張洪杰，桑鋒鋒，劉阿華，李言言，王 毅，陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

分泌抗山羊γ干擾素單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備與鑒定

張洪杰，桑鋒鋒，劉阿華，李言言，王 毅，陳德坤*

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

為篩選分泌山羊γ干擾素(IFN-γ)單克隆抗體的雜交瘤細胞，以原核表達的山羊rIFN-γ蛋白免疫Balb/c小鼠，取其脾臟細胞與SP2/0瘤細胞進行細胞融合，以間接ELISA方法篩選分泌山羊IFN-γ單克隆抗體雜交瘤細胞，采用山羊外周血淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ包被酶標板對IFN-γ的特異性進行鑒定，用試紙條對IFN-γ單克隆抗體類別和亞型進行鑒定。結(jié)果獲得了1株能特異性識別山羊IFN-γ的雜交瘤細胞3C，3C分泌的單克隆抗體能夠特異性識別天然結(jié)構(gòu)的山羊IFN-γ，單克隆抗體類別為IgG，輕鏈為 κ型。

山羊；γ干擾素；雜交瘤細胞

γ干擾素(IFN-γ)主要由活化T細胞和NK細胞產(chǎn)生，參與細胞免疫，具有抗病毒感染、抗腫瘤等生物學活性，IFN-γ能夠增強受體介導的吞噬功能，加強巨噬細胞和中性粒細胞的殺傷活性。一方面，IFN-γ可誘導巨噬細胞、T細胞、B細胞等細胞MHCⅡ類分子表達，提升抗原呈遞能力；另一方面，能活化巨噬細胞促進殺傷胞內(nèi)寄生病原?；罨木奘杉毎麣[瘤細胞的水平也明顯提高。而且，在局部炎癥反應中， IL-1β、IL-17等細胞因子量的變化會引起IFN-γ表達量的差異[1]。因此，炎癥部位IFN-γ含量的變化可作為評估機體免疫功能的重要指標，為疾病的診斷治療和相關(guān)機理研究提供新的思路。目前市面上尚未見到山羊IFN-γ單克隆抗體的相關(guān)產(chǎn)品，這不利于山羊IFN-γ的相關(guān)研究。本試驗通過ELISA方法篩選分泌山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細胞，并對抗體的特異性、亞型等進行鑒定，獲得了山羊IFN-γ單克隆抗體，為山羊IFN-γ檢測奠定了技術(shù)基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 雌性Balb/c小鼠，6周齡，購自空軍大學實驗動物中心；純化的山羊rIFN-γ蛋白、純化山羊rIL-1β蛋白、純化山羊rIL-17蛋白、純化空載體融合標簽蛋白、SP2/0細胞，由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)免疫學實驗室(以下簡稱本實驗室)保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG酶標抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品；TMB顯色液為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；小鼠抗體亞型鑒定試劑盒為Roch公司產(chǎn)品；Ni-NTA瓊脂糖凝膠鎳柱為上海TransGen公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為購自Sigma公司產(chǎn)品；酶標儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；酶標板為Castor公司產(chǎn)品；其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫原制備 將純化的山羊rIFN-γ蛋白凍干粉[3]溶于蒸餾水，測定濃度，配制成1 mg/mL。取完全弗氏佐劑1 mL與等量山羊rIFN-γ蛋白溶液混勻，用注射器吸入三通管置于冰上來回推打乳化，約1 h后，取一小滴滴于平靜水面上，乳化物20 min內(nèi)不散開，此作為免疫原備用；按照同樣方法取1 mL山羊rIFN-γ蛋白溶液與等量不完全弗氏佐劑混勻乳化備用。以上抗原的制備均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 小鼠免疫 取上述制備好的抗原，按照200 μL/只，對6周齡雌性Balb/c小鼠進行首免。首免后第21天進行二免，二免用的抗原為不完全弗氏佐劑與山羊rIFN-γ乳化所制，免疫劑量和途徑同首免。二免后第15天進行第3次免疫，三免抗原、劑量和途徑同二免一樣。三免后第9天測定免疫小鼠血清抗體效價。免疫次數(shù)以小鼠血清抗體效價達到要求為目標。

1.2.3 山羊IFN-γ抗體的ELISA 檢測 取上述配制好的1 mg/mL山羊rIFN-γ蛋白溶液，調(diào)整其蛋白濃度為10 μg/mL，100 μL/孔加入96孔ELISA 酶標板內(nèi)，封口后4℃放置14 h；棄去酶標板內(nèi)液體，加入PBST溶液洗滌，重復洗滌3遍后，加入10 mL/L雞血清的PBST溶液100 μL/孔封閉，置于37℃生化培養(yǎng)箱1 h；棄去孔內(nèi)液體，按如上方法洗滌3遍，加入本試驗制備的稀釋1 000倍的抗山羊IFN-γ單克隆抗體、稀釋1 000倍的IFN-γ陽性小鼠血清(免疫鼠剪尾采血)、稀釋1 000倍的陰性血清(未免疫鼠剪尾采血)，100 μL/孔，每個樣品做3個重復，封口后置于37℃生化培養(yǎng)箱1 h；棄去板內(nèi)溶液，按如上步驟洗滌3遍，用排槍吸取配制的羊抗鼠酶標二抗(二抗∶PBST=1∶5 000)溶液100 μL/孔加入板內(nèi)，封口后置于37℃培養(yǎng)溫箱1 h；棄去板內(nèi)溶液，按如上方法用PBST溶液清洗5遍，避光加入TMB溶液100 μL/孔，于37℃生化培養(yǎng)箱20 min；加入2 mol/L稀硫酸100 μL/孔，立即置于酶標儀上讀數(shù)。

1.2.4 脾細胞與SP2/0細胞融合 于細胞融合前1周復蘇SP2/0細胞，擴大培養(yǎng)備用；融合前1 d，制備飼養(yǎng)層細胞，具體操作為將健康未免疫小鼠眼球摘除取血并分離血清，作為陰性血清，處死小鼠無菌處理后，注射RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基到小鼠腹腔，輕柔柔壓后收集，重復3次，將收集的腹腔液1 000 r/min離心10 min，用HAT選擇培養(yǎng)基重懸后，加入96孔細胞培養(yǎng)板，37℃、體積分數(shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)備用；融合當天取免疫小鼠按上述方法取其血清后無菌處理，然后剖解小鼠取其脾臟去除筋膜后置于200目篩網(wǎng)上研磨分離脾細胞，；取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SP2/0細胞，調(diào)整細胞濃度使脾細胞數(shù)量比SP2/0細胞數(shù)量在108∶(1～2)×107范圍，按照融合劑PEG1500的操作說明來進行細胞融合，最后將融合細胞加入到上述含有飼養(yǎng)層細胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、體積分數(shù)為 5% CO2條件下培養(yǎng)[8]。

1.2.5 分泌抗山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細胞篩選 每天觀察培養(yǎng)板內(nèi)的細胞，當觀察到大部分孔內(nèi)有細胞團時，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，按照1.2.3方法檢測，保留陽性孔，按照有限稀釋法進行至少3次亞克隆，并按1.2.3方法檢測，最終獲得目的雜交瘤細胞。

1.2.6 抗山羊IFN-γ單克隆抗體特異性測定 以本實驗室保存的純化山羊rIFN-γ蛋白、純化山羊rIL-1β蛋白、純化山羊rIL-17蛋白、純化空載體融合標簽蛋白和參照文獻[3]制備的山羊外周血淋巴細胞培養(yǎng)上清為包被抗原，以篩選獲得的雜交瘤細胞分泌的抗體為一抗進行ELISA檢測，檢測獲得的單克隆抗體與這幾種抗原的反應性。

1.2.7 抗山羊IFN-γ單克隆抗體效價測定 將上述篩選所得雜交瘤細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為106個/mL，注射500 μL到提前1周用液體石蠟預處理的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，待小鼠腹部膨大后，抽取腹水離心收集上清，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆?；將腹水分別稀釋102、103、104、105、106倍，按1.2.3 ELISA檢測，確定腹水中抗體的效價。

1.2.8 抗山羊IFN-γ單克隆抗體亞型鑒定及雜交瘤細胞染色體組型分析 本試驗采用Roch公司Iso Strip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(抗體亞型檢測試劑盒)測定單克隆抗體類別和亞型，操作步驟為先將腹水抗體稀釋2×105倍，使其濃度在0.1 μg/mL～1 μg/mL之間，吸取150 μL加入顯色管內(nèi)；在15℃～25℃下作用30 s，輕輕晃動，使藍色粉末完全混勻；取一條試紙條將黑色端插入顯色管底部，作用3 min左右觀察結(jié)果。分泌抗山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細胞染色體組型分析結(jié)果由西安交通大學第一附屬醫(yī)院提供。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清抗體效價測定結(jié)果

小鼠第4次免疫后第9天，尾部采血分離血清，進行ELISA檢測，檢測結(jié)果表明，其抗體效價達到1∶105(表1)。

表1 第4次免疫后小鼠血清效價

2.2 脾細胞與SP2/0細胞融合結(jié)果

對融合后細胞進行觀察、檢測后，其融合率達到了70%，初次檢測陽性率為3%(圖1)。

2.3 抗山羊IFN-γ單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

篩選結(jié)果獲得了1株陽性雜交瘤細胞，命名為

3C。該雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體不識別rIL-1β、rIL-17、空載標簽蛋白等，只識別山羊rIFN-γ ；其分泌的單克隆抗體與含有IFN-γ的山羊外周血淋巴細胞培養(yǎng)上清液發(fā)生反應，即本株單克隆抗體不僅能識別原核表達山羊rIFN-γ，還能識別天然山羊IFN-γ (表2)。

2.4 單克隆抗體效價檢測結(jié)果

如表3所示，使用間接ELISA方法測定，將腹水稀釋為1∶106后，其OD450為0.161，雜交瘤細胞上清液稀釋為1∶103，其OD450為0.134，P/N均大于2/1，即腹水抗體效價為1∶106，雜交瘤細胞上清效價為1∶103。

2.5 抗山羊IFN-γ單克隆抗體亞型鑒定和雜交瘤細胞染色體組型分析結(jié)果

結(jié)果顯示(圖2和圖3)，單克隆抗體3C類別為IgG1，輕鏈類型為κ型；雜交瘤細胞染色體數(shù)目為SP2/0細胞染色體數(shù)目與正常小鼠脾細胞的染色體數(shù)目之和，符合融合細胞的染色體數(shù)目規(guī)律[8]。

圖1 融合第7 d雜交瘤細胞

表2 抗山羊IFN-γ單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

表3 抗體效價檢測結(jié)果

3 討論

本研究采用間接ELISA方法篩選到1株分泌抗山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對其分泌的單克隆抗體特異性、抗體類別鑒定表明，該單克隆抗體能特異性識別山羊IFN-γ，抗體類別為IgG1。同時本研究分離并培養(yǎng)了山羊外周血淋巴細胞，用con-A刺激淋巴細胞產(chǎn)生天然山羊IFN-γ，收集后作為包被抗原，檢測結(jié)果表明，本試驗所得的單克隆抗體能特異性識別天然山羊IFN-γ蛋白，彌補了山羊IFN-γ單克隆抗體的空白。后續(xù)試驗會針對抗體特性來決定其具體應用，如膠體金試紙條的相關(guān)研究和流式細胞標記用抗體[9]。

免疫小鼠過程中所用抗原為山羊IFN-γ原核表達蛋白，原核表達蛋白具有生產(chǎn)周期短、易于純化、表達量高等優(yōu)點，但其活性及表位完整度卻不及真核表達產(chǎn)物；而真核表達的山羊IFN-γ蛋白，表達量低、難于純化，不符合免疫小鼠的抗原要求。本試驗分離培養(yǎng)了山羊外周血淋巴細胞，用con-A刺激淋巴細胞產(chǎn)生天然山羊IFN-γ，驗證了所獲單克隆抗體既可識別原核表達山羊IFN-γ，又可識別天然山羊IFN-γ[10]。單克隆抗體的制備過程中，有很多關(guān)鍵性因素，如免疫小鼠用的抗原中雜蛋白過多，會造成脾臟內(nèi)針對雜蛋白活化的淋巴細胞過多，導致陽性率偏低，也為篩選增加了工作難度。因此，在單克隆抗體制備過程中，免疫小鼠的抗原應純化到最大程度。

圖2 雜交瘤細胞亞型鑒定

圖3 雜交瘤細胞染色體數(shù)目分析

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DetectionandPhylogeneticAnalysisofSheepPoxvirus

ZHAO Lin1,2，LI Meng2，LUO Jing2，WANG Cheng-min2，WANG Yu-tian3， ZHAO Bao-hua1，HE Hong-xuan2

(1.CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang，Hebei，050024,China; 2.NationalResearchCenterforWildlifeBornDiseases,KeyLaboratoryofAnimalEcologyandConservationBiology,InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing，100101，China; 3.AnimalHusbandryStation,Beijing，100101,China)

Capripox virus (CaPV) is one of the most concerned infectious diseases around the world.In recent years,CaPV circulated in North and Middle Africa,Middle East and Asia,which have caused great damage to the breeding industry.In this research,four sheep were preliminarily speculated to be infected with CaPV.A final diagnosis was made based on clinical signs,postmortem examinations,histopathological analysis,and PCR detection.Phylogenetic analysis indicated that the causative CaPV belongs to Asia-lineage,and they are few genetic mutation in China.Our results provided useful information for the diagnosis of capripox.Additionally,the research is valuable for the analysis of virus evolution and mutation.

Sheep pox; clinical sign; histopathological examination; PCR; phylogenetic analysis

PreparationandIdentificationofHybridomaCellLinesSecretingAntibodiesagainstGoatIFN-gamma

ZHANG Hong-jie,SANG Feng-feng,LIU A-Hua,LI Yan-yan,WANG Yi,CHEN De-kun

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0014-04

2017-04-10

陜北白絨山羊主要疫病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(2015KTTSNY04-04)

張洪杰(1990-)，男，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病原學與免疫學研究。*

Abstract:In order to prepare hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against goat IFN-γ,Balb/c mice were immunized with purified prokaryotic recombiant goat IFN-γ (rIFN-γ) and the splenocytes were isolated and fused with SP2/0 myeloma to generate hybridoma cells.Then the supernatant was collected to identify the monoclonal antibodies recognizing goat IFN-γ specifically.In the present study,an I-ELISA method was established to detect antibodies against goat IFN- γ when the antigen was coated with goat lymphocytes.Then the classes and types of monoclonal antibodies against goat IFN-γ were characterized by quick test strip.The results suggested that a strain of hybridoma cell named 3C which showed high specificity was prepared successfully,and the monoclonal antibody was identified as IgG class and kappa type.

Keywords:goat; IFN-γ; hybridoma cell