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(1.卡尤迪生物科技有限公司，北京，100081；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所)

·技術(shù)與方法·

一步法人類CYP2C19基因分型檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用及其意義

李響1，劉寧1，肖樂東2，張偉3，李清3，李智3，楊坤1，譚志榮3*

(1.卡尤迪生物科技有限公司，北京，100081；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所)

目的探索一步實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CYP2C19基因分型的方法。方法采用人類CYP2C19基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)對(duì)全血或人基因組進(jìn)行一步法實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，同時(shí)采用焦磷酸測(cè)序和試劑盒進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果一步法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。重復(fù)性檢測(cè)顯示，該法對(duì)各個(gè)基因型Ct值進(jìn)行變異系數(shù)(CV值)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CV值均小于5%，對(duì)已知基因型的濃度的檢測(cè)范圍為0.2～125 ng，對(duì)雜合突變型基因組DNA(1 ng)和血液樣本(十倍稀釋)進(jìn)行7次檢測(cè)，變異系數(shù)(CV值)均小于5%，對(duì)特異性樣品、EDTA抗凝樣本、枸櫞酸鈉抗凝樣本、乳糜血樣本、血紅素污染樣本的基因型都有較好的檢測(cè)效果。結(jié)論一步法檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高，檢測(cè)范圍寬，重復(fù)性、特異性和靈敏度均能達(dá)到人基因組DNA樣本的檢測(cè)的水平，滿足臨床對(duì)人CYP2C19基因分型檢測(cè)的目的。

CYP2C19基因分型； 氯吡格雷； 一步法實(shí)時(shí)熒光PCR； 個(gè)體化用藥

近年來隨著人類基因組學(xué)(genomics)的發(fā)展，藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來越多的藥物基因組生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法相繼涌現(xiàn)。藥物基因組學(xué)已成為指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥、評(píng)估嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評(píng)價(jià)新藥的重要工具，藥物反應(yīng)相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的分子檢測(cè)是實(shí)施個(gè)體化藥物治療(individualized treatment)的前提。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)都已批準(zhǔn)了一系列的個(gè)體化用藥基因診斷試劑盒。

氯吡格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)、缺血性腦血栓(acute ischemic stroke,AIS)、閉塞性脈管炎(thromboangitisobliterans,TAO)和動(dòng)脈硬化及血栓栓塞引起的并發(fā)癥。心臟支架手術(shù)后的患者需長(zhǎng)期服用氯吡格雷以防止支架內(nèi)再梗[1-2]。氯吡格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應(yīng)[3-4]。2010年3月，美國(guó)(FDA)宣布氯吡格雷抵抗的“黑框警告”，提醒應(yīng)用氯吡格雷后出現(xiàn)心血管不良事件與CYP2C19功能缺失的等位基因有關(guān)。CYP2C19遺傳變異可導(dǎo)致酶活性的個(gè)體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者(ultrarapid metabolizer，UM)、快代謝者(extensive metabolizer，EM)、中間代謝者(intermediate metabolizer，IM)和慢代謝者(poor metabolizer，PM)4種表型。CYP2C19*2(rs4 244_285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4_986 893，c.636G>A)是中國(guó)人群中存在的2種導(dǎo)致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。美國(guó)FDA和美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)建議，對(duì)于CYP2C19慢代謝基因型患者需考慮改變治療方案[5]。

用于個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的方法包括PCR-直接測(cè)序法、PCR-焦磷酸測(cè)序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法、原位雜交(ISH)等多種方法。其中，實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便快捷，所用儀器容易普及。目前CFDA已批準(zhǔn)CYP2C9、VKORC1等多種基因多態(tài)性檢測(cè)的PCR-熒光檢測(cè)試劑盒。已獲批的試劑盒大多采用全血基因組核酸提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)的方法。本文采用一步法實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，對(duì)全血樣本免核酸提取，直接進(jìn)行CYP2C19基因分型檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行了同類試劑盒的對(duì)比驗(yàn)證以及分析性能的驗(yàn)證，為臨床實(shí)現(xiàn)快速便捷的床邊檢測(cè)提供了新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1檢測(cè)對(duì)象61例未知基因型的臨床全血樣本(EDTA或枸櫞酸鈉抗凝)，受試者選擇標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲；(2)男女不限；(3)心腦血管以及外周動(dòng)脈疾病患者；(4)無研究者認(rèn)為的不宜參加本試驗(yàn)的其他情況。

1.2方法

1.2.1 檢測(cè)方法 采用人類CYP2C19基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)[卡尤迪生物科技(北京)有限公司]，取49.8 μL PCR反應(yīng)液分裝到0.2 μL PCR管，然后加入0.2 μL待測(cè)樣本(全血或人基因組)，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Mini8 Plus)[卡尤迪生物科技(北京)有限公司]進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 對(duì)照方法 焦磷酸法測(cè)序(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)及已獲cFDA批準(zhǔn)的人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)。取臨床全血樣本(約200 μL)進(jìn)行人基因組提取，然后進(jìn)行濃度測(cè)定，調(diào)整核酸濃度至說明書要求的范圍內(nèi)，取20 ng基因組DNA進(jìn)行焦磷酸測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。全部檢測(cè)時(shí)間約4～5 h。

1.3性能分析

1.3.1 準(zhǔn)確性分析 對(duì)54例未知基因型的臨床樣品同時(shí)進(jìn)行一步法檢測(cè)，以及焦磷酸測(cè)序(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)和已獲cFDA批準(zhǔn)的人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)的檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確性分析。

1.3.2 重復(fù)性分析 對(duì)三個(gè)已知基因型(分別為野生型、雜合突變型及純合突變型)的血液樣本，一例雜合突變型的基因組DNA樣本分別進(jìn)行5次重復(fù)性檢測(cè)，對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行CV值的統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 檢測(cè)范圍分析 對(duì)一個(gè)雜合突變型的基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為125、25、5、1、0.2 ng，分別進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.4 靈敏度分析 對(duì)雜合突變型基因組DNA(1 ng)和血液樣本(十倍稀釋)，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行7次檢測(cè)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5 特異性分析 對(duì)三個(gè)已知基因型(分別為野生型、雜合突變型及純合突變型)的基因組DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.6 抗干擾性分析 對(duì)4個(gè)未知基因型的血液樣本，分別為EDTA抗凝樣本，枸櫞酸鈉抗凝樣本，乳糜血樣本，血紅素污染樣本，進(jìn)行一步法檢測(cè)及對(duì)比方法的檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

準(zhǔn)確性分析結(jié)果顯示，三種方法的檢測(cè)結(jié)果完全符合，包含了CYP2C19*2/*3的三種基因型，一步法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。重復(fù)性分析結(jié)果見表1，CV值均小于5%。對(duì)已知基因型的不同濃度的檢測(cè)范圍參考品(*2/*3均為GA基因型)進(jìn)行檢測(cè)后，從0.2～125 ng每個(gè)濃度的樣品都能被正確的檢測(cè)出來(表2)。雜合突變型基因組DNA檢測(cè)其CYP2C19*2的G/A基因型的CV值分別為4.06%/4.04%，CYP2C19*3的G/A基因型的CV值分別為0.33%/0.33%。血液樣本CYP2C19*2的G/A基因型的CV值分別為2.46%/2.48%，CYP2C19*3的G/A基因型的CV值分別為3.56%/3.51%。CV值均小于5%。對(duì)特異性樣品進(jìn)行檢測(cè)后，每個(gè)樣品的基因型都能被正確的檢測(cè)出來。對(duì)EDTA抗凝樣本，枸櫞酸鈉抗凝樣本，乳糜血樣本，血紅素污染樣本進(jìn)行檢測(cè)后，每個(gè)樣品的基因型都能被正確的檢測(cè)出來，且與對(duì)照試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。但對(duì)于血紅素污染參考品，其CT值超過43，視為檢測(cè)失敗。故初步認(rèn)為本試劑盒不適用于發(fā)生嚴(yán)重溶血的血紅素污染樣本。由于樣本量小，還需進(jìn)一步增加血紅素污染樣本檢測(cè)數(shù)量，來判斷本方法是否適用于溶血樣本。

表1 一步法檢測(cè)重復(fù)性分析

表2 不同濃度CYP2C19*2和CYP2C19*3檢測(cè)的Ct值

3 討 論

本文發(fā)現(xiàn)，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)臨床全血樣本直接進(jìn)行人CYP2C19*2/*3基因分型一步法檢測(cè)準(zhǔn)確性高，檢測(cè)范圍寬，重復(fù)性、特異性和靈敏度均能達(dá)到人基因組DNA樣本的檢測(cè)的水平，滿足臨床對(duì)人CYP2C19基因分型檢測(cè)的目的。與對(duì)比試劑盒相比，一步法檢測(cè)免除了核酸提取，一方面縮短了臨床樣本的檢測(cè)時(shí)間，減少檢測(cè)成本，有利于檢測(cè)報(bào)告的及時(shí)快速的發(fā)出，另一方面減少了臨床檢驗(yàn)人員的操作步驟，避免了操作誤差和污染的引入，方便臨床應(yīng)用的推廣，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。一步法檢測(cè)所需樣本量少(僅需0.2 μL血液)，靜脈血及指尖血均可以滿足檢測(cè)的需要，患者接受度高，臨床檢驗(yàn)人員操作方便。綜上所述一步法個(gè)體化用藥分子診斷因?yàn)楹臅r(shí)短，且操作簡(jiǎn)單，免去了對(duì)人員過高經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)的要求，因此可以應(yīng)用于在醫(yī)院科室的床旁檢測(cè)(POCT)。該方案的可靠性和有效性已經(jīng)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。參照本文的操作和質(zhì)控規(guī)范，即可較好地保證一步法檢測(cè)在床旁檢測(cè)方面的順利開展。

Mega等[6]研究結(jié)果顯示，至少攜帶1個(gè)CYP2C19功能缺失型等位基因的受試者(CYP2C19*2或*3攜帶者)，導(dǎo)致氯吡格雷藥物活性代謝物水平降低，容易出現(xiàn)氯吡格雷抵抗，PCI術(shù)后支架內(nèi)血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增高。對(duì)于PCI高?；颊?，CYP2C19基因檢測(cè)是有必要的。對(duì)于“氯吡格雷抵抗”臨床上可采用增加劑量或同類藥物替代或聯(lián)合用藥的治療策略[7-8]。因此，通過對(duì)CYP2C19基因檢測(cè)基礎(chǔ)上指導(dǎo)PCI術(shù)后氯吡格雷抗血小板治療是減少血栓形成事件發(fā)生的有效途徑之一，特別對(duì)冠心病高危人群具有特殊意義[9]。

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[9] Zhang HZ,Kim MH,Guo LZ,et al.CYP2C19 but not CYP2B6,CYP3A4,CYP3A5,ABCB1,PON1 or P2Y12 genetic polymorphism impacts antiplatelet response after clopidogrel inKoreans [J].Blood Coagul Fibrinolysis,2017,28(1):56-61.

Clinicalapplicationandsignificanceofone-stephumanCYP2C19genotypedetection

LI Xiang，LIU Ning，XIAO Ledong，et al

(CoyoteBioscienceCo,Ltd,Peking,Beijing100081,China)

ObjectiveTo verify the analysis capabilities of one-step real-time PCR method in the directly detect CYP2C19 gene classification.MethodsUsing one-step real-time fluorescent PCR detection with human CYP2C19 genotyping kit (Coyotebio) to detect whole blood or genome,and compared with the pyrosequencing method and other qPCR kit.

ResultsAccuracy of one-step real-time PCR is 100%.The coefficient of variation (CV) of repeatability for all genotypesare was less than 5%.To detect known genes of different concentration,each sample can be detected correctly.Genomic DNA of hybrid mutation type (1 ng) and blood samples (10 times dilution),7 times repeating detection,the coefficient of variation (CV) of sensitivity are less than 5%.For EDTA anticoagulant samples,the samples of sodium citrate anticoagulation,chyle blood samples,heme pollution samples,each sample genotypes can be correctly detected.ConclusionOne-step detection method is of high accuracy and wide detection range,repeatability,sensitivity and specificity all can reach the level of genome DNA test samples.So one-step detection method could meet the clinical CYP2C19 gene classification testing purpose.

CYP2C19 genotyping; clopidogrel; One-step real-time fluorescent PCR; personalized medicine

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.024

2016-11-05；

2017-05-01

長(zhǎng)沙市科技局一般平臺(tái)項(xiàng)目(K1403075-61)；中南大學(xué)研究生創(chuàng)新課題(2016zzts522)；湖南省科技廳省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2016JC2063).

*通訊作者，E-mail:tanzr@163.com.

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蔣湘蓮)