岳換弟+秦雪梅+王夢亮

摘要：利用細胞壁降解酶（CWDEs）是鐮刀菌（Fusarium sp.）侵染寄主的主要手段之一，不同種類的鐮刀菌在致病過程中起主要作用的降解酶種類有所不同。以山西省黃芪（Astragalus L.）根腐病的優(yōu)勢病原菌銳頂鐮刀菌[F. acuminatum （Ellis et Everhart） Wr.]、腐皮鐮刀菌[F. solani （Mart） Sacc.]和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum Schlecht）為研究對象，對其活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的主要細胞壁降解酶（多聚半乳糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶、果膠甲基反式消除酶、內(nèi)切1，4-β-D葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）及其變化規(guī)律進行了比較。結(jié)果表明，3種根腐病菌均能產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶、果膠甲基反式消除酶、內(nèi)切1，4-β-D葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶6種CWDEs，但不同的致病菌產(chǎn)生各種酶的活性大小和變化趨勢具有明顯差異。該結(jié)果為深入研究CWDEs在根腐病菌侵染黃芪過程中的致病作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃芪根腐病菌；細胞壁降解酶；產(chǎn)生能力；致病作用

中圖分類號：S435.672.2+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）22-4328-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.030

Abstract： Producing cell wall degrading enzymes（CWDEs） is one of the main means of the Fusarium sp. infecting its host plants. Different kinds of Fasarium may have different CWDEs which are more active than other CWDEs in the infection process. In this paper， research was made into the main CWDEs produced by the dominant pathogens of Astragalus L. root rot in Shanxi province such as F. acuminatum （Ellis et Everhart） Wr.，F(xiàn). solani （Mart） Sacc.and F. oxysporum Schlecht and the rules of their changes. A series of CWDEs including polygalacturonase（PG），polymethylgalacturonase （PMG），polygalacturonic acid transeliminase （PGTE），pectin methyltranseliminase （PMTE），carboxymethyl cellulose （Cx），β-glucosidase （βG），were detected by the induction and culture in vitro. The results show that the 3 kinds of root rot pathogens all produced PG，PMG，PGTE，PMTE，Cx and βG，but significant differences existed in the activities and dynamic changes of each of the various enzymes produced by these pathogens. The above results laid the foundation for further study on the pathogenicity of CWDEs in the infection of root rot pathogens.

Key words： root rot pathogen of Astragalus； cell wall degrading enzyme； production capacity； pathogenicity

黃芪（Astragalus L.）為豆科（Leguminosae）多年生草本植物，以根入藥，性溫、味甘，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效，是藥用價值很高的中藥材。近年來黃芪根腐病在其主產(chǎn)地（甘肅省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西?。┚哑毡榘l(fā)生，該病害由多種病菌混合侵染造成，且不同產(chǎn)地優(yōu)勢致病菌常有變化[1]，鐮刀菌（Fusarium sp）是引起黃芪根腐病的優(yōu)勢致病菌屬。本課題研究發(fā)現(xiàn)，引起山西黃芪根腐病的優(yōu)勢病菌主要為銳頂鐮刀菌[F. acuminatum（Ellis et Everhart） Wr.]、腐皮鐮刀菌[F. solani（Mart） Sacc.]和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum Schlecht）。鐮刀菌寄主范圍廣、種類繁多、變異性強、易蔓延、發(fā)病率高，可侵染大多數(shù)植物并造成毀滅性后果，其生化致病機制也非常復(fù)雜，有多種毒素和細胞壁降解酶（CWDEs）參與[2]。其中CWDEs主要作用是降解寄主植物的細胞壁，從而利于病原菌的侵入、定殖與擴展[3]，是鐮刀菌侵入寄主、致病的主要幫兇之一。研究表明，鐮刀菌分泌的CWDEs主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、聚甲基半乳糖醛酸酶（Polymethylgalacturonase，PMG）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（Polygalacturonic acid transeliminase，PGTE）、果膠甲基反式消除酶（Pectin methyltranseliminase，PMTE）、果膠甲基脂酶（Pectin methylesterase，PME）、內(nèi)切1，4-β-D葡聚糖酶（Carboxymethyl cellulose，Cx）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，βG）等。CWDEs降解寄主細胞壁的程度常常與疾病的嚴重程度相關(guān)[4]。評價病原菌CWDEs在致病過程中的作用，主要依據(jù)病原菌在體外產(chǎn)生降解酶的能力和降解酶破壞植物組織結(jié)構(gòu)的能力[5]。不同鐮刀菌活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的CWDEs種類和活性均存在差異。如高增貴等[6]發(fā)現(xiàn)，玉米莖腐病菌（F. graminearum Schwabe）在活體外產(chǎn)生6種CWDEs，其活性從高到低依次為PG、PMG、Cx、PME、PGTE和PMTE；胡長志等[7]發(fā)現(xiàn)，蓮腐敗病菌[F. oxyporum Schl.f.sp.nelumbicola（Nis.&Wat.）Booth]在活體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的PG、PMG、Cx活性均明顯高于PGTE、PMTE。也有研究表明，病原菌的致病力可能與其活體外產(chǎn)生CWDEs的能力相關(guān)。如趙艷琴等[8]在誘導(dǎo)培養(yǎng)煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani Kiihn）產(chǎn)CWDEs的過程中，發(fā)現(xiàn)強致病力菌株產(chǎn)酶能力強于弱致病力菌株。由此可見，病原菌活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生CWDEs的研究可為明確其致病機理和CWDEs在侵染植物過程中的作用提供理論依據(jù)。目前，對于黃芪根腐病菌的生化致病機制研究還很薄弱，特別是相關(guān)病原菌產(chǎn)生的CWDEs在致病過程中的作用還未見報道。據(jù)此，試驗以山西省黃芪根腐病的優(yōu)勢病原菌F. acuminatum、F. solani、F. oxysporum為對象，對其活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的主要CWDEs（PG、PMG、PGTE、PMTE、Cx、βG）及其變化規(guī)律進行了探討，以期為明確CWDEs在根腐病菌混合侵染中的作用，進而探討其和黃芪的生化互作機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃芪根腐病菌F. acuminatum、 F. solani、 F. oxysporum由課題組在2013年從山西省渾源、五寨、應(yīng)縣等縣黃芪發(fā)病植株中分離純化鑒定而來。

1.2 根腐病菌CWDEs的活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和提取

1.2.1 根腐病菌的活化和培養(yǎng) 將F. oxysporum、 F. solani、F. acuminatum分別接入PDA平板，25 ℃下活化3-6 d后，用打孔器沿菌落邊緣各打取5個菌碟（直徑5 mm），分別接入100 mL PD培養(yǎng)液中，在25 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3-5 d后，濾除菌絲，用無菌水制備各病菌的孢子懸浮液，使其終濃度均為1.5×106～2.5×107 cfu/mL，備用。

1.2.2 CWDEs的誘導(dǎo)培養(yǎng)和提取 參照陳捷[9]的方法，采用改良的Marcus液體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)根腐病菌產(chǎn)生CWDEs的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將3種根腐病菌的孢子懸浮液分別取1 mL接種于裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，3次重復(fù)；25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3、5、7、9、11 d后取樣，8層紗布過濾去除菌絲；4 ℃、8 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜真空抽濾，除去菌絲和孢子，得粗酶液，4 ℃保存待用[9]。

1.3 CWDEs活力的測定

1.3.1 DNS比色法測定PG、PMG、Cx和βG的活性 ①果膠酶PG和PMG活性測定[10]。取標記為1、2號的2支試管，分別加入預(yù)先經(jīng)50 ℃水浴5 min的1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL 1%底物溶液（PG底物為多聚半乳糖醛酸，PMG底物為果膠），1號管加入1 mL粗酶液，50 ℃酶解1 h后，加2 mL DNS試劑，沸水中反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)；2號管加入1 mL粗酶液，直接加2 mL DNS試劑，沸水中反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)；分別在OD540 nm處測定1、2號試管中酶液活性。在設(shè)定的條件下，以每分鐘每毫克蛋白催化底物釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位（U/mg）。②纖維素酶Cx和βG活性測定[9]。Cx底物是羧甲基纖維素鈉，βG底物是水楊苷；且測定方法與果膠酶活性測定方法一致，但纖維素酶的酶解反應(yīng)時間為30 min，反應(yīng)完成后在OD540 nm處分別測定活性。在設(shè)定的條件下，以每分鐘每毫克蛋白催化底物釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位（U/mg）。

1.3.2 紫外分光光度法測定PGTE和PMTE活性 PGTE和PMTE活性測定[9]都取1.0 mL酶液加1.0 mL pH 9.0的0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液和 1 mL底物，PGTE底物為多聚半乳糖醛酸，PMTE底物為果膠，再加1.0 mL 3 mmol/L CaCl2，30 ℃水浴10 min，取1 mL在OD232 nm處測定反應(yīng)前后的酶液活性，酶活單位為30 ℃下每分鐘每毫克蛋白催化底物釋放1 mmol不飽和醛酸所需的酶量（U/mg）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007程序處理，并用其制圖；應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根腐病菌產(chǎn)PG和PMG能力的比較

不同根腐病菌產(chǎn)PG能力的情況見圖1。從圖1可以看出，在活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，3種根腐病菌均能產(chǎn)生PG，但各菌株產(chǎn)PG的能力、PG活性達峰值的時間和活性變化趨勢均存在明顯差異。F. oxysporum分泌的PG活性在第三天時為1.05 U/mg，此后隨之驟降，在第五天至第11天時降至低點并趨于穩(wěn)定；F. solani產(chǎn)生PG的能力較低，隨時間延長活性緩慢增加，第七天時達到高峰，但活性也僅為0.56 U/mg，隨后酶活逐漸降低；F. acuminatum產(chǎn)生的PG活性變化趨勢在第三天至第七天時同F(xiàn). solani基本一致，但第九天時活性驟增，達到1.56 U/mg，但第11天時又迅速下降。說明F. acuminatum產(chǎn)PG的能力明顯高于其他2種根腐病菌，但活性高峰出現(xiàn)于培養(yǎng)后期，滯后于F. solani和F.oxysporum；F. oxysporum產(chǎn)PG酶的能力較F. acuminatum低，但活性高峰出現(xiàn)較早；而F. solani產(chǎn)PG酶的能力最弱。

不同根腐病菌產(chǎn)PMG能力的情況見圖2。從圖2可見，3種根腐病菌產(chǎn)PMG的能力明顯不同，但活性變化規(guī)律基本一致，均在第三天時活性最高，F(xiàn). acuminatum為0.66 U/mg，F(xiàn). oxysporum為0.49 U/mg，而F. solani僅為0.18 U/mg。此后隨時間延長，F(xiàn). acuminatum和F. oxysporum產(chǎn)生的PMG活性開始明顯降低，其中，F(xiàn). acuminatum在第九天后趨于穩(wěn)定；F. oxysporum產(chǎn)生的PMG活性在第七天有微弱下降趨勢，并逐漸趨于穩(wěn)定；F. solani則由于初期酶活性比較低，在第五天微弱降低后，即達到酶活低谷，并保持平穩(wěn)。表明F. acuminatum產(chǎn)PMG酶的能力最強，F(xiàn). oxysporum次之，F(xiàn). solani最低，但3種根腐病菌的PMG活性高峰均在培養(yǎng)前期出現(xiàn)，后期逐漸降低。

2.2 不同根腐病菌產(chǎn)PGTE和PMTE能力的比較

不同根腐病菌產(chǎn)PGTE能力的情況見圖3，產(chǎn)PMTE能力的情況見圖4。從圖3、圖4可見，在活體外誘導(dǎo)分泌PGTE和PMTE的過程中，3種根腐病菌產(chǎn)PGTE和PMTE的能力也表現(xiàn)出了明顯不同。與PG和PMG產(chǎn)生情況不同，F(xiàn). solani產(chǎn)生的PGTE活性明顯高于其他2種根腐病菌，盡管在第三天到第五天時有一個小的降低變化，但隨后酶活性顯著升高，并在第九天達到高峰，為3.88×10-3 U/mg，此后雖開始降低，但也明顯高于其他2種根腐病菌在同期的酶活；F. oxysporum產(chǎn)生的PGTE活性在第五天時明顯升高，達1.53×10-3 U/mg，此后隨即降低并在第九天后趨于穩(wěn)定；F. acuminatum產(chǎn)生PGTE的情況和F. oxysporum不同，在前期無顯著變化，直至第九天才出現(xiàn)高峰，為1.55×10-3 U/mg，而后隨即降低。反映出F. solani產(chǎn)PGTE的能力明顯強于F. acuminatum和F. oxysporum，但其酶活高峰出現(xiàn)相對滯后，與F. acuminatum產(chǎn)PGTE的高峰期一致；F. oxysporum雖然產(chǎn)酶能力較弱，但酶活高峰期出現(xiàn)較早。

在PMTE方面，產(chǎn)PMTE能力最強的為F. acuminatum，其產(chǎn)生的PMTE活性在第五天時明顯低于F. oxysporum，但在第七天顯著增加，并達到酶活高峰，為10.10×10-2 U/mg，在第11天時才顯著降低；F. oxysporum產(chǎn)生的PMTE活性在第三天時為8.10×10-2 U/mg，此后隨時間的延長逐漸下降；F. solani產(chǎn)生的PMTE活性隨時間延長增加，在第五天達到高峰，為4.11×10-2 U/mg，第五天到第七天活性趨于穩(wěn)定后又隨之下降。表明F. oxysporum先于其他2種根腐病菌達到最高酶活，但F. acuminatum產(chǎn)PMTE酶的能力明顯強于其他2種根腐病菌。

2.3 不同根腐病菌產(chǎn)Cx和βG能力的比較

不同根腐病菌產(chǎn)Cx的能力和活性變化情況見圖5。從圖5可見，F(xiàn). oxysporum誘導(dǎo)分泌的Cx活性隨時間延長升高，第五天達 4.66×10-2 U/mg，隨后開始下降，但在第九天又出現(xiàn)第二次小高峰，為3.46×10-2 U/mg，然后再次下降；F. acuminatum產(chǎn)生的Cx活性則在第七天達到高峰，為4.27×10-2 U/mg，此后隨之下降；F. solani產(chǎn)Cx的能力最弱，在第三天到第七天 檢測不到活性，第九天才開始產(chǎn)生，并在此后顯著升高，第11天時酶活達1.94×10-2 U/mg。表明F. acuminatum和F. oxysporum產(chǎn)Cx的能力在培養(yǎng)前期明顯強于F. solani，酶活的高峰期也先于F. solani，但F. solani的產(chǎn)Cx能力在后期有逐漸增強的趨勢，也可能在時間進一步延長的情況下，達到更高的水平。

不同根腐病菌產(chǎn)βG的能力和活性變化情況見圖6。從圖6可見，3種根腐病菌活體外誘導(dǎo)分泌βG活性的變化規(guī)律基本一致，均隨著時間的延長逐漸升高。F. oxysporum誘導(dǎo)分泌的βG在第七天時活性顯著升高，第九天達到高峰，為2.54×10-2 U/mg，隨后略有下降；F. solani產(chǎn)生的βG活性則隨時間的延長一直呈緩慢上升的趨勢，第11天活性達2.85×10-2 U/mg；而F. acuminatum誘導(dǎo)分泌的βG活性在第三天即開始迅速升高，此后緩慢增加，在第11天活性達3.57×10-2 U/mg。表明F. acuminatum產(chǎn)βG的能力強于其他2種根腐病菌，且3者產(chǎn)βG的高峰均在培養(yǎng)后期。

3 小結(jié)與討論

病原菌致病因子的研究是明確其致病機制和尋求相應(yīng)植物抗病途徑的前提，大多數(shù)植物致病鐮刀菌都能分泌各種CWDEs，且不同鐮刀菌產(chǎn)生同一種CWDEs的能力和同一種菌產(chǎn)生不同CWDEs的活性均具有明顯差異。試驗結(jié)果表明，3種引起黃芪根腐病的致病鐮刀菌F. acuminatum、F. solani和F. oxysporum均能產(chǎn)生4種果膠酶（PG、PMG、PGTE、PMTE）以及2種纖維素酶（Cx、βG），這一結(jié)果與董章勇等[11]對香蕉枯萎病菌[F.oxysporum f.sp. cubense（E. F. Sm.）Snyd. & Hans.]的研究基本一致。同時，3種根腐病菌產(chǎn)生的PG和PMG活性明顯高于其他4種酶的結(jié)果，也與小麥穗腐病菌（F. culmorum（W.G. Smith）Sacc.]產(chǎn)生的果膠酶比纖維素酶和木聚糖酶分泌更早或活性更高的結(jié)果基本一致[4]。上述結(jié)果表明，PG和PMG作為3種根腐病菌產(chǎn)生的主要CWDEs，可能在致病過程中發(fā)揮了主要的作用。但是3種根腐病菌產(chǎn)生的果膠酶和纖維素酶活性存在一定的差異，且各酶達到最高活性水平的時間也不相同。F. oxysporum產(chǎn)生的CWDEs活性大小依次為PG、PMG、PMTE、Cx、βG、PGTE，其中PG、PMG和PMTE均在第三天達最高酶活；而PGTE和Cx在第五天達酶活高峰，βG活性變化滯后于其他5種酶，在第九天達酶活高峰。F. solani產(chǎn)生的CWDEs中，除βG活性高于Cx外，其他酶活性順序與F. oxysporum基本一致；但活性變化規(guī)律存在差異，除PMG外，其他酶的最高活性高峰出現(xiàn)時間均滯后于F. oxysporum。F. acuminatum產(chǎn)生的CWDEs中，除βG酶活性高于PMTE外，其他酶活性順序與F. oxysporum和F. solani基本一致，其中PMG和βG達最高酶活的時間與F. solani相同；但PG、PMTE和PGTE的酶活高峰出現(xiàn)滯后于F. oxysporum和F. solani，Cx的酶活高峰出現(xiàn)時間先于F. oxysporum但滯后于F. solani。由于鐮刀菌CWDEs活性高峰在不同菌株中出現(xiàn)的時間不同，可能會影響病菌侵入寄主的時間，同時也在一定程度上體現(xiàn)了不同鐮刀菌在侵染植物過程中的機制差異。本試驗中所用的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件一致，3種致病鐮刀菌產(chǎn)CWDEs的水平取決于菌株本身的生長特征和代謝狀況，說明各鐮刀菌在致病過程中所起的作用可能不同[12]。

果膠酶是降解植物初生壁層果膠物質(zhì)的重要酶類，PG主要水解細胞壁中多聚半乳糖醛酸，生成低聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸；而PMG主要水解高度酯化的果膠酸酯α-1，4糖苷鍵[9]。F. acuminatum產(chǎn)生PG、PMG的能力強于F. solani和F. oxysporum，說明其在降解果膠物質(zhì)、導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)解體、使植物根部組織軟化、腐爛[13]的過程中作用更為明顯。果膠裂解酶PGTE優(yōu)先裂解果膠酸分子中的α-1，4糖苷鍵，而PMTE主要降解細胞壁中的果膠或甲基酯化的多聚半乳糖醛酸，對未甲基化的多聚半乳糖醛酸不起作用[9]。F. acuminatum產(chǎn)生PMTE的能力明顯強于其他2種根腐病菌，也說明其具有更強的降解果膠或甲基酯化的多聚半乳糖醛酸的能力；但F. solani產(chǎn)PGTE的能力更突出，在裂解果膠酸分子中的α-1，4糖苷鍵時，顯示出了更大的優(yōu)勢。纖維素酶活性也影響鐮刀菌的致病力[14]，該酶主要降解植物細胞壁中的基質(zhì)多糖和纖維二糖，其中Cx主要把含葡萄糖基鏈的半纖維素基質(zhì)多糖分解為纖維二糖；βG則主要降解纖維二糖為葡萄糖。從這3種根腐病菌產(chǎn)Cx情況來看，F(xiàn). oxysporum和F. acuminatum降解半纖維素基質(zhì)多糖的能力明顯強于F. solani，但F. solani在培養(yǎng)后期產(chǎn)生的Cx活性驟增，也顯示出該菌可能在侵染后期才發(fā)揮降解寄主細胞壁纖維素的作用。另外，F(xiàn). acuminatum產(chǎn)生βG的能力也明顯強于F. solani和F. oxysporum?？偟膩砜?，在所測定的6種CWDEs中，F(xiàn). acuminatum產(chǎn)生4種CWDEs的能力強于其他2種菌，這與課題組后期在3種致病菌接種黃芪發(fā)病過程中，F(xiàn). acuminatum表現(xiàn)出致病力最強的結(jié)果（待發(fā)表）相一致。

病原菌產(chǎn)生CWDEs的機制非常復(fù)雜，不但受反應(yīng)底物的誘導(dǎo)，而且還與其上游一系列基因的表達量、調(diào)控序列及環(huán)境因子等因素有關(guān)，且由于活體外和活體內(nèi)的環(huán)境因素不同，同種病原菌在活體內(nèi)外產(chǎn)生的CWDEs種類和活性變化并不完全相同。如薛春生等[15]、齊鳳坤等[16]的研究均證明了這一點。由此可知，盡管試驗比較了3種黃芪根腐病優(yōu)勢致病鐮刀菌在活體外產(chǎn)CWDEs的情況，但并不能真正代表病原菌在活體內(nèi)的變化情況。

另外，根腐病菌侵染黃芪致病的生化過程是一個復(fù)雜的體系，致病鐮刀菌除產(chǎn)生CWDEs之外，還有毒素和激素等致病因子的存在，這些因子的共同作用才使病原菌侵入寄主植物從而致病；同時，病原菌侵染也會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、激活防御酶系統(tǒng)來抑制CWDEs，以達到抵御病原菌入侵的目的[17]。因此，盡管上述試驗為進一步研究根腐病菌與寄主互作的機制提供了依據(jù)，但要明確黃芪根腐病菌產(chǎn)生的CWDEs對病菌侵入、擴展的影響還有待于下一步深入探討。

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