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(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所；3.張家界市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

·臨床醫(yī)學(xué)·

循環(huán)miR-4731-3p在肺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床意義

呂秀1,2，雷明盛3，賈鳳玲2，李賽1，張楚紅1，胡甜1，賀莎1，嚴(yán)漢興1，胡云2，陳榮如1，譚貽兮1，文美玲1*，左建宏1,2*

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所；3.張家界市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

目的探討microRNA-4731-3p(miR-4731-3p)在肺癌血漿中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)40例肺癌患者和40例健康人(作為對(duì)照)血漿miR-4731-3p的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。繪制受試者工作特征曲線(ROC)，評(píng)價(jià)血漿miR-4731-3p表達(dá)水平對(duì)原發(fā)性肺癌的診斷價(jià)值。結(jié)果肺癌血漿中miR-4731-3p的表達(dá)水平(0.11±0.05)顯著高于健康人(0.05±0.03)(P<0.001)；miR-4731-3p表達(dá)水平與癌胚抗原(CEA)正相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。血漿miR-4731-3p在ROC曲線下面積(AUC)為0.835(95% CI =0.750～0.921)。當(dāng)miR-4731-3p臨界值取0.048時(shí)，對(duì)肺癌診斷的靈敏度為0.950，特異度為0.575。Kaplan-Meier分析顯示肺癌血漿中miR-4731-3p低表達(dá)者生存時(shí)間明顯高于高表達(dá)組(P<0.05)。結(jié)論血漿miR-4731-3p在肺癌血漿中表達(dá)上調(diào)，可作為肺癌診斷及預(yù)后判斷的潛在分子標(biāo)志物。`

肺癌； 微小RNA-4731-3p； 診斷； 預(yù)后

肺癌是世界上腫瘤致死的主要原因之一，全球每年死亡人數(shù)超過(guò)150萬(wàn)[1]。由于缺乏早期的診斷方法，大多數(shù)肺癌被診斷時(shí)已是晚期，這是肺癌高死亡率的主要原因。盡管近年來(lái)針對(duì)肺癌的手術(shù)、 放化療、 分子靶向治療及生物治療等綜合治療取得了較大的進(jìn)步，但肺癌的5年生存率仍低于15%[2]。因此，尋求一種為肺癌早期診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物是目前亟待解決的問(wèn)題。而微小RNAs( microRNAs，miRNAs)的出現(xiàn)為準(zhǔn)確早期診斷肺癌開辟了新的思路。

MiRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一大類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子 RNAs，長(zhǎng)度約20 ～25 nt。在動(dòng)物尤其是人體中，絕大多數(shù)miRNAs與靶 mRNAs 的 3′端非翻譯區(qū)( 3′UTR) 通過(guò)部分互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合以抑制靶 mRNAs 翻譯成蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)胞、組織或個(gè)體水平上影響生物體的生長(zhǎng)發(fā)育，并參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病過(guò)程[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，血清/血漿中有大量穩(wěn)定存在的miRNA，并且可作為肺癌的診斷標(biāo)記物。Chen等報(bào)道使用10種血清miRNA聯(lián)合診斷NSCLC的敏感度和特異度分別達(dá)到93%和90%[4]。另外Wei等報(bào)道血漿miRNA-21可以作為NSCLC的診斷標(biāo)記物，并且還發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-21的表達(dá)水平與肺癌的TNM分期相關(guān)，在T3-T4患者血漿中miRNA-21的表達(dá)水平高于T1-T2患者，III期-IV期患者的表達(dá)水平高于I期-II期患者的表達(dá)水平。使用血漿miRNA-21診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為76.2%和70%。此外，還發(fā)現(xiàn)在使用以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療患者中，達(dá)到部分緩解的患者血漿中miRNA-21的表達(dá)水平明顯低于達(dá)到穩(wěn)定和進(jìn)展患者的表達(dá)水平[5]。MiRNAs 作為一類新的分子靶標(biāo)，有多項(xiàng)研究證實(shí)其與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可能在肺癌的診斷、治療及預(yù)后中發(fā)揮重要作用[6-7]。本項(xiàng)研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (Quantificational Reverse Transciptase PCR，qRT-PCR) 方法檢測(cè)肺癌患者及正常健康人血漿中 miR-4731-3P 的表達(dá)差異，分析其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，探討其對(duì)肺癌早期診斷及預(yù)后的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2013年12月至2015年12月入住南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院的新入院未經(jīng)治療的肺癌患者的血漿標(biāo)本40例，均為病理學(xué)明確診斷為肺癌，其中男32例，女8例；年齡45～79歲，平均年齡(62.30±8.95)歲；按 WHO 2004年版肺癌病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，組織病理類型為腺癌 15 例、 鱗癌 25 例。根據(jù)2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期[8-9]，Ⅰ期1例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期20例；吸煙18例，不吸煙22例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例，非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例。40例正常對(duì)照組，其中男例27，女例13，平均年齡(57.85±11.48)歲，兩組年齡和性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2主要試劑總RNA提取試劑：miRNeasy Serum/Plasma Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑：miScript II RT Kit 、定量PCR試劑：miScript SYBR Green PCR Kit 、miR-4731-3p引物、內(nèi)參miR-39購(gòu)于德國(guó)QIAGENE公司。

1.3方法

1.3.1 RNA的提取 總的RNA從200ul的血漿中提取，提取方法按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說(shuō)明書操作。提取后的樣本用于cDNA的合成。樣本存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 cDNA的合成 使用miScript II RT Kit試劑盒。每20ul逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為一個(gè)反應(yīng)體系，包括 RNA 3μL，5x miScript HiSpec Buffer 4μL，10x miScript Nucleics Mix 2μL，RNase-free water 9μL 和miScript Reverse Transcriptase Mix 2ul。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min；95 ℃保溫 5min；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MiR-4731-3p的檢查 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)體系如下：2x QuantiTect?SYBR Green PCR Master Mix 5μL，miR-39 miScript Primer Assay 或 miR-4731-3p miScript Primer Assay 1μL，RNase-free water 1μL，cDNA 2μL，總體積10μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 15 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，然后70 ℃ 延伸30 s。每個(gè)標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔，取均值。在55～95 ℃繪制溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算得出每個(gè)反應(yīng)管循環(huán)閾值( Ct)。以miR-39作為內(nèi)參，△CT=目的基因CT-內(nèi)參CT；△△CT=待測(cè)樣品中目的基因△CT -參照樣品中目的基因△CT；按2-△△CT值進(jìn)行目的基因相對(duì)定量。

2 結(jié) 果

2.1 MiR-4731-3p在肺癌血漿中的表達(dá)40例肺癌血漿中miR-4731-3p的相當(dāng)于內(nèi)參的表達(dá)量為(0.11 ± 0.05)，正常人血漿中miR-4731-3p的相當(dāng)于內(nèi)參的表達(dá)量為(0.05 ± 0.03)，肺癌血漿中miR-4731-3p表達(dá)水平明顯高于正常人 (P<0.001)。見圖1。

圖1 MiR-4731-3p在肺癌患者及健康對(duì)照組血漿中的表達(dá)Control:正常健康人

2.2 MiR-4731-3p基因與臨床因素之間關(guān)系根據(jù)miR-4731-3p在肺癌患者中的表達(dá)差異，miR-4731-3p與癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)明顯相關(guān)(P<0.05)。與患者性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性 (P>0.05)。具體見表 1。

2.3血漿miR-4731-3p表達(dá)水平對(duì)原發(fā)性肺癌的診斷價(jià)值ROC曲線見圖2。ROC曲線下面積(Area Under the ROC Curve，AUC)為0.835(95% CI=0.750～0.921)， 最佳截點(diǎn)為0.048，診斷靈敏度和特異度分別為0.950和0.575。

2.4 MiR-4731-3p與肺癌患者的預(yù)后關(guān)系在40例肺癌患者的隨訪中，失訪1例，按照miR-4731-3p平均表達(dá)水平(0.11 ± 0.05)，分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。Kaplan-Meier 分析顯示miR-4731-3p低表達(dá)組和高表達(dá)組生存時(shí)間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

表1 MiR-4731-3p表達(dá)水平與肺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

圖2 ROC曲線

圖3 MiR-4731-3p與肺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討 論

miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約 21-25 核苷酸的小型非編碼 RNA，可與靶mRNA的3′ 非翻譯區(qū)( 3′ untranslated region，3′ UTR) 結(jié)合，促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)翻譯抑制而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用[10]。MicroRNA參與了幾乎生命所有過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、血管生成等[11-13]。同時(shí)microRNA作為癌基因或抑癌基因調(diào)控與腫瘤增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等相關(guān)的多種靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14-15]。通過(guò)檢測(cè)外周血或組織中的 microRNA 的表達(dá)水平可對(duì)肺癌的早期診斷、治療反應(yīng)預(yù)測(cè)和預(yù)后判斷等提供重要依據(jù)。

近幾年來(lái)，關(guān)于循環(huán)miRNAs的研究越來(lái)越多，但目前尚未有miR-4731-3p與肺癌的相關(guān)性報(bào)道。本研究證實(shí)肺癌組miR-4731-3p表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組。同時(shí)我們進(jìn)一步對(duì)肺癌患者臨床病理參數(shù)和生存期分析發(fā)現(xiàn)，miR-4731-3p表達(dá)水平與癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)明顯相關(guān)，與腫瘤的總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。由此提示miR-4731-3p可作為肺癌預(yù)后判斷的一個(gè)新的標(biāo)志物，而關(guān)于miR-4731-3p的診斷效能， miR-4731-3p相對(duì)表達(dá)量ROC曲線下面積為0.835，靈敏度為95.0%，特異度為57.5%。其中靈敏度高，有利于肺癌的早期篩查。但特異度低，這符合肺癌的檢查手段的現(xiàn)狀，可能需要聯(lián)合其他檢查方法來(lái)進(jìn)一步提高肺癌的診斷。

綜上所述，本研究通過(guò)檢測(cè)肺癌血漿中miR-4731-3p的表達(dá)水平及其與肺癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血漿miR-4731-3p是一種非常有前景的肺癌診斷及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。然而，miR-4731-3p在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制及相關(guān)性還需深入研究。本實(shí)驗(yàn)僅僅在血漿水平上驗(yàn)證了兩者的相關(guān)性，而對(duì)于肺癌血漿中miR-4731-3p的生物學(xué)功能及其與預(yù)后之間的關(guān)系，以及miR-4731-3p參與肺癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制仍需要更大樣本和多中心臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究。

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ExpressionandclinicalsignificanceofmiR-4731-3pinplasmaofpatientswithlungcancer

LV Xiu,LEI Mingshen,JIA Fengling,et al

(TheAffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-4731-3p (miR-4731-3p) in the plasma of patients with lung cancer and to determine the correlation between miR-4731-3p level and clinical parameters.MethodsQuantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to examine the plasma level of miR-4731-3p in 40 patients with lung cancer and 40 healthy persons (control).The correlation between the plasma miR-4731-3p level and clinicopathological features and prognosis were investigated.Receiver operating characteristic (ROC) curve were drawn to evaluate the diagnosis value of miR-4731-3p expression in plasma for lung cancer.ResultsThe plasma miR-4731-3p was significantly up-regulated in patients with lung cancer as compared with healthy subjects.The expression of miR-4731-3p was associated with carcino-embryonic antigen (CEA) (P<0.05),while it was not associated with gender,age,smoking,pathology type,tumor size,clinical stage and distant metastasis (P>0.05).The area under the ROC curve (AUC) according to the miR-4731-3p expression in plasma was 0.835(95% CI =0.750～0.921),when the critical value was 0.048.The sensitivity for lung cancer diagnosis and specific degrees were 0.950 and 0.575 respectively.The expression of miR-4731-3p was correlated with overall survival of lung cancer (P<0.05).ConclusionThe expression of miR-4731-3p is up-regulated in tumor,and it may be a potential biomarker for the diagnosis and prognosis evaluation of lung cancer.

lung cancer; MiR-4731-3p; diagnosis; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.010

2016-10-25；

2016-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272960)，湖南省科技廳項(xiàng)目(2013WK2010)，人社部重點(diǎn)項(xiàng)目[2016]176號(hào)，省衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目[B2014-171]，張家界市科技局項(xiàng)目[2015GK1128].

*通訊作者，E-Mail:1115910801 @ qq.com；E-Mail:632138414@qq.com.

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秦旭平)