劉曉婷，郭九峰**，王淑妍，孫國(guó)琴，李亞嬌，那 日

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院離子束生物工程自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

〈育種與馴化〉

蒙古口蘑交配型鑒定分析*

劉曉婷1，郭九峰1**，王淑妍1，孫國(guó)琴2，李亞嬌2，那 日1

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院離子束生物工程自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

對(duì)3株野生蒙古口蘑Tricholoma mongolicum Imai.子實(shí)體進(jìn)行擔(dān)孢子收集，采用單孢稀釋法分離鑒定得到300株蒙古口蘑單孢菌絲體，利用三輪交配法對(duì)其中101株進(jìn)行交配型鑒定，試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，并對(duì)4種不同交配型的單核菌株進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記驗(yàn)證。結(jié)果顯示，可觀察到典型的4種交配反應(yīng)菌落形態(tài)并可用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)加以區(qū)分驗(yàn)證。所得蒙古口蘑交配類(lèi)型屬于四極性交配系統(tǒng)，為A、B因子互不連鎖的雙因子控制。

蒙古口蘑；單核菌絲；三輪交配法；ISSR；交配類(lèi)型

蒙古口蘑 （Tricholoma mongolicum Imai.）[1]為我國(guó)北方草原上生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)野生食用菌，在內(nèi)蒙古地區(qū)，尤以錫林郭勒盟產(chǎn)出的蘑菇最為人喜愛(ài)，又名草原口蘑、白蘑菇[2]、白（口）蘑、蒙古白麗蘑等，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota） 擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 口蘑屬（Tricholoma） 或白麗蘑屬（Leucocalocybe）[3-4]，其子實(shí)體中等大，菌蓋直徑5 cm～17 cm，白色且光滑，半球狀至平展，初期邊緣內(nèi)卷，菌褶白色稠密、不等長(zhǎng)，菌柄白色且粗壯，基部稍膨大，菌肉肥厚，具香氣味，是當(dāng)?shù)啬撩褡孀孑呡叾枷矏?ài)的傳統(tǒng)美食[5-6]。其富含人體所需必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富且均衡，又具藥用價(jià)值，能起到一定的抗癌作用，可輔助治療病毒性疾病，提高人體免疫力，較好地預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等[7-9]。據(jù)當(dāng)?shù)氐哪撩駛冎v，在二十多年以前，夏秋季節(jié)常出現(xiàn)蒙古口蘑蘑菇圈現(xiàn)象。但現(xiàn)如今受各種因素影響，蒙古口蘑生態(tài)環(huán)境遭受較為嚴(yán)重的破壞，其資源也越來(lái)越少，目前已被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第二批）》。自1992年田紹義[10]在《真菌學(xué)報(bào)》上第1次報(bào)道成功馴化栽培蒙古口蘑后，國(guó)內(nèi)外再?zèng)]有報(bào)道顯示有其馴化成功的情況。截至日前，蒙古口蘑人工栽培也未取得相關(guān)研究進(jìn)展。

交配類(lèi)型是遺傳學(xué)問(wèn)題中較為基礎(chǔ)且重點(diǎn)的研究對(duì)象，為食（藥）用菌遺傳育種的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)性資料[11-12]。近些年，食（藥）用菌遺傳育種的探索愈加深入[13-15]，而基礎(chǔ)性生物學(xué)的試驗(yàn)研究卻少見(jiàn)報(bào)道，更未見(jiàn)蒙古口蘑交配型系統(tǒng)鑒定的試驗(yàn)報(bào)道。探明蒙古口蘑的交配型系統(tǒng)，旨在為進(jìn)一步研究蒙古口蘑交配型基因等其他功能基因提供相應(yīng)的參考，以期指導(dǎo)蒙古口蘑的遺傳育種研究工作，為研究草原珍稀食用菌的遺傳學(xué)及生物學(xué)習(xí)性，加速其馴化和育種研究等提供基礎(chǔ)依據(jù)，為野生食（藥）菌的開(kāi)發(fā)和市場(chǎng)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用蒙古口蘑子實(shí)體采自?xún)?nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒草原，為蒙古口蘑核心生長(zhǎng)區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基、主要試劑與儀器

MS＋平板培養(yǎng)基：市購(gòu)MS培養(yǎng)基，另外加1.5 g·L-1酵母浸出粉和1.5 g·L-1酸水解酪蛋白，自然pH[16]；齊氏（Ziehl）石炭酸復(fù)紅染液、Taq PCR Master Mix等；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)儀等。

1.3 擔(dān)孢子的收集和單核體分離

分子鑒定：取少量口蘑組織，提取DNA，用真菌18S rRNA和ITS4通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16]。

分別將編號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的3個(gè)新鮮成熟的蒙古口蘑子實(shí)體用小刀削去少許菌柄，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精擦拭菇體表面進(jìn)行消毒，再用無(wú)菌水快速?zèng)_洗菇體表面3次，用滅菌的吸水紙將菇體表面水分盡量吸干。采用常規(guī)孢子彈射法收集擔(dān)孢子，收集得到的孢子印低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

采用常規(guī)單孢稀釋法制備孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板挑選稀釋至100 μL含40個(gè)～60個(gè)擔(dān)孢子的稀釋度，作為該試驗(yàn)的擔(dān)孢子懸液，涂布平板，25℃避光培養(yǎng)。培養(yǎng)后跟蹤觀察，待孢子萌發(fā)形成肉眼可見(jiàn)微小菌落時(shí)，立刻挑取單菌落分別轉(zhuǎn)移至新的MS＋平板培養(yǎng)基上進(jìn)行插片培養(yǎng)[17]。

1.4 單孢萌發(fā)菌株的鑒定

一段時(shí)間后，上述新的MS＋平板上的菌落長(zhǎng)大且延伸生長(zhǎng)到蓋玻片上后，直接取出制作玻片，以齊氏（Ziehl）石炭酸復(fù)紅染液染色1 min～2 min后，鏡檢，無(wú)鎖狀聯(lián)合者判定為單核菌絲。挑選300株單核菌絲，順序編號(hào)，人工氣候室避光培養(yǎng)備用。

1.5 單核體雜交和雙核體檢出

分別對(duì)供試單核體菌落取直徑0.6 cm的圓塊，在新的培養(yǎng)基上距離2 cm接種2個(gè)單核體培養(yǎng)塊，約20 d兩單核菌絲體接觸后，繼續(xù)培養(yǎng)4 d～6 d，觀察交接區(qū)菌絲體生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，并制片鏡檢，以鎖狀聯(lián)合情況判斷雙核體情況。

1.6 交配型鑒定試驗(yàn)

三輪交配[18]試驗(yàn)：收集的孢子經(jīng)培養(yǎng)后鑒定出來(lái)的單核菌絲體中，隨機(jī)取出101個(gè)，順序編號(hào)為Ⅰ1～Ⅰ101。第1輪：從101株單核菌絲體中隨機(jī)選1株作為T(mén)1，T1與其余100株單核菌絲體分別交配，經(jīng)檢驗(yàn)，隨機(jī)挑選1株與T1發(fā)生親和的設(shè)T2；第2輪：將T2與上輪與T1不親和的菌株分別配對(duì)，經(jīng)檢驗(yàn)，隨機(jī)挑選1株與T2不親和的設(shè)為T(mén)3；第3輪：將T3與上一輪中其余菌株分別配對(duì)，經(jīng)檢驗(yàn)，隨機(jī)挑選1一株與T3親和的設(shè)為T(mén)4。根據(jù)“親和”、“平貼”、“柵欄”等菌落形態(tài)觀察和鏡檢有無(wú)鎖狀聯(lián)合來(lái)統(tǒng)計(jì)各輪各種反應(yīng)數(shù)量，并推斷每組的交配型，確定蒙古口蘑交配類(lèi)型。重復(fù)3次（編號(hào)Ⅰ～Ⅲ）。

1.7 交配型實(shí)得比例的χ2檢驗(yàn)

卡方檢驗(yàn)上述試驗(yàn)結(jié)果，公式為：

式中：Oi即每種交配數(shù)的實(shí)際觀測(cè)值；Ei即固定交配類(lèi)型下每種交配數(shù)的理論值。

1.8 蒙古口蘑不同交配型ISSR分子鑒定

以蒙古口蘑單核菌絲體DNA為模板，設(shè)計(jì)并篩選ISSR引物，從分子水平上對(duì)不同交配基因型蒙古口蘑單核菌株進(jìn)行分類(lèi)。

20 μL PCR 反應(yīng)體系：10 μL 2×Taq PCR Master Mix、1 μL引物（10 pmol·μL-1）、1 μL DNA模板、8 μLddH2O。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min。4℃保存。

電泳條件：1.5%瓊脂糖凝膠，恒壓100 V，30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核菌絲的鑒別與形態(tài)觀察

單核菌絲在光學(xué)顯微鏡油鏡下（1 000×）鏡檢，無(wú)鎖狀聯(lián)合者為單核菌絲。

2.2 蒙古口蘑擔(dān)孢子交配類(lèi)型鑒定結(jié)果

采用三輪交配法，第1次試驗(yàn)：第1輪選T1為Ⅰ1，Ⅰ1與其余100株單核菌絲體交配，共100個(gè)試驗(yàn)皿，經(jīng)檢驗(yàn)，其中與Ⅰ1發(fā)生親和菌株個(gè)數(shù)為37個(gè)，從中隨機(jī)挑選Ⅰ52設(shè)為T(mén)2；第2輪將T2與上一輪與Ⅰ1不親和的63個(gè)菌株交配，經(jīng)檢驗(yàn)，其中與Ⅰ52發(fā)生親和菌株個(gè)數(shù)為23個(gè)，不親和的40個(gè)，從與中隨機(jī)挑選Ⅰ6設(shè)為T(mén)3；第3輪將T3與上一輪中與Ⅰ52不親和的其余39個(gè)菌株交配，經(jīng)檢驗(yàn)，與Ⅰ6發(fā)生親和反應(yīng)的菌株個(gè)數(shù)為10個(gè)，從中隨機(jī)挑選Ⅰ63設(shè)為 T4。

在進(jìn)行本次交配反應(yīng)時(shí)，可以明顯觀察到有4種基本的菌落反應(yīng)形態(tài)，見(jiàn)圖1。親和反應(yīng)，兩菌株菌落交界處，菌落形態(tài)明顯不同，常表現(xiàn)為高聳，而且白色加深，菌絲凝結(jié)很難挑?。▓D1A）；柵欄反應(yīng)，兩菌株菌落屬于不親和反應(yīng)，各自生長(zhǎng)，在交界處形成明顯的“溝壑”，此處無(wú)菌絲體生長(zhǎng)，且兩菌落在近交界處表現(xiàn)為明顯的相互抑制（圖1B）；平貼反應(yīng)，兩菌株菌落屬于不親和反應(yīng)，各自生長(zhǎng)，在交接處沒(méi)有明顯的“柵欄”，而是有“平貼”現(xiàn)象，這種不親和可能也是1種相互抑制的生長(zhǎng)（圖1C）；無(wú)交界的不親和反應(yīng)，兩菌株菌落也屬于不親和反應(yīng)，各自生長(zhǎng)，兩菌落交接處既不形成形態(tài)不同的親和菌絲體，也不形成“溝壑”或“平貼”的抑制反應(yīng)，而是互不影響，最終兩菌落全部長(zhǎng)到一起，難分彼此（圖1D）。

統(tǒng)計(jì)4種反應(yīng)數(shù)量，比值大約為1:1:1:1，可初步判定蒙古口蘑屬四極性交配系統(tǒng)。根據(jù)四極性交配反應(yīng)原理，親和反應(yīng)為基因型AxBy×AyBx的兩株菌株交配，柵欄反應(yīng)為基因型AxBx×AyBx的兩株菌株交配，平貼反應(yīng)為基因型AxBx×AxBy的兩株菌株交配，無(wú)交界不親和反應(yīng)為基因型AxBx×AxBx的兩株菌株交配（x=1或2；y=1或2）?？赏茢啾敬卧囼?yàn)的T1、T2、T3、T4的交配基因型：若設(shè)T1交配型為A1B1，則 T2交配型為 A2B2，則 T3交配型為 A1B2或 A2B1，若T3交配型為A1B2，則T4交配型為A2B1，若T3交配型為A2B1，則T4交配型為A1B2。

圖1 四種交配反應(yīng)菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of four mating reactions

2.3 交配型實(shí)得比例的χ2檢驗(yàn)結(jié)果

三輪交配情況（3次重復(fù)試驗(yàn)）見(jiàn)表1。

以第1次試驗(yàn)第1輪反應(yīng)為例，將4種交配型基因?qū)?yīng)的反應(yīng)數(shù)卡方檢驗(yàn)：

χ2=(37-25)2/25+(24-25)2/25+(20-25)2/25+(19-25)2/25=7.078，P待測(cè)=7.078

自由度n=3時(shí)，查χ2表知P0.050=7.81＞7.078，所以P待測(cè)＞0.05，代表實(shí)測(cè)值與理論值差異不顯著，即蒙古口蘑4種擔(dān)孢子單核菌株的比例符合1∶1∶1∶1，A、B因子在減數(shù)分裂時(shí)自由組合，這一結(jié)果表明蒙古口蘑交配類(lèi)型屬于四極性交配系統(tǒng)，為A、B因子互不連鎖的雙因子控制系統(tǒng)。

2.4 ISSR分子鑒定結(jié)果

以上述結(jié)果中第1次試驗(yàn)篩選出的4種不同交配型單核菌株Ⅰ1、Ⅰ52、Ⅰ6和Ⅰ63的DNA為模板，以 13號(hào)引物 （5’-3’）：GAGAGAGAGAGAGA GATG，做PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖3可以看出，4種不同交配型單核菌株Ⅰ1、Ⅰ52、Ⅰ6和Ⅰ63的隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物，從條帶數(shù)量與位置均有不同，再次從分子角度進(jìn)一步驗(yàn)證有4種不同基因型的試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

表1 重復(fù)試驗(yàn)三輪交配情況Tab.1 Mating situation of repeated tests

圖2 蒙古口蘑單核菌絲體ISSR-PCR結(jié)果Fig.2 ISSR-PCR result of primary hypha of Tricholoma mongolicum

通過(guò)上述結(jié)果，可得出以下幾點(diǎn)結(jié)論。

蒙古口蘑單核菌絲交配時(shí)，可以觀察到典型的4種交配反應(yīng)：親和反應(yīng)、柵欄反應(yīng)、平貼反應(yīng)、無(wú)交界不親和反應(yīng)；含不同交配型基因的蒙古口蘑單核菌絲體可用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)加以區(qū)分和驗(yàn)證；所得蒙古口蘑交配類(lèi)型屬于四極性交配系統(tǒng)，為A、B因子互不連鎖的雙因子控制系統(tǒng)。

3.2 討論

傳統(tǒng)的真菌交配型鑒定方法為單核菌株兩兩之間進(jìn)行交配，僅一輪統(tǒng)計(jì)交配反應(yīng)類(lèi)型和數(shù)量，便可推斷交配類(lèi)型，但這樣組合數(shù)量巨大，如101株單核菌株兩兩之間互相交配，有5 050個(gè)組合（C2101=5050）。而三輪交配法[18]以?xún)蓛山慌涞脑頌榛A(chǔ)，通過(guò)每一輪交配選出同類(lèi)型反應(yīng)，有效降低試驗(yàn)數(shù)量，大幅度降低工作量，同時(shí)，與原生質(zhì)體雜交的鑒定方法相比，該方法也具有操作簡(jiǎn)單的明顯優(yōu)勢(shì)，加之三輪交配法建立在統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理之上，試驗(yàn)結(jié)果可靠，故本試驗(yàn)選擇該方法對(duì)蒙古口蘑交配型進(jìn)行鑒定分析。

另外，試驗(yàn)中兩菌株交配反應(yīng)的菌落表現(xiàn)，可以大致區(qū)分出反應(yīng)類(lèi)型，如親和反應(yīng)在交界處有明顯的不同菌絲體形態(tài)，不親和反應(yīng)在交界處有明顯的互相抑制生長(zhǎng)的菌落形態(tài)。但在實(shí)際操作過(guò)程中，一定要結(jié)合光學(xué)顯微鏡檢查是否有鎖狀聯(lián)合去判斷反應(yīng)是否為親和，一方面為了再一次確定表現(xiàn)明顯的反應(yīng)，另一方面為了驗(yàn)證一些表現(xiàn)不明顯的或無(wú)代表性表型[19]的交配反應(yīng)類(lèi)型，確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

ISSR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食用菌遺傳育種方面[20-21]。該技術(shù)能從分子水平揭示出菌株間的遺傳差異、親緣關(guān)系及篩選與待測(cè)基因緊密連鎖的基因片段，為育種時(shí)選育親本原料提供具有針對(duì)性、準(zhǔn)確的遺傳信息，有利于選育出產(chǎn)量高、品質(zhì)好的優(yōu)良品種。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在國(guó)內(nèi)食用菌交配型分析、遺傳多樣性及育種方面已有大量報(bào)道[22-23]。本文驗(yàn)證了ISSR技術(shù)可對(duì)蒙古口蘑單核菌絲加以區(qū)分并進(jìn)行分類(lèi)，若將大量的蒙古口蘑單核菌絲進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記，可分類(lèi)后統(tǒng)計(jì)每類(lèi)數(shù)量，進(jìn)行蒙古口蘑4種擔(dān)孢子單核菌株比例1∶1∶1∶1，以及A、B因子在減數(shù)分裂時(shí)自由組合的驗(yàn)證。故將其與三輪交配法配合使用，可進(jìn)一步增加試驗(yàn)結(jié)果的可信度。

綜上，本文利用經(jīng)典的三輪交配法對(duì)野生珍稀食（藥）用菌蒙古口蘑進(jìn)行了交配型鑒定分析，確定了蒙古口蘑的交配類(lèi)型屬于四極性交配系統(tǒng)，并驗(yàn)證了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可結(jié)合三輪交配法應(yīng)用于蒙古口蘑單核菌絲的分類(lèi)與交配型鑒定，為日后對(duì)蒙古口蘑遺傳育種、人工馴化與栽培的相關(guān)研究提供資料，為其市場(chǎng)化開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

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（2）未曾以任何形式、用任何文種在國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)表過(guò)；

（3）論文的內(nèi)容不侵犯他人著作權(quán)和其他權(quán)利，否則著作權(quán)人將承擔(dān)由于論文內(nèi)容侵權(quán)而產(chǎn)生的全部責(zé)任，并賠償由此給《中國(guó)食用菌》編輯部造成的全部損失。并承諾：

（1）以后不將以任何形式在其他任何地方發(fā)表該論文；

（2）此聲明對(duì)全體著作權(quán)人均有約束力；

（3）著作權(quán)人保證其本人具有代表其他著作權(quán)人做出各項(xiàng)承諾之權(quán)利。

注：不同意上述轉(zhuǎn)讓聲明的著作權(quán)人，在收到論文刊用通知5日內(nèi)書(shū)面回復(fù)《中國(guó)食用菌》編輯部。

Identification for Mating Type of Tricholoma mongolicum

LIU Xiao-ting1,GUO Jiu-feng1,WANG Shu-yan1,SUN Guo-qin2,LI Ya-jiao2,NA Ri1
（1.Key Laboratory of Ion Beam Biotechnology,College of Physical Science and Technology,Inner Mongolia University,Huhhot 010021,China;2.Institute of vegetables,Inner Mongolia Academy of Agriculture and Livestock Sciences,Hohhot 010031,China）

This study is to identificate for mating type of Tricholoma mongolicum by three rounds of mating method.We first collected the basidiospores of three strains of wild T.mongolicum,and 300 strains of mononuclear myceliums were obtained by single spore dilution method.Then the mating type on the 101 strains were tested and the chi-square test to the results were made.It was verified the four different mating type of mononuclear myceliums by ISSR molecular markers.The results showed that edible fungi of T.mongolicum belonged to the typical tetrapolar heterothallic mating system.It can be observed typical four mating reactions of their colony morphology and can be used ISSR molecular markers to distinguish validation.

Tricholoma mongolicum;mononuclear mycelium;three rounds of mating method;ISSR;mating type

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0018-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.51267014）。

劉曉婷（1991-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生物物理。E-mail:liuxiaoting0522＠sina.com

**通信作者：郭九峰（1964-），男，博士，教授，主要從事生物物理與生物技術(shù)研究。E-mail:guojf101＠sina.com

2017-09-20