董穎婕 吳瑋, 王剛 韓浩倫 張弛 劉旭 屈昌北 劉鋼

1北京大學(xué)解放軍306醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院（北京100101）

2解放軍306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100101）

3中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心（北京100101）

EGB761對(duì)脈沖所致噪聲性聾大鼠內(nèi)耳形態(tài)及功能影響的研究

董穎婕1吳瑋1,2王剛2韓浩倫2張弛2劉旭2屈昌北2劉鋼3

1北京大學(xué)解放軍306醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院（北京100101）

2解放軍306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100101）

3中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心（北京100101）

目的探究銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，EGB761）對(duì)脈沖所致噪聲性聾的大鼠內(nèi)耳ABR閾值、毛細(xì)胞核染色、及錳超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase,Mn-SOD）活性的影響。方法80只SD大鼠隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組20只、實(shí)驗(yàn)組60只。實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予聲壓級(jí)為150dB脈沖噪聲，脈寬為30ms，重復(fù)率為1/min，連續(xù)3發(fā)。脈沖噪聲暴露后隨機(jī)分成暴露即刻組、生理鹽水組和EGB761組。EGB761組腹腔注射金納多4ml/kg，2/日，連續(xù)注射7天；生理鹽水組腹腔注射生理鹽水4ml/kg，2/日，連續(xù)注射7天。結(jié)果聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（Auditory Brain-Stem Response,ABR）結(jié)果顯示噪聲暴露后實(shí)驗(yàn)組大鼠ABR閾值顯著高于暴露前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各實(shí)驗(yàn)組大鼠間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療7天后，生理鹽水組及EGB761組大鼠ABR閾值均下調(diào)，EGB761組大鼠ABR閾移明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示空白對(duì)照組大鼠內(nèi)耳底回外毛細(xì)胞細(xì)胞核排列整齊；噪聲暴露即刻組大鼠內(nèi)耳底回外毛細(xì)胞核排列稀疏，較正常對(duì)照組缺失明顯增多，但仍以點(diǎn)狀缺失為主；生理鹽水組底回外毛細(xì)胞核缺失明顯，且出現(xiàn)片狀缺失，較暴露即刻組損傷嚴(yán)重;EGB761組較生理鹽水組底回外毛細(xì)胞核排列稀疏散亂，但缺失明顯減少,以點(diǎn)狀缺失為主。Mn-SOD結(jié)果顯示噪聲暴露即刻組內(nèi)耳Mn-SOD活性與空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；生理鹽水組Mn-SOD活性顯著低于暴露即刻組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EGB761組Mn-SOD活性明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論EGB761能明顯改善脈沖所致噪聲性聾的聽(tīng)功能下降、減少毛細(xì)胞消失及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)脈沖所致噪聲性聾的預(yù)后意義顯著。

噪聲性聾；聽(tīng)性腦干反應(yīng)；錳超氧化物歧化酶；銀杏葉提取物

噪聲污染已位列世界七大公害之首，噪聲危害已成為現(xiàn)代社會(huì)最主要的危害之一，嚴(yán)重影響人類(lèi)的身心健康，尤其特異性的損傷聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)。噪聲所致的感音神經(jīng)性聾已成為耳鼻喉科最常見(jiàn)的疾病之一，高頻聽(tīng)力易損是其最顯著的特點(diǎn)。以往研究顯示，感音神經(jīng)性聾的發(fā)生與內(nèi)耳感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切。[1]脈沖所致噪聲性聾是一種暴露于多次突發(fā)性的強(qiáng)烈噪聲后所引起的一種不可逆的聽(tīng)力損傷,為感音神經(jīng)性聾的一種，目前仍無(wú)確切的治療方案。金納多作為臨床常規(guī)治療突發(fā)性耳聾的特效藥，不僅可降低血管張力，拮抗血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)，減少紅細(xì)胞及血小板聚集，增加紅細(xì)胞變形性，從而改善內(nèi)耳血液循環(huán)，還可以增加組織細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受，穩(wěn)定脂質(zhì)膜，保護(hù)線粒體氧化呼吸等，從而改善組織代謝，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。[2]其成分銀杏黃酮甙萜類(lèi)內(nèi)酯還具有清除自由基的作用，能有效地抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷。[3-4]因此，本研究著眼于觀察EGB761對(duì)脈沖所致噪聲性聾大鼠耳蝸內(nèi)耳Mn-SOD活性的影響來(lái)探討其臨床療效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取健康雄性SD大鼠80只，體重180～200g，（由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供），耳廓反射靈敏，鼓膜標(biāo)志清晰，無(wú)強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有大鼠進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）閾值檢測(cè)，未見(jiàn)明顯差異。將80只大鼠隨機(jī)分成兩組，空白對(duì)照組20只，實(shí)驗(yàn)組60只，實(shí)驗(yàn)組大鼠給予噪聲暴露后隨機(jī)分成暴露即刻組、生理鹽水對(duì)照組和EGB761組各20只，并檢測(cè)ABR閾值。暴露即刻組檢測(cè)ABR閾值后立即取材；EGB761組腹腔注射金納多4ml/kg，2/日，連續(xù)注射7天，所用金納多為臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為K8082，每支5ml，含有銀杏葉提取物17.5mg，其中銀杏黃酮苷4.2mg。；生理鹽水組腹腔注射生理鹽水4ml/kg，2/日，連續(xù)注射7天。注射結(jié)束后，兩組大鼠分別檢測(cè)ABR閾值后取材。

1.2 噪聲暴露方法

脈沖噪聲為猝發(fā)聲，即刻便達(dá)到最大峰值，經(jīng)一系列振蕩波動(dòng)至靜壓力，實(shí)驗(yàn)中，脈沖噪聲由氣動(dòng)激波管產(chǎn)生，測(cè)量傳聲器為BK4136（丹麥Bruel&Kjaer公司）,聲級(jí)計(jì)為精密脈沖聲級(jí)計(jì)BK2209（丹麥Bruel&Kjaer公司）測(cè)量，采用數(shù)字示波器TDS2022（泰克公司）記錄脈沖波形，測(cè)量得到峰值聲壓級(jí)為150dBpeak，有效持續(xù)時(shí)間為30ms，總計(jì)為3發(fā)，重復(fù)間隔為1min。大鼠置于氣動(dòng)激波管管口正前方1米。

1.3 ABR閾值測(cè)試

所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)。噪聲暴露后即刻進(jìn)行ABR閾值測(cè)試。采用咪唑安定（80mg/kg）和鹽酸賽拉嗪注射液（200mg/kg）肌肉注射麻醉（麻醉深度為角膜反射消失，必要時(shí)給予總量的20%-30%維持），應(yīng)用聽(tīng)性腦干反應(yīng)儀在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)雙耳分別檢測(cè)短聲誘發(fā)（濾波帶寬80～3000Hz，疊加次數(shù)1024次，掃描10ms）的ABR閾值。刺激強(qiáng)度是5～97dB SPL。間隔5dB，以“重復(fù)性好，比較穩(wěn)定的Ⅲ波”為標(biāo)準(zhǔn)判定反應(yīng)閾值。電極設(shè)置為：顱頂為記錄極，測(cè)試耳為參考極，鼻尖處為地線。測(cè)試及麻醉復(fù)蘇過(guò)程中保持環(huán)境溫度為38℃左右并保持大鼠體溫恒定。

1.4 動(dòng)物取材

鼠斷頭迅速取耳蝸，在解剖顯微鏡下于4%多聚甲醛液中摘除鐙骨，用游絲鑷于蝸?lái)斻@一小孔，進(jìn)行灌流并固定，4℃冰箱過(guò)夜。用PBS（Phosphate buffer saline）漂洗3次，每次5分鐘。10%EDTA（Ethylene diaminetetraacetic acid）脫鈣2周，物理法測(cè)定脫鈣終點(diǎn)。以備免疫熒光檢測(cè)。鼠斷頭取耳蝸后，在解剖顯微鏡下于生理鹽水(0.9%NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)中摘除鐙骨，進(jìn)行灌流。兩對(duì)耳蝸為一個(gè)單位，加入4℃PBS在4℃進(jìn)行勻漿。隨后勻漿液4℃離心，取上清。用于Mn-SOD的檢測(cè)。

1.5 免疫熒光檢測(cè)方法及觀察

將脫鈣后的耳蝸在解剖顯微鏡下用游絲鑷于PBS溶液中剝出基底膜置于EP管中。PBS溶液漂洗3次，每次5分鐘；用1ml注射器吸出PBS溶液，加入5%BSA溶液，常溫封閉30分鐘。PBS溶液漂洗3次，每次5分鐘，置于4℃冰箱過(guò)夜。次日，PBS溶液漂洗3次，每次5分鐘；避光條件下進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，吸出PBS溶液，加入DAPI溶液10分鐘，PBS溶液漂洗3次，每次5分鐘；結(jié)束后，基底膜平鋪于載玻片上，進(jìn)行封片，標(biāo)本制作完畢。

將載玻片置于PALM熒光顯微鏡Apo Tome模式下，40倍觀察DAPI，激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，410-490 nm接收。對(duì)所觀察區(qū)域的毛細(xì)胞進(jìn)行Z-stack掃描，掃描層距為2.0 μm。

1.6 Mn-SOD檢測(cè)方法

用碧云天試劑盒SOD檢測(cè)緩沖液將上清液稀釋20倍。將Cu/Zn-SOD（Copper zinc superoxide dismutase）抑制劑A和稀釋后的上清液按1:24的體積比，在離心管內(nèi)或96孔板中混合好，37℃孵育1小時(shí)；取20微升Cu/Zn-SOD抑制劑B加入到780微升水中，混勻，即進(jìn)行40倍稀釋。然后將已經(jīng)40倍稀釋的Cu/Zn-SOD抑制劑B和上述混合物再按1:25的體積比混合均勻，37℃再孵育15分鐘。使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔。并依次加入待測(cè)樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。37℃孵育30分鐘。在450nm測(cè)定吸光度。計(jì)算上清液中Mn-SOD活力。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格根據(jù)碧云天試劑盒說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，暴露前、后組間ABR閾值比較采用方差分析，組內(nèi)自身比較采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，給藥后組間ABR閾移比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)比較，組間Mn-SOD活性?xún)蓛杀容^采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠暴露前后ABR閾值（dB SPL）Table 1ABR threshold of rats in each group before and after exposure（dB SPL）

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ABR反應(yīng)閾值及閾移比較(見(jiàn)表1、2)

兩組ABR閾移以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。實(shí)驗(yàn)前測(cè)ABR閾值各組大鼠均無(wú)異常，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.22,P=0.12）。脈沖噪聲暴露即刻后實(shí)驗(yàn)組大鼠ABR閾值顯著高于噪聲暴露前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=-17.52,P＜0.01），各實(shí)驗(yàn)組大鼠間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.01,P=0.37）。治療7天后，生理鹽水組及EGB761組ABR閾值均下調(diào)，EGB761組大鼠ABR閾移明顯高于生理鹽水組（T=0.24,P=0.02）。

2.2 各組大鼠底回外毛細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠給藥前后ABR閾移（dB SPL）Table 2 Threshold shift ofABR in rats in experience groupsbefore and after injection（dB SPL）

圖1 為各組大鼠耳蝸底回外毛細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化（DAPI染色，200x）（a）空白對(duì)照組，外毛細(xì)胞核排列整齊，偶見(jiàn)細(xì)胞核缺失；（b）暴露即刻組，外毛細(xì)胞核排列稍稀疏，細(xì)胞核缺失增多，仍以散在點(diǎn)狀缺失為主（c）生理鹽水組，外毛細(xì)胞核排列稀疏，出現(xiàn)大面積片狀缺失；（d）EGB761組，外毛細(xì)胞排列稀疏散亂，有散在的點(diǎn)狀缺失。Fig.1 is the morphological changes of the outer hair nuclei of the basal body(DAPI staining,200X)in each group of rats.(a)blank control group,the outer hair nuclei were arranged regularly and the nucleus was absent occasionally;(b)noise exposed immediate group,the outer hair nuclei were slightly sparse and the nuclei were absent,mainly scattered,punctate deletion.(c)normal saline group,the outer hair nuclei were sparse and large patchy deletion occurred.(d)EGB761 group,the outer hair cells are sparse and scattered,scattered punctate deletion.

以往研究表明，脈沖噪聲對(duì)大鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷主要以外毛細(xì)胞缺失為主，且以底回?fù)p傷最為嚴(yán)重，頂回?fù)p傷最輕。主要表現(xiàn)為外毛細(xì)胞的細(xì)胞核缺失。因此本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)大鼠內(nèi)耳外毛細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察其細(xì)胞核的損傷情況?？梢?jiàn)，空白對(duì)照組大鼠內(nèi)耳外毛細(xì)胞底回細(xì)胞核排列整齊，偶見(jiàn)細(xì)胞核缺失；噪聲暴露即刻組大鼠內(nèi)耳外毛細(xì)胞核排列稍顯稀疏，較正常對(duì)照組缺失明顯增多，但仍以點(diǎn)狀缺失為主；生理鹽水組外毛細(xì)胞核缺失明顯，且出現(xiàn)大片狀缺失，較暴露即刻組損傷嚴(yán)重，EGB761組外毛細(xì)胞核排列稀疏散亂，有散在缺失，為點(diǎn)狀缺失，較生理鹽水組缺失少。

2.3 各組大鼠內(nèi)耳Mn-SOD活性結(jié)果

表3 各組大鼠Mn-SOD活性情況Table 3 Activity of Mn-SOD in rats of each group

各組Mn-SOD活性均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。噪聲暴露即刻組內(nèi)耳Mn-SOD活性與空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（T=-0.68,P=0.51）；生理鹽水組Mn-SOD活性顯著低于暴露即刻組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=-9.27,P＜0.01），EGB761組Mn-SOD活性明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=-3.53,P=0.01）。

3 討論

抗氧化酶類(lèi)自由基清除劑是體內(nèi)最的抗自由基機(jī)體保護(hù)劑,主要包括超氧化物歧化酶(super-oxide dismutases,SODs)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)。其中，SODs是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線[5]，目前在哺乳動(dòng)物中己發(fā)現(xiàn)3種不同的SOD亞單位：Cu/Zu-SOD和Mn-SOD。Cu/Zn-SOD，也可稱(chēng)為SODI，位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)內(nèi)，分子量為32,000Da,有兩個(gè)蛋白質(zhì)亞單位,存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和溶酶體中。Mn-SOD，也稱(chēng)為SOD2，主要存在于原核生物和真核生物線粒體內(nèi)，分子量為40,000Da（1D=1u）,含有4個(gè)蛋白質(zhì)亞單位,其活性中心含有Mn離子[5-7]。其中，Mn-SOD在體內(nèi)外抗氧化損傷保護(hù)中發(fā)揮重要作用,是最重要的抗氧化酶[8]，其緊靠線粒體電子傳遞鏈,是線粒體內(nèi)唯一能把超氧陰離子（O2-）轉(zhuǎn)化為H2O2的酶。而GSH-Px和CAT分解為水和氧氣，最終使細(xì)胞無(wú)毒化[6,9-10]。

活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）是細(xì)胞凋亡的信使分子和效應(yīng)分子，是細(xì)胞氧化損傷的首先表現(xiàn)。ROS直接引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和DNA過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞持續(xù)造成傷害[11]，嚴(yán)重的可導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡并引起感音神經(jīng)性聾[12]，同時(shí)，也顯著降低Mn-SOD活性。細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要部位是線粒體，耳蝸由于氧代謝旺盛，極易遭受ROS的損傷[13]。耳蝸線粒體ROS過(guò)表達(dá)，血流量減少是造成噪聲暴露后耳蝸損傷的最重要的原因[14]。噪聲暴露過(guò)程中，除機(jī)械損傷外，強(qiáng)烈的氧化代謝活動(dòng)也引起耳蝸感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞損傷。此過(guò)程中，內(nèi)耳聽(tīng)毛細(xì)胞過(guò)度驅(qū)動(dòng)、耳蝸血流量減少增加了細(xì)胞內(nèi)無(wú)氧酵解，過(guò)多的ROS直接引起脂質(zhì)和DNA過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞持續(xù)造成損害[11]，嚴(yán)重的可導(dǎo)致興奮性神經(jīng)細(xì)胞腫脹、毛細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，引起感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失[12,15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，暴露即刻組Mn-SOD活性較正常組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。即刻組ABR閾值暴露前ABR閾值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），可能噪聲暴露即刻內(nèi)耳損傷主要以機(jī)械性損傷為主，沖擊力借助聽(tīng)骨鏈、前庭窗使內(nèi)淋巴劇烈波動(dòng),造成蝸窗膜破裂,螺旋器、毛細(xì)胞和聽(tīng)神經(jīng)損傷。以往研究表明，噪聲對(duì)大鼠內(nèi)耳底回?fù)p傷最早且最嚴(yán)重，因此，本實(shí)驗(yàn)主要觀察耳蝸底回毛細(xì)胞損傷情況?？梢?jiàn)耳蝸底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞核排列稀疏、散亂，核缺失較正常對(duì)照組明顯增多，但仍以點(diǎn)狀缺失為主。暴露即刻大鼠內(nèi)耳ROS雖開(kāi)始增多，由于時(shí)間短暫，并未打破ROS/SOD的平衡，Mn-SOD活性未受影響。隨著時(shí)間的推移，內(nèi)耳機(jī)械性損傷的同時(shí)，代謝性損傷也逐漸加重，內(nèi)耳ROS不斷堆積，內(nèi)生性SOD不足以清除過(guò)多的過(guò)氧化物，導(dǎo)致其大量積蓄，從而打破原有的ROS/SOD平衡，使線粒體膜性物質(zhì)受損，致功能障礙，同時(shí)，又進(jìn)一步增加ROS的蓄積以及抗氧化酶系生成減少和消耗增多。過(guò)多的ROS降低Mn-SOD活性，進(jìn)一步誘導(dǎo)毛細(xì)胞的凋亡壞死，導(dǎo)致外毛細(xì)胞出現(xiàn)片狀缺失，尤以底回外毛細(xì)胞損傷最早且最重，此與前人的研究一致。治療7天后，生理鹽水組較暴露即刻組Mn-SOD活性顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。并可見(jiàn)該組大鼠ABR閾值下調(diào)，但較暴露即刻組沒(méi)有恢復(fù)的趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），大鼠內(nèi)耳底回生理鹽水組外毛細(xì)胞核缺失明顯，且出現(xiàn)片狀缺失，較暴露即刻組損傷明顯嚴(yán)重。

EGb761（金納多）為銀杏葉提取物，其主要有效成分為銀杏黃酮苷(flavonoid-glycoside)、銀杏內(nèi)酯(ginkgolides)和白果內(nèi)酯(bilobalide)[16]。以往研究表明，EGB761具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[2]。其主要成分銀杏黃酮甙萜類(lèi)內(nèi)酯是有效的自由基清除劑，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的ROS，降低內(nèi)耳氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效的抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞膜[3-4]，從而保護(hù)內(nèi)外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)耳神經(jīng)細(xì)胞代償功能和代謝活性[17]，同時(shí)，其成分銀杏內(nèi)酯可拮抗血小板活化因子，抑制血小板的聚集[18]，可降低血管張力，降低血管壁通透性，增加組織血流量，預(yù)防內(nèi)耳微血栓的形成，顯著改善耳蝸內(nèi)血液循環(huán)以及前庭系統(tǒng)血供，減輕內(nèi)耳缺血、缺氧狀態(tài)，同時(shí)可減輕毛細(xì)血管通透性，改善內(nèi)耳組織水腫，并且可以提高內(nèi)耳組織細(xì)胞葡萄糖和氧氣的利用率，提高內(nèi)耳生存能力。本次實(shí)驗(yàn)顯示，腹腔注射7天后，EGB761組較生理鹽水Mn-SOD活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），可以表明，EGB761在增強(qiáng)Mn-SOD的活性方面效果顯著。該組大鼠ABR閾值下調(diào)較生理鹽水組明顯，閾移明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），免疫熒光顯示其底回外毛細(xì)胞缺失明顯輕于生理鹽水組，可見(jiàn)Mn-SOD活性的增強(qiáng)，有效清除了毛細(xì)胞內(nèi)外的ROS，減少氧化應(yīng)激對(duì)外毛細(xì)胞的損傷，從而提高了外毛細(xì)胞的存活率，使聽(tīng)力得以恢復(fù)，此與前人的研究結(jié)果一致。但其底回外毛細(xì)胞排列仍顯稀疏，散亂，可能EGB761給藥后仍需要更長(zhǎng)時(shí)間的恢復(fù)。EGB761作為治療耳聾耳鳴的藥物在臨床治療中已經(jīng)引起廣泛的共識(shí),應(yīng)用中未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng),其在內(nèi)耳氧化應(yīng)激反應(yīng)中明顯增強(qiáng)Mn-SOD活性，有效的提高了內(nèi)耳外毛細(xì)胞的存活率，對(duì)聽(tīng)力恢復(fù)作用效果顯著。

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Effects of EGB761 on Inner Ear Mn-SODActivity in Rats with Noise Induced Deafness

DONG Yingjie1,WU Wei1,2,WANG Gang2,HAN Haolun2,ZHANG Chi2,LIU Xu2,QU Changbei2,LIU Chang3
1 PLA 306th Hospital/Teaching Hospital of Peking University Health Science Center
2 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,PLA 306th Hospital
3 China Astronaut Training and Research Center
Corresponding author:WU WeiEmail:entwuwei@126.com

ObjectiveTo investigate effects of EGB761 on ABR threshold,hair cell nucleus staining and manganese superoxide dismutase(Mn-SOD)activity in the inner ear in rats with by impulse noise induced deafness.MethodsSD rats(n=80)were randomly divided into a blank control(n=20)and an experiment(n=60)group.Rats in the experiment group

impulse noise exposure(150 dB SPL,pulse width=30 ms,repetition rate=1/min,total=3),and were then randomly selected to be examined immediate,or to receive intraperitoneal injection of EGB761(Ginaton 4 ml/kg)or equivalent volume of saline,bid for 7 consecutive days before being examined.ResultsABR thresholds in the experiment group were significantly elevated following impulse noise exposure(P＜0.01),regardless of timing or treatment(P＞0.05).After 7 days,ABRs thresholds improved in both saline and EGB761 treated animals,but more so in those treated with EGB761 than in those treated with saline(P=0.02).Immunofluorescence showed normal arrangement of outer hair cells nuclei in rats without noise exposure.Immediately following noise exposure,punctate deletion of outer hair cell nuclei was noticed in the basal turn.On Day 7,significant lamellar deletion of outer hair cell nuclei was recorded in rats treated with saline,more severe than immediately following exposure and than in those treated with EGB761 whose loss of outer hair cells nuclei was sparse and scattered.Mn-SOD results showed no statistically significant difference between noise exposed and non-exposed animals immediately following exposure(P＞0.05);whereas on Day 7,inner ear Mn-SOD activity in rats treated with normal saline was significantly lower than immediately following exposure(P＜0.01)and then in EGB761 treated rats(P=0.01).ConclusionsEGB761 appears to mitigate auditory function decline,hair cell loss and oxidative stress reaction,and improve the prognosis in pulse noise induced deafness.

Noise Induced Hearing Loss;Auditory Brainstem Response;Mn-SOD;EG761 Supported by the Major project of 12 th Five-Year for PLA(AWS11J003) Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

R764

A

1672-2922（2017）05-555-6

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.011.

全軍“十二五”重大課題(AWS11J003)資助Supported by the Major project of 12 th Five-Year for PLA(AWS11J003)

董穎婕，研究生在讀，住院醫(yī)師，研究方向：航天耳科學(xué)及耳顯微外科

吳瑋，Email:entwuwei@126.com

2017-07-17審核人：翟所強(qiáng)）