范 露，姚遠(yuǎn)蓓

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205）

含氟低聚殼聚糖衍生物抑菌作用研究

范 露，姚遠(yuǎn)蓓

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205）

采用濾紙片法研究了6種不同結(jié)構(gòu)含氟低聚殼聚糖衍生物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、黑曲霉、青霉等7種菌的抑制作用。結(jié)果表明，不同含氟低聚殼聚糖衍生物對(duì)不同微生物的抑菌活性表現(xiàn)出不同程度的抑菌性。6種含氟低聚殼聚糖衍生物中，除了化合物5對(duì)黑曲霉沒有抑菌性，其他幾種化合物對(duì)7種受試菌株都有不同程度的抑菌性；化合物1對(duì)大腸桿菌抑制效果較好；化合物2和化合物3對(duì)7種微生物均有抑菌性，但抑菌效果較差；化合物4對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃花枯萎病原菌抑制效果較好；化合物5對(duì)大腸桿菌抑制效果較好；化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌抑制效果較好。

含氟低聚殼聚糖衍生物；濾紙片法；抑菌

0 引言

殼聚糖是由甲殼素脫乙酰化制備而成，由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖殘基通過1,4-β-糖苷鍵連接而成的高聚物[1]。殼聚糖是僅次于纖維素的第二大天然可再生聚合物，在醫(yī)療、食品、材料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[2]，尤其是在食品防腐保鮮方面使用較為廣泛[3]。殼聚糖與一般的抑菌劑相比，具有廣譜、抗菌活性高、滅菌率高等特性[4]。由于氟原子具有模擬效應(yīng)、電子效應(yīng)、阻礙效應(yīng)和滲透效應(yīng)等4種效應(yīng)，因此其可使化合物的生物活性倍增[5]。過去幾十年中含氟農(nóng)藥的數(shù)量增加了3倍多，表明氟在新農(nóng)藥發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。將氟引入殼聚糖中，合成含氟低聚殼聚糖衍生物，既可以改善殼聚糖的溶解性，又能提升其抑菌性能，提高應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、青霉，由學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供；水稻紋枯病原菌、核盤菌、黃花枯萎病原菌，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心提供。

蛋白胨，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司提供；牛肉浸膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供；瓊脂粉，武漢市華順生物技術(shù)有限公司提供；N,N-二甲基甲酰胺，廣州市度特化工有限公司提供。

化合物1：殼聚糖縮乙酰鄰氟苯甲氨基硫脲；化合物2：殼聚糖縮乙酰間氟苯甲氨基硫脲；化合物3：殼聚糖縮乙酰對(duì)氟苯甲氨基硫脲；化合物4：殼聚糖縮乙酰2,3-二氟苯甲氨基硫脲；化合物5：殼聚糖縮乙酰2,4-二氟苯甲氨基硫脲；化合物6：殼聚糖縮乙酰3,5-二氟苯甲氨基硫脲。上述6種含氟低聚殼聚糖衍生物由實(shí)驗(yàn)室合成，并經(jīng)紅外光譜和核磁共振光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2 儀器

MS104S型分析天平；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)；SPX-430型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品；BXM-50VE型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏 3 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 15～17 g，水 1 000 mL，pH值7.4） 培養(yǎng)細(xì)菌，以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然）培養(yǎng)真菌。1.3.2 細(xì)菌的活化和菌懸液的制備

準(zhǔn)備已滅菌的試管9支置于超凈工作臺(tái)上，待培養(yǎng)基的溫度降到50℃后，向試管中倒入適量培養(yǎng)基，待其凝固后，取其中7支用接種環(huán)在事先準(zhǔn)備好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、水稻紋枯病原菌、核盤菌、黃花枯萎病原菌、黑曲霉、青霉生長(zhǎng)的菌種中各挑取2～3環(huán)菌體，在試管培養(yǎng)基斜面上劃線，每種菌接種2個(gè)試管，2個(gè)試管作空白。細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)箱中，真菌置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。在600 nm處比色，OD值達(dá)到0.1即為菌體濃度為106～107個(gè) /mL 的菌懸液[7]。

1.3.3 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用濾紙片[8]法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。選用吸水性較好的濾紙，將做好的濾紙片放入培養(yǎng)皿中高溫滅菌，在無菌條件下風(fēng)干濾紙片，然后將濾紙片放入溶解了6種的含氟低聚殼聚糖衍生物的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，每種樣品試驗(yàn)5個(gè)溶度，1個(gè)空白。取出后在無菌條件下晾至不再滴出樣品溶液備用。將晾好的濾紙片以相等距離放在涂布菌液的培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿放6片，中間放置浸過空白濾紙片作對(duì)比，每個(gè)處理重復(fù)3次，最后將放置了濾紙片的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24 h，真菌在28℃下培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖縮乙酰鄰氟苯甲氨基硫脲對(duì)微生物的抑菌效果

殼聚糖縮乙酰鄰氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果見表1。

表1 殼聚糖縮乙酰鄰氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果

由表1可知，殼聚糖縮乙酰鄰氟苯甲氨基硫脲對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制質(zhì)量濃度分別是 7.81，250.00，62.50，250.00，62.50，125.00，250.00 mg/mL。

2.2 殼聚糖縮乙酰間氟苯甲氨基硫脲對(duì)微生物的抑菌效果

殼聚糖縮乙酰間氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果見表2。

表2 殼聚糖縮乙酰間氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果

由表2可知，殼聚糖縮乙酰間氟苯甲氨基硫脲對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制質(zhì)量濃度分別是125.00，250.00，125.00，125.00，250.00，250.00，250.00 mg/mL。

2.3 殼聚糖縮乙酰對(duì)氟苯甲氨基硫脲對(duì)微生物的抑菌效果

殼聚糖縮乙酰對(duì)氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果見表3。

由表3可知，殼聚糖縮乙酰對(duì)氟苯甲氨基硫脲對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制質(zhì)量濃度分別是 62.50，250.00，62.50，62.50，125.00，125.00，125.00 mg/mL。

2.4 殼聚糖縮乙酰2,3-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)微生物的抑菌效果

表3 殼聚糖縮乙酰對(duì)氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果

殼聚糖縮乙酰2,3-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果見表4。

表4 殼聚糖縮乙酰2,3-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果

由表4可知，殼聚糖縮乙酰2,3-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制質(zhì)量濃度分別是1.95，1.95，250.00，31.25，7.81，250.00，62.50 mg/mL。

2.5 殼聚糖縮乙酰2,4-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)微生物的抑菌效果

殼聚糖縮乙酰2,4-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果見表5。

表5 殼聚糖縮乙酰2,4-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果

由表5可知，殼聚糖縮乙酰2,4-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、青霉最小抑制質(zhì)量濃度分別是 7.81，62.50，15.62，250，62.50，250.00 mg/mL。前期初步抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明殼聚糖縮乙酰2,4-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)黑曲霉沒有抑菌性，故未測(cè)定其最小抑菌質(zhì)量濃度。

2.6 殼聚糖縮乙酰3,5-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)微生物的抑菌效果

殼聚糖縮乙酰3,5-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果見表6。

表6 殼聚糖縮乙酰3,5-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)7種微生物抑菌效果

由表6可知，殼聚糖縮乙酰3,5-二氟苯甲氨基硫脲對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、核盤菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制質(zhì)量濃度分別是250.00，1.95，250.00，7.81，1.95，62.50，62.50 mg/mL。

3 結(jié)論

含氟低聚殼聚糖衍生物對(duì)受試菌種最小抑菌質(zhì)量濃度見表7。

表7 含氟低聚殼聚糖衍生物對(duì)受試菌種最小抑菌質(zhì)量濃度/mg·mL-1

由表7可知，不同含氟低聚殼聚糖衍生物對(duì)不同微生物的抑菌活性表現(xiàn)出不同程度的抑菌性。6種含氟低聚殼聚糖衍生物中，除了化合物5對(duì)黑曲霉沒有抑菌性，其他幾種化合物對(duì)7種受試菌株都有不同程度的抑菌性?；衔?對(duì)大腸桿菌抑制效果較好；化合物2和化合物3對(duì)7種微生物均有抑菌性，但抑菌效果較差；化合物4對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃花枯萎病原菌抑制效果較好；化合物5對(duì)大腸桿菌抑制效果較好；化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌、水稻紋枯病原菌、黃花枯萎病原菌抑制效果較好。

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Study on the Antibacterial Activity of Fluorine Oligochitosan Derivatives

FAN Lu，YAO Yuanbei
（College of Food&Biology Science and Technology，Wuhan Institute of Design and Sciences，Wuhan，Hubei 430205，China）

The antibacterial effects of six different structures of fluorine oligochitosan derivatives on Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Sclerotinia sclerotiorum，Rhizoctonia cerealis，Rhizoctonia solani，Aspergillus niger and Penicillium were studied by filter paper method.The results showed that the antifungal activity of different fluorine oligochitosan derivatives showed different degrees of antimicrobial activity against different microorganisms.Among the six kinds of fluorine oligochitosan derivatives，except the compound 5 had no bacteriostasis against Aspergillus niger，several other compounds had different antibacterial properties against the seven tested strains.Compound 2 had better inhibitory effect on Escherichia coli：Compounds 2 and 3 had bacteriostatic effect on 7 kinds of microorganisms，but the antibacterial effect was poor.Compound 4 had better inhibitory effect on Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Rhizoctonia solani；Compound 5 had better inhibitory effect on Escherichia coli.Compound 6 had better effect on Staphylococcus aureus，Rhizoctonia cerealis and Rhizoctonia solani.

fluorine oligochitosan derivatives；filter paper method；antibacterial effect

TS202.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.027

1671-9646（2017） 11b-0001-03

2017-09-18

2014年湖北省教育廳科研項(xiàng)目“含氟低聚殼聚糖衍生物的制備及其生物活力研究”（B2014265）。

范 露（1982— ），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。