酸比色法[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長素對蛹蟲草生物量的影響

2.1.1 生長素對濕重的影響

添加不同濃度的IBA、NAA和2,4-D對濕重的影響見圖1。

圖1 生長素對蛹蟲草濕重的影響Fig.1 Effects of auxin on the wet weight of Cordyceps militaris

由圖1可知，IBA濃度為1 mg·L-1時(shí)濕重小于對照組，即低濃度的IBA抑制菌絲生長，但當(dāng)IBA濃度升至3 mg·L-1時(shí)濕重最重，比對照組增加了3.2 g/20mL，提高了16.58%。NAA濃度為5 mg·L-1時(shí)濕重小于對照組，即高濃度的NAA抑制菌絲生長，但當(dāng)濃度降至1 mg·L-1時(shí)濕重最重，比對照組增加了4.4 g/20mL，提高了22.80%。2,4-D處理的濕重均低于對照組，即對菌絲生長起抑制作用。陳申寬等[18]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的NAA促進(jìn)平菇菌絲生長，使其生長速度加快、生長勢強(qiáng)壯，加速對培養(yǎng)料的分解、吸收、運(yùn)輸和積累。

2.1.2 生長素對干重的影響

添加不同濃度的IBA、NAA和2,4-D對干重的影響見圖2。

圖2 生長素對蛹蟲草干重的影響Fig.2 Effects of auxin on the dry weight of Cordyceps militaris

由圖2可知，IBA濃度為1 mg·L-1時(shí)干重小于對照組，但當(dāng)其濃度升至3 mg·L-1時(shí)干重最重，比對照組增加了2.0 g/20mL，提高了16.39%。NAA濃度為5 mg·L-1時(shí)干重小于對照組，但當(dāng)其濃度降至1 mg·L-1時(shí)干重最重。比對照組增加了4.0 g/20mL，提高了32.79%。2,4-D處理的菌株干重均低于對照組，對菌絲生長起抑制作用。

2.2 生長素對蛹蟲草多糖的影響

2.2.1 生長素對蛹蟲草胞外多糖的影響

將添加了不同濃度生長素的培養(yǎng)液離心，取上清液，并稀釋50倍，測定490 nm處吸光值，由多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)胞外多糖含量。具體的結(jié)果見表1。

表1 胞外多糖含量測定結(jié)果Tab.1 Determination results of extracellular polysaccharide content

由表1可見，IBA處理后，胞外多糖含量均低于對照組，即IBA對胞外多糖的累積起抑制作用。NAA 在 1 mg·L-1～3 mg·L-1范圍內(nèi)，試驗(yàn)組數(shù)值均低于對照組，當(dāng)濃度升至5 mg·L-1時(shí)，試驗(yàn)組胞外多糖含量達(dá)到最大，為85.604 mg，比對照組提高了80.35%，即NAA在低濃度時(shí)抑制胞外多糖的累積，而在高濃度時(shí)起促進(jìn)作用；2,4-D處理后，胞外多糖含量均低于對照組，即對胞外多糖的累積起抑制作用。

2.2.2 生長素對蛹蟲草胞內(nèi)多糖的影響

將浸提得到的胞內(nèi)多糖稀釋50倍，測定490 nm處吸光值，由多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的胞內(nèi)多糖含量。具體結(jié)果見表2。

表2 胞內(nèi)多糖含量測定結(jié)果Tab.2 Determination results of intracellular polysaccharide content

從表2可以看出，加入3種生長素后，胞內(nèi)多糖的含量均明顯增加。當(dāng)IBA的濃度在1 mg·L-1～5 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，胞內(nèi)多糖含量逐漸增加。當(dāng)NAA濃度為1 mg·L-1時(shí)，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到最大117.93 mg，比對照組提高了275.36%，此后隨濃度的增加，胞內(nèi)多糖含量累積逐漸減少；當(dāng)NAA濃度為5 mg·L-1時(shí)起抑制作用，即NAA在低濃度時(shí)促進(jìn)胞內(nèi)多糖的累積。2,4-D處理的胞內(nèi)多糖含量均高于對照組，即2,4-D對胞內(nèi)多糖產(chǎn)量起促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)將不同濃度生長素應(yīng)用于蛹蟲草的液體培養(yǎng)，考察其對蛹蟲草有效成分累積的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，當(dāng)IBA的質(zhì)量濃度為3 mg·L-1時(shí)，對蛹蟲草生物量的促進(jìn)效果最好。當(dāng)NAA為1 mg·L-1時(shí)，生物量達(dá)到最大為16.20 g，比對照組提高了32.8%。2,4-D對生物量的累積起抑制作用。IBA和2,4-D對胞外多糖的累積均起抑制作用，NAA在低濃度時(shí)呈抑制作用，但當(dāng)濃度為5 mg·L-1時(shí)，胞外多糖含量達(dá)到最大值85.60 mg，比對照組提高了80.3%。3種生長素對胞內(nèi)多糖的累積均具促進(jìn)作用。

本試驗(yàn)為蛹蟲草大規(guī)模生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)對食用菌栽培中合理利用植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)給予指導(dǎo)。

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Effect of Three Kinds of Auxin on the Liquid Fermentation of Cordyceps militaris

ZHENG Xin,TAO Chun-yu,XU Jia-lu,CHEN Yan-xu,XIE Kun-peng
(Liaoning Normal University,Dalian 116081,China)

Effect of different concentrations of three kinds of auxin (indole butyric acid(IBA),alpha naphthyl acetic acid(NAA)and 2,4-D)on liquid fermentation of Cordyceps militaris was studied.By detecting the biomass of C.militaris and the content of intracellular and extracellular polysaccharide under different concentrations,the optimum mass concentration of the three kinds of auxin was identified,and the growth of C.militaris under different concentrations was analyzed and discussed.The results showed that in terms of biomass,with a maximum 21.50 g when the mass concentration of IBA was 3 mg·L-1,which was 11.30%higher than the control group.Meanwhile the biomass reached the maximum 16.20 g when the mass concentration of NAA was 1 mg·L-1,which was 32.80%higher than the control group.In addition,2,4-D had an inhibitory effect on C.militaris biomass accumulation.In terms of extracellular polysaccharide,IBA and 2,4-D both had an inhibitory effect and NAA had an inhibitory effect when the mass concentration was 1 mg·L-1,but when the mass concentration was 5 mg·L-1,the accumulation of exopolysaccharide reached the maximum of 85.60 mg,which was 80.30%higher than the control group.In terms of intracellular polysaccharides,the three kinds of auxin played a promoting role.When adding NAA which the mass concentration was 1 mg·L-1,the accumulation of intracellular polysaccharide reached the maximum 117.93 mg,which was 275.36%higher than the control group.

auxin;Cordyceps militaris;liquid culture;Cordyceps polysaccharide

鄭鑫（1995-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭秤镁囊后w培養(yǎng)。E-mail:15724590021＠163.com

*通信作者：謝鯤鵬（1976-），男，碩士，講師，主要從事微生物及食用菌的教學(xué)和科研工作。E-mail:xkp_1995＠sina.com

2017-09-15

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0068-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.015