王耀杰，李梓碩，劉 碩，李雙輝，趙是棟，雷 培，孟凡娟*，王 超，關法春，桑利群

（1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林長春 130124；3.西藏農(nóng)牧學院，西藏林芝 860000）

基于ISSR技術對西藏巨柏遺傳多樣性研究

王耀杰1，李梓碩1，劉 碩1，李雙輝1，趙是棟1，雷 培1，孟凡娟1*，王 超2，關法春2，桑利群3

（1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林長春 130124；3.西藏農(nóng)牧學院，西藏林芝 860000）

為研究來自不同地區(qū)的野生西藏巨柏的遺傳多樣性，利用ISSR技術對39株西藏巨柏的遺傳關系進行分析。結(jié)果表明：利用2個最適引物共擴增出289條條帶，遺傳多樣性較高，多態(tài)位百分點為96.16%，有效等位基因數(shù)為1.76，觀測等位基因數(shù)為1.96，Shannon多樣性指數(shù)為0.60，種群總基因多樣性為0.44，種群內(nèi)基因多樣性為0.41，基因流為7.33。可見巨柏個體間存在明顯基因流動。本研究對巨柏種群保存和進化研究有重要意義。

巨柏；遺傳多樣性；ISSR

巨柏Cupressus gigantea又名雅魯藏布江柏木，屬于柏科Cupressaceae柏木屬Cupressus植物，于1975年在西藏東部發(fā)現(xiàn)[1]，是西藏地區(qū)特有的瀕危國家珍稀二級物種[2]，主要分布于雅魯藏布江中游朗縣至米林、林芝等沿江兩岸的河谷地帶，平均海拔3 000～3 400 m，呈斑塊狀和狹帶狀生長[3]。盡管西藏巨柏具有很高的經(jīng)濟效益和生態(tài)價值，但是其群體分布區(qū)域較小，數(shù)量稀少，而且由于近年來自然環(huán)境破壞和人類活動干擾，導致巨柏種群整體呈明顯衰退現(xiàn)象[4-5]。本試驗利用ISSR分子標記技術，研究和分析巨柏的遺傳多樣性，不僅有利于巨柏的種群擴大和穩(wěn)定發(fā)展，而且對西藏地區(qū)的物種多樣性和生態(tài)發(fā)展具有重要價值，從而為其更好地保護管理、自然更新、擴大種群等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生巨柏種子來自西藏雅魯藏布江沿岸路段。該地區(qū)屬于森林和草原的過渡帶，光照充裕。巨柏種子共計39個樣品，均種植在東北林業(yè)大學遺傳學實驗室。2017年4月選取植株長勢一致、挺拔、生長旺盛的巨柏植株，隨機采集9個不同地點（A、B、C、D、E、F、G、H、I）的樣本進行試驗，選擇分布地主要為郎縣和米林縣自然分布區(qū)，具體見表1。

表1 西藏巨柏的9個種群的地理信息

1.2 試驗設計

1.2.1 ISSR-PCR擴增體系

引物選用加拿大哥倫比亞大學公布的100個ISSR隨機引物中的10個。經(jīng)過預試驗篩選，選出PCR產(chǎn)物條帶清晰、明亮、多態(tài)性豐富、重現(xiàn)性高的引物進行實驗，以其中多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的2個引物 UBC808(5′-AGA GAG AGA GAG AGA GC-3′)，UBC841（5′-GAG AGA GAG AGA GAG AYC-3′）對所有樣品進行擴增。退火溫度由引物合成公司說明書提供，再進行（Tm±1～2）℃的篩選，選出最適溫度。雖然引物差異較大，選用的2個引物退火溫度不同，但是PCR產(chǎn)物條帶清晰，是后續(xù)實驗的最適溫度。試驗采用20 μL的PCR反應體系：3 μL DNA模板 ；0.3 μL 引 物（20 μmol·μL-1）；2 dμL dNTP Mixture（2.5 mmol·μL-1）；2 μL 的 10×PCR Buffer；0.3 μL的Taq酶（5 U·μL-1）。PCR程序為：94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)，72℃7 min，冷卻至10℃，4℃保存。

1.2.2 瓊脂糖電泳

對PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel-Red染色。取10 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 10×Loading Buffer混合后點樣，2 000 bp DNA marker（TaKaRa基因科技公司）110 V，60 min。電泳后用Universal HoodⅡ凝膠成像儀（沈陽百瑞德進出口貿(mào)易公司）照相保存并記錄結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

以DM2000的Marker為分子量的標準，統(tǒng)計每個樣品擴增后的條帶，并選取清晰、明亮的條帶。使用PopGene 1.32軟件進行遺傳多樣性數(shù)據(jù)分析，使用NTSYS-PC 2.1軟件進行巨柏種群聚類分析。在凝膠上同一條帶同一位置有條帶的視為1，無條帶的視為0，生成0-1原始數(shù)據(jù)矩陣，輸入計算機，生成表格。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標記的遺傳多態(tài)性分析

如圖1所示，用2個引物對9個巨柏居群39個樣品進行PCR擴增，共擴增出289個條帶，平均每個樣品擴增出7.41條。條帶清晰易分辨，擴增的條帶長度為250～2 000 bp，各材料之間條帶的大小和多態(tài)性不同。

圖1 引物UBC-808的PCR擴增產(chǎn)物

2.2 基于ISSR標記的遺傳相似系數(shù)分析

使用軟件對選取的39個樣品巨柏的ISSR-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)：多態(tài)位點百分率（PPB）為 96.16%，有效等位基因數(shù) Ne（Effective number of alleles）為 1.76，觀測等位基因數(shù) Na為1.96，Shannon多樣性指數(shù)為0.60，遺傳分化系數(shù)Gst為0.06。種群總基因多樣性Ht為0.44，種群內(nèi)基因多樣性Hs為0.41，基因流Nm為7.33。

2.3 基于ISSR標記的聚類分析

利用NTSYS 2.10e軟件對39個樣品進行遺傳相似性系數(shù)分析，構建聚類分析樹狀圖。如圖2所示，39個巨柏樣品在遺傳相似系數(shù)0.51處分為兩大類，而在遺傳相似系數(shù)0.64處可分為5個大類，第一類主要為居群A、B、I、E、F等；第二類為居群2、6；第三類為居群H、I、E、F等；第四類主要為居群B、C和D。第五類主要為居群除A以外，均有所涉及。

圖2 西藏巨柏的聚類分析樹狀圖

3 結(jié)論與討論

通過對野生西藏巨柏的ISSR分子標記研究發(fā)現(xiàn)，西藏野生巨柏居群整體遺傳多樣性水平較高，但遺傳分化程度偏低。其中多態(tài)位點百分率為96.16，表明選取的巨柏群體整體遺傳多樣性高。有效等位基因數(shù)為1.76，觀測等位基因數(shù)為1.96，Shannon多樣性指數(shù)為0.60，這些都說明巨柏的遺傳多樣性較高，這也許利于巨柏的進化，以適應多變的環(huán)境。同時種群總基因多樣性為0.44，種群內(nèi)基因多樣性為0.41，基因流為7.33，居群間的基因多樣度為0.028 3，這表明在巨柏物種水平上，有2.83%的遺傳變異存在于居群間；基因流數(shù)值較小，種群間基因交流不頻繁。但是由巨柏遺傳聚類分析圖可知：39個巨柏樣品沒有較明顯的聚類情況，而是分散在其他居群內(nèi)，說明野生巨柏居群間存在一定的基因流動。結(jié)合取樣地理分布圖可知，地理分布范圍是決定巨柏種遺傳多樣性的重要因素，且相鄰地區(qū)的居群間趨向于更髙的遺傳一致度，表現(xiàn)出很高的遺傳相似性。地理位置相近的居群之間基因交流如花粉、種子傳播較頻繁，表現(xiàn)為較近的親緣性。

綜合以上分析發(fā)現(xiàn)，采用ISSR技術可以有效揭示西藏巨柏居群間及種間的遺傳多樣性、遺傳分化程度和親緣關系。而且根據(jù)源自相近地區(qū)的巨柏種有聚集在一起的趨勢，但是較為分散，且遺傳多樣性較為豐富。這是否是由于環(huán)境條件改變和種群發(fā)展進化的不同階段發(fā)生不同的基因表達，或者是漫長的生存和進化過程使巨柏具備更高的遺傳多樣性，為此，還需要從多種角度進行更進一步的深入研究。但是我們必須注意的是，由于巨柏豐富的遺傳特性，更適合就地保存。總之，研究巨柏種間和居群內(nèi)遺傳多樣性對珍稀物種的保護、培養(yǎng)和遺傳信息分析較為重要。

［1］鄭萬鈞，傅立國，誠靜容.中國裸子植物[J].植物分類學報，1975，13（4）：56-90.

［2］傅立國.中國珍稀瀕危植物的福音-國家重點保護植物名錄公布在即[J].植物雜志，1995（3）：2-3.

［3］鄭維列，薛會英，羅大慶，等.巨柏種群的生態(tài)地理分布與群落學特征[J].林業(yè)科學，2007，43（12)：8-15.

［4］于永福.國家重點保護植物名錄[J].植物雜志，1999（5）：4-11.

［5］汪松，解炎.中國物種紅色名錄[M].北京：高等教育出版社，2004.

［6］壯青.高原巨柏傲蒼穹[J].科學實驗，1977（11）：5-6.

Analysis of genetic diversity of Cupressus gigantea in Tibet by ISSR marker

WANG Yaojie1,LI Zishuo1,LIU Shuo1,LI Shuanghui1,ZHAO Shidong1,LEI Pei1,MENG Fanjuan1*,WANG Chao2,GUAN Fachun2,SANG Liqun3
（1.College of Life Science,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.JilinAcademy ofAgricultural Sciences,Changchun 130124,China;3.XizangAgricultureandAnimalHusbandryCollege,Linzhi860000,China）

To study the genetic diversity of the wildCupressus giganteaspecies in Tibet,39 samples were analyzed by ISSR molecular marker technology.289 bands were amplified by two suitable primers.The number of polymorphic alleles was 96.16%,the number of effective alleles was 1.76,the observed allele number was 1.96,Shannon diversity index I was 0.60,the total population diversity was 0.44,diversity Hs was 0.41 and gene flow was 7.33.These results showed that there was significant gene flow between populations.This study is meaning for the conservation and evolution ofCupressus gigantean.

Cupressus gigantea;genetic diversity;ISSR

Q781

A

1001-1714（2017）06-0012-03

2017-08-26

國家自然科學基金項目（41464054）；東北林業(yè)大學大學生創(chuàng)新項目（201710225303）。

王耀杰（1995-），男，本科生，主要從事植物逆境生理與分子生物學研究。E-mail：1870640125@qq.com。

*通訊作者：孟凡娟（1975-），女，教授，博士，主要從事植物逆境生理與分子生物學研究。E-mail：mfj19751@163.com。

張素清）