劉午龍，陳少清，，林建平，陳水金，夏夢，王詩忠

1.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350122

電針“委中”對腰椎間盤退變模型大鼠椎間盤組織Fas和FasL表達的影響

劉午龍1，陳少清1，2，林建平2，陳水金3，夏夢3，王詩忠1

1.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350122

目的 觀察電針“委中”對腰椎間盤退變模型大鼠椎間盤組織Fas、FasL表達的影響，探討其作用機制。方法 30只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、電針組，每組10只。假手術組僅手術切開皮膚，模型組和電針組通過纖維環(huán)穿刺法建立大鼠腰椎間盤退變模型。成模4周后，假手術組和模型組行等條件固定處理，電針組電針“委中”治療，20 min/次，每日1次，連續(xù)4周。治療結束后，Western blot、RT-PCR檢測Fas、FasL的蛋白和mRNA表達。結果 模型組Fas、FasL蛋白和mRNA表達較假手術組明顯升高（P＜0.05），電針組Fas、FasL蛋白和mRNA表達較模型組明顯降低（P＜0.05）。結論 電針“委中”可降低Fas、FasL的表達，起到抑制腰椎間盤退變的作用。

電針；委中；細胞凋亡；Fas；FasL；大鼠

腰椎間盤退變易引發(fā)腰椎管狹窄、椎體小關節(jié)不穩(wěn)、椎間盤突出、神經(jīng)根及脊髓受壓等病理改變，導致下腰痛及坐骨神經(jīng)痛。自1947年Steindler A[1]首次提出腰痛和椎間盤退變相關后，如何延緩椎間盤退變防治腰痛成為了研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as、FasL在退變的椎間盤組織中表達升高，并與細胞凋亡密切相關[2]。臨床上應用針刺治療腰椎間盤退行性疾病療效較好，委中為改善腰椎間盤退行性疾病的常用穴位[3]，但其作用機制尚未完全闡明。因此，本實驗觀察電針“委中”對腰椎間盤退變模型大鼠椎間盤組織凋亡因子Fas、FasL表達的影響，探討電針“委中”治療腰椎間盤退變的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級3月齡健康雄性SD大鼠30只，體質量（250±30）g，上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室溫20～22 ℃，相對濕度45%～55%，12 h明暗交替，自由進食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

Anti-Fas（Santa Cruz公司），Anti-Fas Ligand（Abcam公司），Anti-β-actin（Cell Signaling公司）。超低溫冰箱（Thermo公司），電泳儀、圖像分析系統(tǒng)、PCR儀（BIO-RAD公司），華佗牌無菌針灸針、華佗牌電針儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組

實驗大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質量編號，采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、電針組，每組10只。

2.2 造模

參照文獻[4]纖維環(huán)穿刺法。大鼠仰臥位，取右側旁正中切口，逐層切開，暴露腹后壁，以髂總動脈分叉處或左右髂嵴作為定位點，將腰大肌和深層肌肉的附著點從椎體附著處鈍性剝離，暴露椎間盤，21號穿刺針行纖維環(huán)穿刺術（深度1.5 mm），穿刺完成后，縫合處理。假手術組僅切開皮膚后縫合，不作造模處理。造模后每組隨機取2只大鼠，HE染色確定模型是否成功：假手術組髓核網(wǎng)狀結構完整，纖維環(huán)結構排列有序，清晰可辨；模型組和電針組髓核網(wǎng)狀結構退化，呈纖維軟骨樣改變，體積減小，纖維環(huán)細胞腫脹甚至斷裂，排列紊亂，表明造模成功。

2.3 干預方法

電針組成模4周后，參照文獻[5]穴位定位及針刺方法，直刺大鼠“委中”0.5 cm，雙極聯(lián)體電針接電針儀，選擇疏密波，頻率2 Hz，電流1 mA，以下肢出現(xiàn)輕微顫抖為準，每次20 min，每日1次，連續(xù)4周。假手術組和模型組行等條件固定處理。

2.4 取材

干預結束后，所有大鼠10%水合氯醛腹腔注射處死，取整個腰椎椎體（含椎間盤）迅速移至冰面上進行操作，快速取出椎間盤組織，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 Western blot檢測

稱取大鼠椎間盤組織50 mg，加入裂解液，研磨均勻后靜置30 min，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，通過半干轉移法轉至膜上，室溫封閉1 h，分別加入一抗抗體稀釋液中孵育，4 ℃過夜，再用二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光法顯色，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析。以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對灰度。

2.6 RT-PCR檢測

引物設計：β-actin上游5'-CCACCATGTACCCAG GCATT-3'，下游5'-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3'，產(chǎn)物擴增長度為470 bp；Fas上游5'-CTGGCGTGT TCTTTTTGCCA-3'，下游5'-CCAAGACGGTCATCC CTCAG-3'，產(chǎn)物擴增長度為797 bp；FasL上游5'-TCC TGGGGATCTGGTGCTAA-3'，下游5'-GCCTCCTGT GAGGTAGCAAG-3'，產(chǎn)物擴增長度為549 bp。取大鼠椎間盤組織，于液氮中研磨后行總RNA提取，RNA濃度測定，反轉錄為cDNA，再行PCR擴增。反應條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，共32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，進行成像分析，并以β-actin作為內(nèi)參基因，計算目的基因與β-actin內(nèi)參基因的相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 電針對模型大鼠椎間盤組織Fas、FasL蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組Fas、FasL蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組Fas、FasL蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。結果見表1、圖1。

表1 各組大鼠腰椎間盤組織Fas、FasL蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠腰椎間盤組織Fas、FasL蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) Fas FasL假手術組 8 0.33±0.04 0.51±0.06模型組 8 1.26±0.09*1.17±0.08*電針組 8 0.69±0.04#0.59±0.13#

圖1 各組大鼠椎間盤組織Fas及FasL蛋白表達免疫印跡電泳圖

4.2 電針對模型大鼠椎間盤組織Fas、FasL mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組Fas、FasL mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組Fas、FasL mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。結果見表2、圖2。

表2 各組大鼠腰椎間盤組織Fas、FasL mRNA表達比較（s）

表2 各組大鼠腰椎間盤組織Fas、FasL mRNA表達比較（s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) Fas FasL假手術組 8 0.29±0.04 0.27±0.04模型組 8 1.44±0.13*0.84±0.08*電針組 8 0.72±0.11#0.59±0.08#

圖2 各組大鼠椎間盤組織Fas、FasL mRNA表達凝膠電泳圖

5 討論

前期研究表明，電針治療不僅能夠有效改善疼痛癥狀，而且在分子生物學研究中對椎間盤退變的機制也有影響[6]。歷代古醫(yī)籍中有許多關于針灸治療腰痛的記載，“腰背委中求”是中醫(yī)學治療腰背部病癥循經(jīng)取穴的經(jīng)典方法，至今仍在指導臨床治療腰椎間盤退變疾病。委中作為“四總穴”之一，是治療腰椎退行性疾病的常用效穴，并有“經(jīng)脈所過，主治所及”的特點。

腰椎間盤退變與腰椎間盤結構的破壞和功能障礙密切相關，這個過程是多種復雜因素相互作用的結果。李小川等[7]發(fā)現(xiàn)，在退變椎間盤中，F(xiàn)as、FasL的蛋白和mRNA表達與正常椎間盤比較，差異均有統(tǒng)計學意義。還有研究發(fā)現(xiàn)，退變椎間盤組織Fas和FasL高表達，并且存在明顯的細胞凋亡[8-9]。因此，阻斷Fas/FasL系統(tǒng)，減少椎間盤細胞的凋亡，可以延緩椎間盤的退變。

對于腰椎間盤退變的凋亡通路，目前研究發(fā)現(xiàn)主要有3條途徑：一種為Fas/FasL介導的死亡受體途徑，也叫外源性途徑；一種為線粒體途徑，也稱內(nèi)源性途徑；還有內(nèi)質網(wǎng)應激所導致的凋亡[10]。Fas是一種細胞表面受體，它可以與FasL（即Fas的配體）結合，誘導Fas三聚體的形成，繼而導致Fas胞內(nèi)的死亡結構域（DD）與另一種Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）結合，同時，F(xiàn)ADD的N端DD與Caspase-8酶原相互作用，從而募集細胞中Caspase-8酶原，使Caspase-8激活，形成由Fas/FADD/Caspase-8組成的死亡誘導信號復合體，從而導致表達Fas的細胞凋亡[10]。

本實驗通過電針“委中”進行干預，采用Western blot檢測Fas、FasL的蛋白表達，RT-PCR檢測Fas、FasL的mRNA表達。實驗結果顯示，電針“委中”可以改善腰椎間盤退變，其機制可能是通過調(diào)節(jié)凋亡因子Fas、FasL的表達，抑制細胞凋亡，從而延緩椎間盤退變。

[1] STEINDLER A. An analysis and differentiation of low-back pain in relation to the disc factor[J]. Journal of Bone and Joint Surgery,1947,29(2)：455-460.

[2] WANG J, TANG T, YANG H, et al. The expression of Fas ligand on normal and stabbed-disc cells in a rabbit model of intervertebral disc degeneration：a possible pathogenesis[J]. Journal of Neurosurgery Spine,2007,6(5)：425-430.

[3] 陳紅路,邱曉虎,嚴曉春.電針加委中刺血治療急性腰椎間盤突出癥療效觀察[J].中國針灸,2009,29(2)：123-125.

[4] ROUSSEAU M A, BASS E C, LOTZ J C. Ventral approach to the lumbar spine of the Sprague-Dawley rat[J]. Lab Animal,2004,33(6)：43-45.

[5] 李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2003.

[6] 鄧德萬,林建平,陳少清,等.電針委中穴對腰椎退變模型大鼠纖維環(huán)細胞caspase3、XIAP蛋白表達的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志,2016, 31(4)：394-398.

[7] 李小川,李雷,王歡,等.Fas/FasL基因在退變腰椎間盤組織中的表達及誘導凋亡作用[J].中華醫(yī)學雜志,2005,85(24)：1718-1720.

[8] PARK J B, CHANG H, KIM K W. Expression of Fas ligand and apoptosis of disc cells in herniated lumbar disc tissue[J]. Spine,2001, 26(6)：618-621.

[9] WANG H, LIU H, ZHENG Z M, et al. Role of death receptor, mitochondrial and endoplasmic reticulum pathways in different stages of degenerative human lumbar disc[J]. Apoptosis,2011, 16(10)：990-1003.

[10] SCOTT F L, STEC B, POP C, et al. The Fas/FADD death domain complex structure unravels signaling by receptor clustering[J]. Nature,2009,457(7232)：1019-1022.

Effects of Electro-acupuncture at “Weizhong” (BL40) on Expressions of Fas and FasL in Ratswith Lumbar Disc Degeneration

LIU Wu-long1, CHEN Shao-qing1,2, LIN Jian-ping2, CHEN Shui-jin3,

XIA Meng3, WANG Shi-zhong1(1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China; 3. Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology, Fuzhou 350122, China)

Objective To observe the effects of electro-acupuncture (EA) at “Weizhong” (BL40) on expressions of Fas and FasL in rat models with lumbar disc degeneration; To discuss its mechanism of action. Methods Thirty SD rats were randomly divided into sham-operationgroup, model group and EA group, with 10 rats in each group. The sham-operation group was treated with sham operation to incide local skin; the model and EA groups established rat model of lumbar disc degeneration by puncturing the annulus fibrosus. Four weeks after modeling, rats in the sham-operation and model groups received fixed treatment under identical condition, and rats in the EA group were treated with EA at “Weizhong” (BL40) in 20 minutes, once a day, for 4 weeks. After treatment, Western blot and RT-PCR technology were used to test the protein and mRNA expression levels of Fas and FasL. Results The expressions of Fas and FasL in the model group were higher than those in the sham-operation group (P＜0.05); protein and mRNA expression levels of Fas and FasL in the EA group were lower than those in the model group (P＜0.05). Conclusion EA at “Weizhong” (BL40) can reduce the expressions of Fas and FasL to inhibit the development of lumbar disc degeneration.

electro-acupuncture; Weizhong (BL40); apoptosis; Fas; FasL; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.016

R245

A

1005-5304(2017)01-0063-03

2016-06-23）

（

2016-07-19；編輯：華強）

國家自然科學基金（81303017）；福建省衛(wèi)生廳醫(yī)學創(chuàng)新項目（2014-CXB-20）

陳少清，E-mail：chenshaoqd@163.com