白珊珊 李俊憲 李東 徐梁 段惠川 俞哲元 袁捷 韋敏

重組Periostin蛋白對TWIST1+/-小鼠顱縫細胞增殖以及成骨分化能力的影響

白珊珊 李俊憲 李東 徐梁 段惠川 俞哲元 袁捷 韋敏

目的 觀察不同濃度Periostin重組蛋白對體外培養(yǎng)的TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫細胞增殖及成骨分化的影響。方法 取TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫細胞，培養(yǎng)傳代后隨機分成4組，并分別加入不同濃度的重組Periostin蛋白（0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L）進行培養(yǎng)。 采用 CCK8 法檢測該蛋白對顱縫細胞增殖的影響；堿性磷酸酶定量試劑盒檢測細胞內ALP的分泌；RT-PCR及Western Blot法檢測細胞內成骨分化相關因子基因和蛋白的表達。結果CCK8 法檢測結果顯示，與 0 μg/L 組相比，Periostin 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 濃度組分別培養(yǎng) 1、3、5、7 d 后，顱縫細胞活性均顯著降低（P＜0.05）；堿性磷酸酶試劑盒檢測結果顯示，與 0 μg/L 組相比，Periostin 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L濃度組分別成骨誘導培養(yǎng)10 d后，ALP活性被抑制，表達量下降（P＜0.05）；RT-PCR和Western Blot檢測結果顯示，成骨誘導培養(yǎng) 21 d后，與 0 μg/L組相比，Periostin 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L濃度組顱縫細胞成骨分化相關因子 OCN、OPN、BSP、COL-1 表達量下降 （P＜0.05）。 結論 不同濃度 （50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L） 的重組 Periostin 蛋白對TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫細胞增殖、分化均有明顯抑制作用。

骨膜蛋白 顱縫細胞 成骨分化

顱縫早閉，又稱為狹顱癥，或者顱狹窄畸形，系一條或多條顱縫早期閉合或骨化所致的顱骨發(fā)育異常，可獨立發(fā)生也可合并于其他綜合征中[1]。顱縫早閉引起顱內容物發(fā)育受限，影響腦的生長發(fā)育，可引起頭面部畸形、發(fā)育遲緩、智力下降等[2]。顱縫早閉的治療主要以手術為主，非手術靶向治療亟待探索和研究。目前研究表明，顱縫細胞生長過程中的異常增殖及成骨分化是導致顱縫閉合的重要機理之一。Periostin是一種分泌型的細胞外基質蛋白，主要由成骨細胞及前體細胞所分泌產生，在骨發(fā)育和成熟過程中具有不同的功能[3]。Saethre-Chotzen綜合征是顱縫早閉的一種，其基因定位主要位于TWIST1[4]，TWIST1+/-小鼠為該綜合征的疾病模型，此模型小鼠冠狀縫于10 d左右提前閉合，造成顱縫早閉，與Saethre-Chotzen綜合征患者的顱縫早閉時間及部位均符合，臨床上應用此模型研究顱縫早閉疾病機理。本研究旨在探討重組Periostin蛋白對TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫細胞的增殖和成骨分化的作用，從而為Periostin蛋白治療顱縫早閉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

出生24 h之內的C57TWIST1+/-小鼠30只 （美國貝樂醫(yī)學院捐贈），SPF級，雌雄各半，飼養(yǎng)于我院動物房。 許可證號：SYXK（滬）2016-0016。

1.1.2 主要試劑

小鼠重組Periostin蛋白 （美國Sigma公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），低糖DMEM培養(yǎng)液、成骨誘導液、胰蛋白酶（美國Gibco公司），Ⅳ型膠原酶、CCK-8試劑盒 （美國Beyotime公司），ALP定量試劑盒（中國聯(lián)科生物技術有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司），M-MLV反轉錄及相關試劑 （美國Promega公司），SYBRPremix Ex TagⅡ試劑盒 （日本Takara公司），抗OCN、OPN、BSP、Col-1 抗體（美國 Sigma公司）。

1.1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（中國Heal Forse公司），倒置顯微鏡及攝像系統(tǒng) （日本 Olympus公司），全波長酶標儀、流式細胞檢測儀（美國Beckman Coulter公司），熒光定量PCR儀（美國Agilent Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠顱縫細胞培養(yǎng)

取出生后1 d的C57TWIST1+/-小鼠，乙醇浸泡消毒，無菌條件下切取顱蓋骨，剝離硬腦膜和骨膜，取顱骨冠狀縫處1.5 mm組織，盡量剪碎，放入4 mLⅣ型膠原蛋白酶內，37℃，3 h；離心棄上清液。10 mL完全培養(yǎng)液（低糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素原液+292 mg/L L-谷氨酰胺）重懸細胞，無菌轉移至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。3 d換液一次，1周后0.25%胰蛋白酶消化，按1×104cells/cm2的細胞密度接種于培養(yǎng)皿。實驗用第一代細胞。

1.2.2 Perostin蛋白對顱縫細胞增殖的檢測

取第1代生長良好的細胞，按3.0×104cells/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，并分別加入濃度為0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的重組 Periostin蛋白，每組設3個復孔。分別于加藥1 h、3 h、5 h、7 h后，每孔加入CCK-8檢測液10 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，于450 nm波長處，酶標儀檢測各孔光密度值（OD）值。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

取第1代生長良好的細胞，按5.0×104cells/mL的密度接種于96孔板，24 h后換成骨誘導培養(yǎng)液，并分別按照濃度 0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L加入重組Periostin蛋白，每組設置3個復孔，分別于培養(yǎng)3 d、5 d、7 d后收集細胞，用0.05%的Triton X-100裂解液進行裂解。嚴格按照堿性磷酸酶試劑盒說明書檢測ALP活性，取50 μL的裂解物于96孔板中，再加50 μL顯色底物混勻，37℃避光孵育5 min，加入10 μL終止液終止反應，在405 nm處檢測各組樣品的吸光度，通過標準曲線計算各組細胞ALP活力。

1.2.5 Real-Time PCR 法檢測 OCN、OPN、BSP、COL-1 mRNA表達水平

取第1代生長良好的細胞，按1.0×105cells/mL的密度接種于6孔板，常規(guī)低糖DMEM培養(yǎng)24 h后，換成成骨誘導液，并分別按 0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的濃度加入重組Periostin蛋白，每組設3個復孔，按Real-Time PCR試劑盒說明書操作，提取總RNA，反轉錄為cDNA后，實時定量PCR儀擴增檢測。所有引物均由上海生工生物工程公司設計合成。實驗結果采用2-△△CT法計算出實驗組與對照組的表達差異（表1）。

1.2.6 Western Blot法檢測 OCN、OPN、BSP、COL-1蛋白的表達

細胞加入不同濃度（0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L）Periostin成骨誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)21 d后，胰酶消化收集，加入RIPA裂解液，提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。蛋白提取液中加入等量的2×十二烷基磺酸鈉上樣緩沖液，電泳后轉膜，膜用TBST配置的50 g/L脫脂牛奶封閉2 h；加入一抗（封閉液稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗3×10 min。加相應的二抗（封閉液稀釋）室溫孵育 1 h；TBST洗 3×10 min；用ECL發(fā)光法檢測不同樣品蛋白表達狀況；X線膠片曝光，顯影，定影。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以One-Way ANOVA-Dunnett進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。正態(tài)計量數(shù)據(jù)用（x±s）表示。

2 結果

2.1 重組Periostin蛋白對顱縫細胞增殖的影響

加入重組Periostin蛋白后，CCK-8試劑盒檢測結果顯示，培養(yǎng)第 3 天，相比 0 μg/L 組，100 μg/L 及200 μg/L 組明顯抑制顱縫細胞增殖（P＜0.05），從培養(yǎng)第5天開始，各濃度組對顱縫細胞的增殖均有明顯抑制作用（P＜0.05），且 Periostin 濃度為 100 μg/L的時最明顯，但100 μg/L組和濃度200 μg/L組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖 1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2 重組Periostin蛋白對顱縫細胞中堿性磷酸酶含量的影響

與 0 μg/L 組相比，其余各組培養(yǎng) 3 d、5 d、7 d 時，堿性磷酸酶（ALP）量均明顯少于 0 μg/L 組（P＜0.05），呈一定時間濃度依賴性（表2）。

2.3 Real-Time PCR 法檢測 OCN、OPN、BSP、COL-1 mRNA表達水平

與0μg/L組相比，各濃度Periostin對顱縫細胞成骨分化相關因子 OCN、OPN、BSP、COL-1 mRNA表達水平均有不同程度抑制。當濃度為200 μg/L時，表達水平最低，但其與100 μg/L組之間并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖 2）。

2.4 Western Blot法檢測 OCN、OPN、BSP、COL-1蛋白表達水平

與0 μg/L組相比，不同濃度Periostin對顱縫細胞成骨分化相關因子 OCN、OPN、BSP、COL-1蛋白水平均有不同程度抑制，隨著濃度升高，蛋白表達量降低，在濃度為200 μg/L時，表達量最少（圖3）。

表2 不同濃度重組Periostin蛋白對TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫細胞堿性磷酸酶活性的影響Table 2 Effects of different concentrations of recombinant Periostin on ALP activity of cranial suture cells of coronal suture in TWIST1+/-mouse

圖1 Periostin對顱縫細胞增殖的影響Fig.1 Periostin on the proliferation of cranial suture cells

圖2 Periostin對顱縫細胞成骨分化因子mRNA的影響Fig.2 Periostin on mRNA expression of osteogenic differentiation markers of cranial suture cells

圖3 Periostin對顱縫細胞成骨分化因子蛋白的影響Fig.3 Periostin on expression of osteogenic differentiation markers of cranial suture cells

3 討論

顱縫早閉不僅可導致頭顱畸形、面中部嚴重發(fā)育不良，也會造成顱內壓增高、視力障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、智力低下等。研究證實，多種基因突變、致畸物質、機械壓力或血液、代謝紊亂等均是導致顱縫早閉的原因[5]。與長骨不同，顱骨是由膜內成骨發(fā)育而來，即間充質細胞不經(jīng)軟骨形成過程，而直接分化為成骨細胞。顱縫的形成過程由多種信號機制參與調控，如 FGFs、BMP、TGF-β、Wnt蛋白等，異常的信號通路可造成顱縫細胞增殖、遷移、成骨能力異常，導致顱縫過早閉合[6]。因此，顱縫早閉的非手術靶向治療的關鍵在于抑制和阻止顱縫細胞的過度增殖和異常成骨分化。Saethre-Chotzen綜合征是綜合征型顱縫早閉的一種，為常染色體顯性遺傳，通常伴有身材矮小、顱縫早閉、前額突出、眼簾下垂、突出耳垂的小耳、上頜骨發(fā)育不全等的畸形[7]，其致病基因為TWIST1基因。TWIST1是一種合子基因，對中胚層形成及其進一步分化為特定組織具有重要作用[8]。該綜合癥患者的TWIST1基因表達明顯下降[9]。Connerney等[10]發(fā)現(xiàn)，通過抑制FGF信號通路可以防止TWIST1+/-小鼠顱縫早閉的發(fā)生。為進一步探究該疾病的分子機制及非手術治療方法，本研究采用不同濃度重組Periostin蛋白，觀察其對TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫細胞增殖、成骨分化程度的影響。

Periostin（骨膜蛋白），是一種分泌型的細胞外基質蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于MC3T3-E1成骨細胞樣細胞系，在骨、牙周膜、皮膚及心臟瓣膜等多種組織中均有表達，也可見于人類多種惡性腫瘤及創(chuàng)傷愈合的組織中，參與腫瘤侵襲、轉移及皮膚損傷和心肌缺血后重建過程[11]。Periostin是骨強度的調控因子之一，在成骨細胞黏附、分化，膠原纖維形成，骨基質的礦化中有調節(jié)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Periostin可抑制顱縫細胞的增殖，且在濃度為100 μg/L時最明顯。Periostin和TWIST的mRNA共表達于顱縫成骨前緣，與顱縫發(fā)育有關，提示TWIST1位于Periostin的上游，可調控其表達，TWIST1可使得成骨細胞前體中的Periostin表達增加[13]，故TWIST1+/-小鼠中Periostin表達量減少，而體外給予Periostin，可抑制顱縫細胞增殖。另外，在成骨細胞分化過程中，隨著細胞的分化，ALP的表達和分泌會隨之增強，ALP活性越強表明成骨細胞骨形成的狀況越好。本研究結果顯示，隨著Periostin蛋白濃度增加，顱縫細胞中ALP逐漸減少。COLI是成骨細胞向基質成熟方向分化的標志，是鈣鹽沉著以及細胞附著的支架，其合成分泌是骨組織形成的先決條件，而BSP、OCN、OPN均是成骨細胞形成骨基質不可缺少的蛋白，均反映了成骨細胞礦化的能力[14]。因此，本研究選取COLI、SP、OCN、OPN作為顱縫細胞成骨分化的觀察指標。RTPCR和Western Blot結果顯示，Periostin蛋白可抑制顱縫細胞中成骨相關因子表達，抑制其礦化能力，且在濃度為200 μg/L時最明顯。Ratisoontor等[13]發(fā)現(xiàn)，在Saethre-Chotzen綜合征患者中，TWIST1的缺失造成了顱縫細胞成骨礦化能力增加，TWIST1缺失可使得成骨細胞前體中的Periostin表達減少。目前，對于Periostin的研究主要集中在腫瘤方面，但對其在成骨方面研究近年來日益增加[15]，本研究初步研究了Periostin對顱縫細胞的作用。

綜上所述，重組Periostin蛋白對TWIST1+/-小鼠冠狀縫顱縫早閉的細胞增殖、分化具有抑制作用，并呈濃度依賴性：Periostin濃度為100 μg/L時，其抑制作用最明顯；濃度為200 μg/L時，Periostin阻止顱縫細胞成骨分化的作用最顯著。本結果使我們對TWIST1缺失導致的顱縫早閉的機理有了進一步認識，為Periostin蛋白應用于顱縫早閉的臨床研究提供了依據(jù)，但作用機制及相關信號通路仍需深入研究。

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Effects of Recombinant Periostin on Proliferation and Osteogenic Differentiation of Cranial Suture Cells in TWIST1+/-Mouse

BAI Shanshan1,LI Junxian2,LI Dong1,XU Liang1,DUAN Huichuan1,YU Zheyuan1,YUAN Jie1,WE Min1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong Universit School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Shanxi 030012,China Corresponding author:YUAN Jie(E-mail:Jaman1@126.com);WEI Min(E-mail:drweimin@163.com).

Objective To observe the effects of recombinant Periostin on proliferation and osteogenic differentiation of cranial suture cells of coronal suture in TWIST1+/-mouse.Methods Cranial suture cells were separated and extracted from coronal suture of TWIST1+/-mouse.The cells were divided into 4 groups according to different concentration of recombinant Periostin:0 μg/L,50 μg/L,100 μg/L,200 μg/L group.CCK-8 method was used to detect the cell proliferation of cranial suture cells;Alkaline Phosphatase kit was used to detect the ALP activity;Real-Time PCR and Western Blot were used to detect the expression of osteogenic differentiation markers:OCN,OPN,BSP and COL-1.Results CCK-8 test showed that,compared with 0 μg/L group,other Periostin groups inhibited cranial suture cell proliferation in some degree (P＜0.05).ALP activity test showed that,after osteoinduction for 10 days,compared with 0 μg/L group,ALP activity of 50 μg/L,100 μg/L,200 μg/L Periostin groups were significantly decreased (P＜0.05).Real-Time PCR and Western Blot showed that,compared with 0 μg/L group,other groups significantly decreased the expression of OCN,OPN,BSP and COL-1(P＜0.05).Conclusion Different concentrations(50 μg/L,100 μg/L,200 μg/L)of recombinant Periostin can inhibit the proliferation and osteogenic differentiation of cranial suture cells of coronal suture in TWIST1+/-Mouse.

Periostin; Cranial suture cells;Osteogenic differentiation

國家自然科學基金（81471886）。

200011上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

袁捷 （E-mail：Jaman1@126.com）；韋 敏 （E-mail：drweimin@163.com）。

注：白珊珊，李俊憲為共同第一作者。

R622

A

1673－0364（2017）05－0283－04I y.

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.05.012

2017年7月25日；

2017年9月4日）