張洪杰，桑鋒鋒，劉阿華，李言言，王 毅，陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

分泌抗山羊γ干擾素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備與鑒定

張洪杰，桑鋒鋒，劉阿華，李言言，王 毅，陳德坤*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為篩選分泌山羊γ干擾素(IFN-γ)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，以原核表達(dá)的山羊rIFN-γ蛋白免疫Balb/c小鼠，取其脾臟細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以間接ELISA方法篩選分泌山羊IFN-γ單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，采用山羊外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ包被酶標(biāo)板對(duì)IFN-γ的特異性進(jìn)行鑒定，用試紙條對(duì)IFN-γ單克隆抗體類(lèi)別和亞型進(jìn)行鑒定。結(jié)果獲得了1株能特異性識(shí)別山羊IFN-γ的雜交瘤細(xì)胞3C，3C分泌的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別天然結(jié)構(gòu)的山羊IFN-γ，單克隆抗體類(lèi)別為IgG，輕鏈為 κ型。

山羊；γ干擾素；雜交瘤細(xì)胞

γ干擾素(IFN-γ)主要由活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞免疫，具有抗病毒感染、抗腫瘤等生物學(xué)活性，IFN-γ能夠增強(qiáng)受體介導(dǎo)的吞噬功能，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺傷活性。一方面，IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)，提升抗原呈遞能力；另一方面，能活化巨噬細(xì)胞促進(jìn)殺傷胞內(nèi)寄生病原。活化的巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的水平也明顯提高。而且，在局部炎癥反應(yīng)中， IL-1β、IL-17等細(xì)胞因子量的變化會(huì)引起IFN-γ表達(dá)量的差異[1]。因此，炎癥部位IFN-γ含量的變化可作為評(píng)估機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，為疾病的診斷治療和相關(guān)機(jī)理研究提供新的思路。目前市面上尚未見(jiàn)到山羊IFN-γ單克隆抗體的相關(guān)產(chǎn)品，這不利于山羊IFN-γ的相關(guān)研究。本試驗(yàn)通過(guò)ELISA方法篩選分泌山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并對(duì)抗體的特異性、亞型等進(jìn)行鑒定，獲得了山羊IFN-γ單克隆抗體，為山羊IFN-γ檢測(cè)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 雌性Balb/c小鼠，6周齡，購(gòu)自空軍大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；純化的山羊rIFN-γ蛋白、純化山羊rIL-1β蛋白、純化山羊rIL-17蛋白、純化空載體融合標(biāo)簽蛋白、SP2/0細(xì)胞，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室)保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品；TMB顯色液為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；小鼠抗體亞型鑒定試劑盒為Roch公司產(chǎn)品；Ni-NTA瓊脂糖凝膠鎳柱為上海TransGen公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；酶標(biāo)板為Castor公司產(chǎn)品；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫原制備 將純化的山羊rIFN-γ蛋白凍干粉[3]溶于蒸餾水，測(cè)定濃度，配制成1 mg/mL。取完全弗氏佐劑1 mL與等量山羊rIFN-γ蛋白溶液混勻，用注射器吸入三通管置于冰上來(lái)回推打乳化，約1 h后，取一小滴滴于平靜水面上，乳化物20 min內(nèi)不散開(kāi)，此作為免疫原備用；按照同樣方法取1 mL山羊rIFN-γ蛋白溶液與等量不完全弗氏佐劑混勻乳化備用。以上抗原的制備均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 小鼠免疫 取上述制備好的抗原，按照200 μL/只，對(duì)6周齡雌性Balb/c小鼠進(jìn)行首免。首免后第21天進(jìn)行二免，二免用的抗原為不完全弗氏佐劑與山羊rIFN-γ乳化所制，免疫劑量和途徑同首免。二免后第15天進(jìn)行第3次免疫，三免抗原、劑量和途徑同二免一樣。三免后第9天測(cè)定免疫小鼠血清抗體效價(jià)。免疫次數(shù)以小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到要求為目標(biāo)。

1.2.3 山羊IFN-γ抗體的ELISA 檢測(cè) 取上述配制好的1 mg/mL山羊rIFN-γ蛋白溶液，調(diào)整其蛋白濃度為10 μg/mL，100 μL/孔加入96孔ELISA 酶標(biāo)板內(nèi)，封口后4℃放置14 h；棄去酶標(biāo)板內(nèi)液體，加入PBST溶液洗滌，重復(fù)洗滌3遍后，加入10 mL/L雞血清的PBST溶液100 μL/孔封閉，置于37℃生化培養(yǎng)箱1 h；棄去孔內(nèi)液體，按如上方法洗滌3遍，加入本試驗(yàn)制備的稀釋1 000倍的抗山羊IFN-γ單克隆抗體、稀釋1 000倍的IFN-γ陽(yáng)性小鼠血清(免疫鼠剪尾采血)、稀釋1 000倍的陰性血清(未免疫鼠剪尾采血)，100 μL/孔，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，封口后置于37℃生化培養(yǎng)箱1 h；棄去板內(nèi)溶液，按如上步驟洗滌3遍，用排槍吸取配制的羊抗鼠酶標(biāo)二抗(二抗∶PBST=1∶5 000)溶液100 μL/孔加入板內(nèi)，封口后置于37℃培養(yǎng)溫箱1 h；棄去板內(nèi)溶液，按如上方法用PBST溶液清洗5遍，避光加入TMB溶液100 μL/孔，于37℃生化培養(yǎng)箱20 min；加入2 mol/L稀硫酸100 μL/孔，立即置于酶標(biāo)儀上讀數(shù)。

1.2.4 脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合 于細(xì)胞融合前1周復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)備用；融合前1 d，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，具體操作為將健康未免疫小鼠眼球摘除取血并分離血清，作為陰性血清，處死小鼠無(wú)菌處理后，注射RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基到小鼠腹腔，輕柔柔壓后收集，重復(fù)3次，將收集的腹腔液1 000 r/min離心10 min，用HAT選擇培養(yǎng)基重懸后，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)備用；融合當(dāng)天取免疫小鼠按上述方法取其血清后無(wú)菌處理，然后剖解小鼠取其脾臟去除筋膜后置于200目篩網(wǎng)上研磨分離脾細(xì)胞，；取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度使脾細(xì)胞數(shù)量比SP2/0細(xì)胞數(shù)量在108∶(1～2)×107范圍，按照融合劑PEG1500的操作說(shuō)明來(lái)進(jìn)行細(xì)胞融合，最后將融合細(xì)胞加入到上述含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2條件下培養(yǎng)[8]。

1.2.5 分泌抗山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選 每天觀察培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞，當(dāng)觀察到大部分孔內(nèi)有細(xì)胞團(tuán)時(shí)，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，按照1.2.3方法檢測(cè)，保留陽(yáng)性孔，按照有限稀釋法進(jìn)行至少3次亞克隆，并按1.2.3方法檢測(cè)，最終獲得目的雜交瘤細(xì)胞。

1.2.6 抗山羊IFN-γ單克隆抗體特異性測(cè)定 以本實(shí)驗(yàn)室保存的純化山羊rIFN-γ蛋白、純化山羊rIL-1β蛋白、純化山羊rIL-17蛋白、純化空載體融合標(biāo)簽蛋白和參照文獻(xiàn)[3]制備的山羊外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清為包被抗原，以篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)獲得的單克隆抗體與這幾種抗原的反應(yīng)性。

1.2.7 抗山羊IFN-γ單克隆抗體效價(jià)測(cè)定 將上述篩選所得雜交瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，注射500 μL到提前1周用液體石蠟預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，待小鼠腹部膨大后，抽取腹水離心收集上清，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆?；將腹水分別稀釋102、103、104、105、106倍，按1.2.3 ELISA檢測(cè)，確定腹水中抗體的效價(jià)。

1.2.8 抗山羊IFN-γ單克隆抗體亞型鑒定及雜交瘤細(xì)胞染色體組型分析 本試驗(yàn)采用Roch公司Iso Strip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(抗體亞型檢測(cè)試劑盒)測(cè)定單克隆抗體類(lèi)別和亞型，操作步驟為先將腹水抗體稀釋2×105倍，使其濃度在0.1 μg/mL～1 μg/mL之間，吸取150 μL加入顯色管內(nèi)；在15℃～25℃下作用30 s，輕輕晃動(dòng)，使藍(lán)色粉末完全混勻；取一條試紙條將黑色端插入顯色管底部，作用3 min左右觀察結(jié)果。分泌抗山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞染色體組型分析結(jié)果由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

小鼠第4次免疫后第9天，尾部采血分離血清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，其抗體效價(jià)達(dá)到1∶105(表1)。

表1 第4次免疫后小鼠血清效價(jià)

2.2 脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合結(jié)果

對(duì)融合后細(xì)胞進(jìn)行觀察、檢測(cè)后，其融合率達(dá)到了70%，初次檢測(cè)陽(yáng)性率為3%(圖1)。

2.3 抗山羊IFN-γ單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

篩選結(jié)果獲得了1株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，命名為

3C。該雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體不識(shí)別rIL-1β、rIL-17、空載標(biāo)簽蛋白等，只識(shí)別山羊rIFN-γ ；其分泌的單克隆抗體與含有IFN-γ的山羊外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液發(fā)生反應(yīng)，即本株單克隆抗體不僅能識(shí)別原核表達(dá)山羊rIFN-γ，還能識(shí)別天然山羊IFN-γ (表2)。

2.4 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

如表3所示，使用間接ELISA方法測(cè)定，將腹水稀釋為1∶106后，其OD450為0.161，雜交瘤細(xì)胞上清液稀釋為1∶103，其OD450為0.134，P/N均大于2/1，即腹水抗體效價(jià)為1∶106，雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)為1∶103。

2.5 抗山羊IFN-γ單克隆抗體亞型鑒定和雜交瘤細(xì)胞染色體組型分析結(jié)果

結(jié)果顯示(圖2和圖3)，單克隆抗體3C類(lèi)別為IgG1，輕鏈類(lèi)型為κ型；雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為SP2/0細(xì)胞染色體數(shù)目與正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目之和，符合融合細(xì)胞的染色體數(shù)目規(guī)律[8]。

圖1 融合第7 d雜交瘤細(xì)胞

表2 抗山羊IFN-γ單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

表3 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本研究采用間接ELISA方法篩選到1株分泌抗山羊IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)其分泌的單克隆抗體特異性、抗體類(lèi)別鑒定表明，該單克隆抗體能特異性識(shí)別山羊IFN-γ，抗體類(lèi)別為IgG1。同時(shí)本研究分離并培養(yǎng)了山羊外周血淋巴細(xì)胞，用con-A刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生天然山羊IFN-γ，收集后作為包被抗原，檢測(cè)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所得的單克隆抗體能特異性識(shí)別天然山羊IFN-γ蛋白，彌補(bǔ)了山羊IFN-γ單克隆抗體的空白。后續(xù)試驗(yàn)會(huì)針對(duì)抗體特性來(lái)決定其具體應(yīng)用，如膠體金試紙條的相關(guān)研究和流式細(xì)胞標(biāo)記用抗體[9]。

免疫小鼠過(guò)程中所用抗原為山羊IFN-γ原核表達(dá)蛋白，原核表達(dá)蛋白具有生產(chǎn)周期短、易于純化、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，但其活性及表位完整度卻不及真核表達(dá)產(chǎn)物；而真核表達(dá)的山羊IFN-γ蛋白，表達(dá)量低、難于純化，不符合免疫小鼠的抗原要求。本試驗(yàn)分離培養(yǎng)了山羊外周血淋巴細(xì)胞，用con-A刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生天然山羊IFN-γ，驗(yàn)證了所獲單克隆抗體既可識(shí)別原核表達(dá)山羊IFN-γ，又可識(shí)別天然山羊IFN-γ[10]。單克隆抗體的制備過(guò)程中，有很多關(guān)鍵性因素，如免疫小鼠用的抗原中雜蛋白過(guò)多，會(huì)造成脾臟內(nèi)針對(duì)雜蛋白活化的淋巴細(xì)胞過(guò)多，導(dǎo)致陽(yáng)性率偏低，也為篩選增加了工作難度。因此，在單克隆抗體制備過(guò)程中，免疫小鼠的抗原應(yīng)純化到最大程度。

圖2 雜交瘤細(xì)胞亞型鑒定

圖3 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目分析

[1] 趙燕清.奶山羊隱性乳腺炎的流行病學(xué)調(diào)查及S.aureus感染小鼠乳腺后Th細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制研究 [D]:陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

[2] Boshra H,Truong T,Nfon C,et al.A lumpy skin disease virus deficient of an IL-10 gene homologue provides protective immunity against virulent capripoxvirus challenge in sheep and goats[J].Antiviral Res，2015，123:39-49.

[3] 安 貝.山羊IFN-γ基因的克隆表達(dá)及抗ORFV活性鑒定 [D]:陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[4] 劉鶴媛,周 銘,岳進(jìn)華,等.山羊IFN-γ免疫血清制備及抗體ELISA檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37(12):24-27.

[5] Liu Y,Li X,Li Z,et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against infectious bursal disease virus (IBDV) VP4[J].Shengwu Gongcheng Xuebao ， 2014，30:1660-1668.

[6] Hao Z,Xu L,Bai Y,et al.Preparation of monoclonal antibodies against hFGF-21 and identification of epitope[J].Xibao Yu Fenzi Mianyi Xue Zazhi,2013,29:834-837.

[7] Zhou J,Zhao L,Hu J H,et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against recombinant N protein of mouse hepatitis virus[J].Xibao Yu Fenzi Mianyi Xue Zazhi,2012,28:841-843.

[8] Yang Y,Ma Y,Li H,et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against omega-conotoxin MVIIA[J].Monoclonal Antibodies Immunodiagnosis Immunotherapy,2014,33:254-260.

[9] 金 標(biāo).山羊干擾素-γ與白細(xì)胞介素-2的克隆、原核表達(dá)及其抗血清的制備[D].黑龍江哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[10] 李 川,譚亞娣,陳穎鈺,等.牛IFN-γ原核表達(dá)、單克隆抗體制備及其ELISA檢測(cè)方法的建立[J].生物工程學(xué)報(bào) 2007,23:40-45.

DetectionandPhylogeneticAnalysisofSheepPoxvirus

ZHAO Lin1,2，LI Meng2，LUO Jing2，WANG Cheng-min2，WANG Yu-tian3， ZHAO Bao-hua1，HE Hong-xuan2

(1.CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang，Hebei，050024,China; 2.NationalResearchCenterforWildlifeBornDiseases,KeyLaboratoryofAnimalEcologyandConservationBiology,InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing，100101，China; 3.AnimalHusbandryStation,Beijing，100101,China)

Capripox virus (CaPV) is one of the most concerned infectious diseases around the world.In recent years,CaPV circulated in North and Middle Africa,Middle East and Asia,which have caused great damage to the breeding industry.In this research,four sheep were preliminarily speculated to be infected with CaPV.A final diagnosis was made based on clinical signs,postmortem examinations,histopathological analysis,and PCR detection.Phylogenetic analysis indicated that the causative CaPV belongs to Asia-lineage,and they are few genetic mutation in China.Our results provided useful information for the diagnosis of capripox.Additionally,the research is valuable for the analysis of virus evolution and mutation.

Sheep pox; clinical sign; histopathological examination; PCR; phylogenetic analysis

PreparationandIdentificationofHybridomaCellLinesSecretingAntibodiesagainstGoatIFN-gamma

ZHANG Hong-jie,SANG Feng-feng,LIU A-Hua,LI Yan-yan,WANG Yi,CHEN De-kun

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0014-04

2017-04-10

陜北白絨山羊主要疫病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(2015KTTSNY04-04)

張洪杰(1990-)，男，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*

Abstract:In order to prepare hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against goat IFN-γ,Balb/c mice were immunized with purified prokaryotic recombiant goat IFN-γ (rIFN-γ) and the splenocytes were isolated and fused with SP2/0 myeloma to generate hybridoma cells.Then the supernatant was collected to identify the monoclonal antibodies recognizing goat IFN-γ specifically.In the present study,an I-ELISA method was established to detect antibodies against goat IFN- γ when the antigen was coated with goat lymphocytes.Then the classes and types of monoclonal antibodies against goat IFN-γ were characterized by quick test strip.The results suggested that a strain of hybridoma cell named 3C which showed high specificity was prepared successfully,and the monoclonal antibody was identified as IgG class and kappa type.

Keywords:goat; IFN-γ; hybridoma cell