湯莊力 王 添 肖生祥 王曉鵬

表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突變檢測(cè)及生物信息學(xué)分析

湯莊力 王 添 肖生祥 王曉鵬

目的檢測(cè)表皮松解性掌跖角化病1家系KRT9基因突變情況并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法提取家系患者、正常人及100名健康志愿者外周血DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增KRT9基因全部外顯子并測(cè)序。與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行突變型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)分析。結(jié)果患者KRT9基因1號(hào)外顯子內(nèi)檢測(cè)到一處c.487C>T錯(cuò)義突變(p.163R>W)，家族未患病成員以及100名正常對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)突變。生物信息學(xué)分析提示該突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)改變，功能分析提示該突變會(huì)改變蛋白質(zhì)生物功能。結(jié)論本家系檢測(cè)到1個(gè)KRT9基因的熱點(diǎn)突變，該突變對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展可能具有較大作用。

表皮松解性掌跖角化?。?KRT9基因； 基因突變檢測(cè)； 生物信息學(xué)分析

表皮松解性掌跖角化病(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK)是一組以掌跖部位角化過(guò)度為特點(diǎn)的常染色體顯性遺傳病。該病臨床表現(xiàn)為掌跖部位彌漫性斑塊狀角質(zhì)變厚，皮損表面光滑、色黃，呈蠟樣改變，邊緣清晰多呈紅色。

1992年，Reis等[1]對(duì)1個(gè)EPPK大家系進(jìn)行連鎖遺傳分析，將EPPK的致病基因定位于17q12-q21。而KRT9基因特異性表達(dá)于掌跖部位的表皮，被高度懷疑是EPPK的致病基因[2]。繼而在1994年，Reis等[3]報(bào)道了第一例存在KRT9基因突變的EPPK病例，至此，該病分子遺傳學(xué)機(jī)制日臻清晰。

截至當(dāng)前，中英文文獻(xiàn)中報(bào)道的EPPK突變位點(diǎn)已有30個(gè)，其中3個(gè)為無(wú)義突變，其余27個(gè)會(huì)改變蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)[4]。為了解本例患者的致病突變，運(yùn)用PCR、一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)該患者KRT9基因。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 先證者，男，20歲。父母非近親婚配。出生后掌跖部位皮膚即粗糙增厚，可見(jiàn)彌漫性堅(jiān)硬黃色斑塊，帶有光澤呈蠟樣外觀；兩側(cè)手掌及兩側(cè)跖部角化程度相近，可見(jiàn)明顯皴裂。皮損邊界清晰，呈淡紅色(圖1a，1b)。身體其他部位皮膚均正常，未見(jiàn)魚(yú)鱗病樣改變，皮膚附屬器結(jié)構(gòu)如甲、毛發(fā)等均正常。該家系共4代，所有患者均在出生1年內(nèi)發(fā)病。

對(duì)先證者行皮膚活體組織病理檢查示：表皮角化過(guò)度，顆粒層增厚，顆粒層及棘層內(nèi)部可見(jiàn)較多裂隙，裂隙內(nèi)可見(jiàn)大量淡染物質(zhì)，可見(jiàn)表皮細(xì)胞松解。

1.2 標(biāo)本收集 向患者家系中所有患者充分闡明本研究目的及意義，獲取知情同意后分別采集家系中患者II1、II3、III4、III6、IV1、IV3外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-80℃低溫保存。家系中I1由于年長(zhǎng)體弱未能來(lái)院采血。招募100名正常志愿者(入選條件：年齡不限，性別不限，非孕期，無(wú)系統(tǒng)性疾病)，同時(shí)采集患者家系中所有正常人外周血2 mL作為對(duì)照。家系血樣按照系譜圖(圖1c)編號(hào)，正常對(duì)照的血樣編號(hào)后在相同條件下貯存。

1.3 DNA提取 患者及正常人凍存血樣標(biāo)本置于室溫完全熔化后，用全血基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)提取基因組DNA備用，-20℃凍存。

1.4 PCR擴(kuò)增外顯子 采用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)KRT9基因8個(gè)外顯子的上下游引物。其中，1號(hào)外顯子上游引物為5’-GGTGGTGGTTCTGGAGGTG-3’；下游引物為5’-TCCCTGGCTATTATCTGAGCTT-3’。擴(kuò)增的各目標(biāo)片段PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度約為400 bp。采用20 μL PCR反應(yīng)體系，其中PCR mix 10 μL，DEPC H2O 5 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性，5 min；35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由變性(94℃，30 s)、復(fù)性(56℃，30 s)、延伸(72℃，60 s)組成；最后72℃充分延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳了解產(chǎn)物情況。

1.5 DNA序列測(cè)定與分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，由ABI 3730XL型全自動(dòng)熒光DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems)測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中人類KRT9基因進(jìn)行比對(duì)，并分析單核苷酸多態(tài)性以及可能的致病突變。

1.6 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)對(duì)野生型及突變型KRT9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)、比較，并重點(diǎn)運(yùn)用PredcitProtein中COILS子程序分析基因突變對(duì)于卷曲螺旋的具體影響。同時(shí)對(duì)野生型KRT9蛋白進(jìn)行功能注釋、點(diǎn)突變預(yù)測(cè)以及基因本體(gene-ontology, GO)分析。運(yùn)用SwissModel軟件(https://www.swissmodel.expasy.org)對(duì)野生型及突變型KRT9蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)、比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 本研究檢測(cè)的患者基因組DNA經(jīng)PCR、測(cè)序以及后期分析，所有患者的1號(hào)外顯子均可檢測(cè)到一處錯(cuò)義突變c.487C>T(圖1d)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白質(zhì)163位精氨酸突變?yōu)樯彼?p.163R>W)。100名正常對(duì)照組以及該患者家系中正常人基因檢測(cè)均未見(jiàn)此錯(cuò)義突變。家系中患者其余外顯子及內(nèi)含子經(jīng)比對(duì)未見(jiàn)突變。

查閱NCBI_SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)可排除該突變?yōu)槿朔N特異性SNP，UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/uniprot/P35527)提示該位點(diǎn)為熱點(diǎn)突變。

1a, 1b 先證者手掌及跖部皮損，增厚伴皴裂，色黃，呈蠟樣光澤； 1c 家系圖； 1d 家系患者基因測(cè)序結(jié)果，箭頭所指為c.487C>T.

圖1 先證者臨床表現(xiàn)、家系圖以及基因測(cè)序結(jié)果

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 野生型與突變型(p.163R>W)的KRT9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型均為混合型，即無(wú)規(guī)則卷曲(irregular loops)占到全序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的50%以上，且α螺旋或β折疊均未占到45%以上。兩者的α螺旋構(gòu)成比相同，均為44.46%；然而突變型的β折疊構(gòu)成比高達(dá)7.38%，遠(yuǎn)高于野生型的4.33%。

進(jìn)一步分析野生型與突變型兩者在各位點(diǎn)的構(gòu)型情況，通過(guò)與已知的平行雙股卷曲螺旋進(jìn)行相似度分析，突變型卷曲螺旋片段長(zhǎng)度縮短，突變位點(diǎn)的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，片段前后的無(wú)規(guī)則卷曲片段長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)增加，結(jié)構(gòu)亦發(fā)生改變。

分析野生型及突變型的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)，兩者除溶解性發(fā)生改變外，二硫鍵的個(gè)數(shù)與分布、核仁組織區(qū)(nucleolar organizing regions, NORS)結(jié)構(gòu)域位置、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、跨膜位點(diǎn)及跨膜片段長(zhǎng)度等均無(wú)明顯差異。

SwissModel構(gòu)建KRT9野生型及突變型的三維結(jié)構(gòu)模型，兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)模型相同，均在KRT9第222～456位氨基酸殘基與已有數(shù)據(jù)庫(kù)中KRT10最優(yōu)匹配，所得模型空間構(gòu)象見(jiàn)圖2。模型的全局模型質(zhì)量評(píng)價(jià)指數(shù)GMQE 0.12，定型模型能量分析 QMEAN-5.54。

圖2 SwissModel預(yù)測(cè)的KRT9蛋白的空間構(gòu)象

對(duì)KRT9進(jìn)行功能注釋以更深入了解功能層面的改變。運(yùn)用PredictProtein軟件點(diǎn)突變效應(yīng)模塊得到熱圖(圖3)，直觀表示在氨基酸序列各位點(diǎn)發(fā)生任何點(diǎn)突變對(duì)于蛋白質(zhì)整體功能的可能影響。本文DNA測(cè)序所得基因突變轉(zhuǎn)錄翻譯所得的氨基酸理論位點(diǎn)為163位，該位點(diǎn)發(fā)生R>W突變的預(yù)測(cè)評(píng)分為79分。

藍(lán)色框代表放大展示的熱圖位于蛋白質(zhì)序列的位置；橫軸代表KRT9蛋白的氨基酸殘基序列，星號(hào)指第163位氨基酸殘基；縱軸代表20種氨基酸，箭頭指本文中蛋白質(zhì)突變產(chǎn)物色氨酸(W)；深綠色(分值<-50)強(qiáng)烈提示該突變對(duì)于蛋白質(zhì)無(wú)影響，深紅色(分值>50)強(qiáng)烈提示該突變對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生影響，白色(-50<分值<50)代表影響較弱；黑色代表該位點(diǎn)未突變；p.163R>W對(duì)于蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生強(qiáng)烈影響

圖3 KRT9蛋白點(diǎn)突變熱圖

3 討論

掌跖角化病是一類遺傳性慢性皮膚病，臨床表現(xiàn)多樣，按照組織病理學(xué)可以分為較為多見(jiàn)的表皮松解性掌跖角化病(EPPK)以及相對(duì)少見(jiàn)的非表皮松解性掌跖角化病(non-epidermolytic palmoplantar keratoderma, NEPPK)。掌跖角化病臨床表現(xiàn)為雙側(cè)掌跖部位彌漫性角質(zhì)增厚，皮損境界清楚，邊界多為淡紅色斑；發(fā)病早，多為出生時(shí)即有或1歲內(nèi)發(fā)病。部分文獻(xiàn)報(bào)道，EPPK可合并非外力作用所致指節(jié)墊的發(fā)生，具體機(jī)制仍不明確[5-7]。

EPPK的發(fā)生與KRT9基因及其編碼的角蛋白9有關(guān)。KRT9與角蛋白絲的組裝相關(guān)，參與掌跖部位皮膚形成并維持掌跖部位的成熟皮膚結(jié)構(gòu)[8]。對(duì)KRT9進(jìn)行基因本體分析(Gene Ontology分析，GO分析)，該蛋白廣泛分布于細(xì)胞器、中間絲細(xì)胞骨架等各細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與中間絲形成等細(xì)胞組成過(guò)程密切相關(guān)。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，突變型KRT9蛋白的全局二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，β折疊比例顯著高于野生型；此外，突變位點(diǎn)局部卷曲螺旋片段縮短，兩端無(wú)規(guī)則卷曲片段長(zhǎng)度增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)局部二級(jí)結(jié)構(gòu)改變。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變會(huì)影響三級(jí)乃至四級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)而造成功能的改變，本研究運(yùn)用SwissModel軟件預(yù)測(cè)KRT9蛋白及其突變型的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，以期直觀了解該突變對(duì)于蛋白質(zhì)最終結(jié)構(gòu)的影響。雖然該軟件算法基于當(dāng)前最完備、最高效的同源匹配模型構(gòu)建，但該算法需要根據(jù)部分蛋白質(zhì)已有的空間構(gòu)象數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)匹配預(yù)測(cè)未知蛋白質(zhì)或氨基酸，而現(xiàn)階段該數(shù)據(jù)庫(kù)容量有限，因此軟件所建立模型對(duì)于發(fā)生于非同源匹配區(qū)域的突變可能欠敏感，預(yù)測(cè)結(jié)果也可能存在偏頗。隨著日后算法的不斷完善以及對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，日后運(yùn)用空間建模了解基因突變對(duì)蛋白質(zhì)的影響將日臻成熟、便利。

就蛋白質(zhì)理化性質(zhì)而言，KRT9蛋白p.163R>W造成突變型的溶解度發(fā)生改變，而在前文預(yù)測(cè)到的諸如二硫鍵等在突變型與野生型無(wú)明顯差異，提示突變型可能通過(guò)未作預(yù)測(cè)的其他分子間相互作用，諸如氫鍵、鹽鍵或范德華力等對(duì)于全局結(jié)構(gòu)造成了影響，下一步可著眼上述分子間作用力，以更好揭示其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及理化性質(zhì)中的作用。

功能層面所進(jìn)行的點(diǎn)突變分析結(jié)果可知，p.163R>W得分79，該數(shù)值越接近100提示發(fā)生在該位點(diǎn)的點(diǎn)突變對(duì)于蛋白質(zhì)的影響越大。Kobayashi曾構(gòu)建同一位點(diǎn)另一熱點(diǎn)突變p.163R>Q的體外表達(dá)載體，皮下注射入無(wú)毛非孕期大鼠后會(huì)出現(xiàn)EPPK類似的臨床表現(xiàn)，進(jìn)而驗(yàn)證p.163R>Q為致病突變[9]；而運(yùn)用點(diǎn)突變分析所得p.163R>Q評(píng)分為59分，低于文中所述突變的評(píng)分，高度提示p.163R>W 為致病突變。

遺傳性疾病的熱點(diǎn)突變被廣泛用于產(chǎn)前篩查以提高新生人口質(zhì)量[10,11]。此外，對(duì)于熱點(diǎn)突變的生物信息學(xué)分析有助于我們更好地理解熱點(diǎn)突變?cè)诩膊“l(fā)生發(fā)展中扮演的角色和作用，對(duì)于更加透徹地認(rèn)識(shí)疾病、攻克疾病具有重大意義。

[1] Reis A, Kuster W, Eckardt R, et al. Mapping of a gene for epidermolytic palmoplantar keratoderma to the region of the acidic keratin gene cluster at 17q12-q21[J]. Hum Genet, 1992,90:113-116.

[2] 張咸寧，毛薇，何新輝.表皮松解性掌跖角化癥的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2004,21(4):372-375.

[3] Reis A, Hennies HC, Langbein L, et al. Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK)[J]. Nat Genet,1994,6:174-179.

[4] Human Intermediate Filament Database. Intermediate Filament Details[DB/OL]. http://www.interfil.org/details.php？id=NM_000226.

[5] Li M, Yang LJ, Hua HK, et al. Keratin-9 gene mutation in epidermolytic palmoplantar keratoderma combined with knuckle pads in a large Chinese family[J]. Clin Exp Dermatol,2009,34(1):26-28.

[6] 盧勇. 表皮松解性掌跖角化合并指節(jié)墊一家系致病基因分析[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2002.

[7] 張寶榮，殷鑫湞，夏昆，等.一個(gè)表皮松解性掌跖角化病家系的KRT9基因突變分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2004，21(6):570-573.

[8] Langbein L, Heid HW, Moll I, et al. Molecular characterization of the body site-specific human epidermal cytokeratin 9: cDNA cloning, amino acid sequence, and tissue specificity of gene expression[J]. Differentiation，1993,55(1):57-71.

[9] Kobayashi S, Koreeda S, Tanaka T. Demonstration of the pathogenic effect of point mutated keratin 9 in vivo[J]. FEBS Letters,1999,447(1):39-43.

[10] Liu N, Shi H, Kong X, et al. Mutation analysis and prenatal diagnosis of keratin 9 gene in a large Chinese family with epidermolytic palmoplantar keratoderma[J]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2014,31(1):48-51.

[11] Ke HP, Jiang HL, Lv YS, et al. KRT9 gene mutation as a reliable indicator in the prenatal molecular diagnosis of epidermolytic palmoplantar keratoderma[J]. Gene,2014,546(1):124-128.

GenemutationdetectionandbioinformaticalanalysisofKeratin9-geneinonepedigreeofepidermolyticpalmoplantarkeratoderma

TANGZhuangli,WANGTian,XIAOShengxiang,WANGXiaopeng.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710004,China

s:XIAOShengxiang,E-mail：xiao_sx@163.com

WANGXiaopeng,E-mail：wangdctor@163.com

Objective: To detect the mutations and perform bioinformatical analysis of KRT9 gene in a pedigree with epidermolytic palmoplantar keratoderma.MethodsGenomic DNA was abstracted from peripheral blood of all patients, normal persons in the pedigree and 100 unrelated healthy controls. All exons of KRT9 gene were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the products were sequenced subsequently. The PCR results were compared with the database. Structural and functional analysis were performed via bioinformatical software.ResultsOne hot-spot missense mutation c.487C>T was identified in Exon 1 of KRT9, which was not detected in normal persons in the pedigree and healthy controls. Bioinformatical analyses indicated the mutation changed the global secondary structure and physicochemical property. Functional annotation revealed a probable negative influence on the biological function of KRT9 protein.ConclusionOne hot-spot mutation is identified, which may play a role in the pathogenesis of epidermolytic palmoplantar keratoderma.

epidermolytic palmoplantar keratoderma; KRT9 gene; gene mutation detection; bioinformatical analysis

(收稿：2017-08-08 修回：2017-08-30)