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(廣東省中山市博愛醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東中山 528400)

·臨床醫(yī)學·

PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌表達的臨床病理意義及分子機制研究

黃麗斯，梁雪瑩，金海英，胡銀笑，譚玲玲，甘玉杰*

(廣東省中山市博愛醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東中山 528400)

目的探討前列腺腫瘤過表達基因1(PTOV1)在I型子宮內(nèi)膜癌組織中檢測的意義及表達調控的分子機制。方法收集本院住院治療的46例I型子宮內(nèi)膜癌患者手術切除腫瘤組織及癌旁組織，免疫組化法檢測組織中PTOV1蛋白的表達，比較瘤組織與癌旁組織的差異，亞硫酸氫鹽測序法檢測PTOV1啟動子甲基化狀態(tài)，比較瘤組織與癌旁組織的差異，統(tǒng)計分析PTOV1蛋白表達與I型子宮內(nèi)膜癌患者臨床參數(shù)的關系，PTOV1啟動子甲基化與蛋白表達的關系及其與患者臨床參數(shù)的關系。結果PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織中高表達且啟動子低甲基化；PTOV1高表達與I型子宮內(nèi)膜癌患者年齡、腫瘤大小、組織分化程度、淋巴結轉移無關，與浸潤深度呈正相關；PTOV1啟動子低甲基化與I型子宮內(nèi)膜癌組織中PTOV1表達呈正相關。結論PTOV1與I型子宮內(nèi)膜癌浸潤密切相關，其高表達的機制可能為啟動子發(fā)生低甲基化。

前列腺腫瘤過表達基因1； I型子宮內(nèi)膜癌； 低甲基化； 浸潤

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性惡性腫瘤，致病因素包括：遺傳變異、表觀遺傳改變、環(huán)境因素及內(nèi)分泌因素。該病的5年生存率可高達85%，但是有轉移的患者預后很差，中位生存時間大約為1年，并且在過去的10年中未見提高。子宮內(nèi)膜癌分為雌激素依賴型(I型)和非雌激素依賴型(II型)，I型子宮內(nèi)膜癌絕大部分為子宮內(nèi)膜樣癌，少部分為黏液腺癌；II型子宮內(nèi)膜癌為漿液性癌，透明細胞癌等。約80%～85%的患者為I型，常分化較好，預后較好。而II型預后差，生存時間短[1]。

前列腺腫瘤過表達蛋白1(prostate tumor overexpressed 1，PTOV1)是一個保守的銜接蛋白(adaptorprotein)，首次發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中高表達而得名，與脂伐蛋白(lipid raft protein)flotillin-1相互作用，以細胞周期依賴的方式將flotllin-1從胞漿轉運至胞核中[2]。PTOV1的過表達與腫瘤級別的增高、細胞增殖密切相關，如：乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌等[3]。有研究表明，PTOV1在前列腺癌中高表達的一個機制是基因擴增[4]。但是，其在子宮內(nèi)膜癌中的表達、功能及調控機制暫不明確。

表觀遺傳調控機制包括：DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA。DNA甲基化是表觀遺傳調控中研究最多的一個機制。DNA甲基化在人體中由DNA甲基轉移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B調控，將甲基轉移到胞嘧啶的5位碳原子上?；騿幼訁^(qū)的CpG島發(fā)生甲基化可導致基因表達沉默，而發(fā)生低甲基化則基因表達增加[5]。DNA甲基化改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制，也是診斷、預后判定及治療腫瘤的潛在生物學標志物[1]。

因此，本研究擬通過檢測PTOV1的表達及啟動子甲基化狀態(tài)，確定PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織中的表達情況、臨床意義及初步探討可能的表達調控機制，從而為PTOV1作為I型子宮內(nèi)膜癌治療靶點提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象收集2013年6月～2015年7月廣東省博愛醫(yī)院入院治療的46例I型子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織及癌旁組織。入組條件：采集樣本時患者未進行任何治療；手術切除標本制成石蠟切片，經(jīng)2名病理科醫(yī)生診斷為I型子宮內(nèi)膜癌；免疫組化檢測結果為雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達陽性；無其他免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病或長期服用激素史。診斷標準：病理診斷為子宮內(nèi)膜樣腺癌，免疫組化檢測結果為ER和PR表達陽性[1]。本研究經(jīng)廣東省中山市博愛醫(yī)院倫理委員會批準。收集46例I型子宮內(nèi)膜癌患者中，年齡38～69歲，中位數(shù)為57歲，≥57歲29例，<57歲17例；腫瘤直徑≥3 cm的15例，<3 cm的31例；有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移30例；高分化21例，中分化18例，低分化7例；肌層浸潤超過1 cm的14例，未超過1 cm的32例。

1.2組織DNA提取利用基因組DNA提取試劑盒(Takara，大連)提取2 mg新鮮I型子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁3 cm處組織DNA，操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進行。Nanodrop2000(Thermo公司)檢測DNA濃度和質量。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3亞硫酸氫鹽測序法PCR(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用EZ DNA MethylationTMKits(ZYMOResearch，USA)對1.0 μg基因組DNA進行重亞硫酸氫鹽修飾。2.5 U Taq mix(Takara，大連)，0.5 μL lmol/L正向和負向引物，100 ng修飾后的DNA，加水至25 μL體系。正向引物：5′-AAGGGGTTAGTTTGGTGTT-3′，負向引物：5′-AACAAAAACAAAATATAAACTCAACAATv3′。PCR產(chǎn)物包含PTOV1啟動子區(qū)-200至0位置。反應條件：95 ℃5 min，95 ℃0.5 min，57.5 ℃1 min，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)，延伸72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，純化PCR產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T載體(Promega， USA)，轉化至感受態(tài)JM109細胞(Takara，大連)，挑選10個克隆，擴增后進行測序(英濰捷基，廣州)。計算腫瘤組織與癌旁組織PCR產(chǎn)物中CG位點甲基化百分比，低甲基化率=(1-CG位點甲基化百分比)×100%[6]，低甲基化率小于對照組均數(shù)-標準差的為低甲基化。

1.4免疫組化法使用UltraSensitiveTMSP(Mouse/Rabbit)IHC Kit(KIT-9710，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，福州)，步驟如下：新鮮組織脫水包埋制成石蠟切片，脫蠟至水，PBS沖洗3次；pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液加熱沸騰10 min進行抗原修復，PBS沖洗3次；加1滴3%H2O2(A液)，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；加1滴B液(羊血清)，室溫下孵育10 min，拭去液體；加PTOV1一抗，稀釋濃度1∶200(ab81173，Abcam)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次；加1滴C液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；加1滴D液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；DAB顯色(Kit-0014，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，福州)5 min，清水沖洗，蘇木素復染3 min，0.1%鹽酸2 s，自來水洗返藍15 min，脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。根據(jù)染色程度計分：1分：-；2分：+；3分：++；4分：+++；根據(jù)組織中的陽性細胞數(shù)計分：1分：0%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%。兩種計分方法得到的分數(shù)相乘，<8被認為低表達，≥8被認為高表達[3]。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件，用t檢驗統(tǒng)計分析PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中啟動子甲基化水平的差異；用chi-square test統(tǒng)計分析PTOV1甲基化與蛋白表達的關系及其與臨床參數(shù)的關系；用Pearson檢驗分析PTOV1甲基化與蛋白表達的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織中表達較癌旁組織高在46例I型子宮內(nèi)膜癌組織中，PTOV1高表達的28例，低表達18例；在癌旁組織中高表達的8例，低表達38例，統(tǒng)計分析顯示，PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織中表達較癌旁組織高(圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.477，P<0.001)。

圖1 免疫組化檢測PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中的表達(×100)

2.2 PTOV1表達與I型子宮內(nèi)膜癌患者臨床參數(shù)的關系統(tǒng)計分析顯示，PTOV1高表達與I型子宮內(nèi)膜癌患者年齡、組織分化程度、腫瘤大小及淋巴結轉移無關(P>0.05)，與腫瘤浸潤深度密切相關，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。見表1。

表1 PTOV1表達與I型子宮內(nèi)膜癌患者臨床參數(shù)的關系

2.3 PTOV1啟動子在I型子宮內(nèi)膜癌中低甲基化作者用在線軟件Methprimer(網(wǎng)址：http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)分析了PTOV1基因轉錄起始位點上游啟動子區(qū)1 000 bp序列，發(fā)現(xiàn)存在CpG島(圖2)。然后作者利用BSP檢測了PTOV1轉錄起始位點至上游200 bp處DNA甲基化狀態(tài)(圖3)。結果表明，25例患者癌組織PTOV1啟動子發(fā)生低甲基化，13例癌旁組織發(fā)生啟動子低甲基化，統(tǒng)計分析表明，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)。見表2。

圖2 Methprimer軟件預測PTOV1啟動子CpG島

2.4 I型子宮內(nèi)膜癌中PTOV1表達與啟動子甲基化狀態(tài)相關性分析統(tǒng)計分析顯示(圖4)，在I型子宮內(nèi)膜癌組織中PTOV1表達與其啟動子低甲基化率呈正相關，相關系數(shù)為0.799(P<0.001)。

圖3 BSP檢測PTOV1啟動子甲基化狀態(tài)DL2000為DNA電泳標記物

變量高甲基化低甲基化Pχ2癌組織21250.0116.456癌旁組織3313

圖4 I型子宮內(nèi)膜癌中PTOV1蛋白表達與啟動子低甲基化率的相關性分析

3 討 論

PTOV1基因定位于染色體19q13.3，全長9.51 kb，包含12個外顯子。其中，外顯子3～6編碼A結構域，外顯子7～12編碼B結構域[7]。目前發(fā)現(xiàn)PTOV1有2個轉錄本，其中1個轉錄本編碼416個氨基酸的蛋白，另一個轉錄本編碼374個氨基酸的蛋白，兩者N端和C端殘基存在差異[8]。PTOV1的啟動子區(qū)有轉錄因子SP1和SP2結合的保守區(qū)域以及雄激素反應元件[3]。

研究表明，PTOV1在多種腫瘤中高表達，并可作為鼻咽癌[9]、肝癌[10]及乳腺癌[11]預后預測的生物學標志物。也有研究表明，PTOV1在乳腺癌中過表達，并且通過活化Wnt/β-catenin信號通路促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[2]。而PTOV1在腫瘤中高表達的機制和促進腫瘤生長的機制不明。

本研究首先檢測了PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌組織中的表達，結果表明PTOV1的表達較癌旁組織增高。這一結果與其他研究PTOV1在腫瘤中表達的結果一致。隨后，本文統(tǒng)計分析了PTOV1表達與I型子宮內(nèi)膜癌患者臨床參數(shù)的關系，結果顯示其僅與腫瘤浸潤深度有關。有研究者發(fā)現(xiàn)，PTOV1的高表達浸潤性的尿路上皮癌細胞增殖和去分化密切相關[12]?？赡躊TOV1在I型子宮內(nèi)膜癌中也可發(fā)揮促進細胞增殖和去分化的作用，但是調控浸潤的機制有待進一步研究。

多項研究表明PTOV1在腫瘤中發(fā)揮轉錄因子的作用。PTOV1在轉移性前列腺癌組織中過表達，并可通過與SMRT、RBP-Jκ、NCoR、HDAC1和HDAC4等蛋白相互作用抑制下游Notch信號通路多個靶基因，如：HES1和HEY1[13]。此外，PTOV1可通過募集HDAC至DKK1啟動子區(qū)從而抑制其表達[2]。但是PTOV1表達調控機制研究甚少。

研究表明，多個基因的啟動子在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)生高甲基化，如：APC、CHD1、COMT及PTEN等[14]。但目前對于單基因啟動子低甲基化在子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制研究并不多。有研究者證實，CTCFL/BORIS在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)生低甲基化，可能促進腫瘤發(fā)展[15]。上皮細胞粘附分子(EpCAM)啟動子甲基化可通過調控骨形成蛋白基因家族多個基因促進子宮內(nèi)膜癌的復發(fā)[16]。

本研究首先通過在線軟件預測了PTOV1啟動子，結果發(fā)現(xiàn)存在CpG島，推測PTOV1可能在I型子宮內(nèi)膜癌中因發(fā)生啟動子低甲基化而高表達。隨后，檢測了I型子宮內(nèi)膜癌組織中PTOV1啟動子甲基化狀態(tài)，結果表明PTOV1在腫瘤組織中的啟動子低甲基化率高于癌旁組織，說明PTOV1啟動子在I型子宮內(nèi)膜癌中發(fā)生低甲基化。本研究統(tǒng)計了PTOV1啟動子低甲基化與蛋白表達的關系，發(fā)現(xiàn)其啟動子低甲基化與蛋白高表達呈正相關。所以，認為啟動子低甲基化是PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌中高表達的機制。

通過本研究，可明確PTOV1在I型子宮內(nèi)膜癌中表達增加，并腫瘤浸潤深度相關，其可能的機制是啟動子低甲基化。但是PTOV1如何調控腫瘤浸潤，機制有待進一步研究。

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TheclinicalpathologicalsignificanceandmolecularmechanismofPTOV1intypeIendometrialcancer

HUANG Lisi，LIANG Xueying，JIN Haiying，et al

(GynecologyandObstetricsDepartmentofZhongshanBoaiHospital,Zhongshan528400,Guangdong，China)

ObjectiveTo identify the significance of detecting prostate tumor overexpressed 1(PTOV1) and the mechanism of its expression regulation in type I endometrial cancer.MethodsForty-six tumor tissues and para-cancer tissues from typeIendometrial cancer patients were collected.The expression of PTOV1 protein in typeIendometrial cancer tissues and para-cancer tissues was detected by immunohistochemistry.The methylation status of PTOV1 was tested by bisulfite sequencing PCR.The differences between cancer tissues and para-cancer tissues were analyzed.The correlation between the PTOV1 expression and clinical parameters,the methylation status of PTOV1 and its expression,and the methylation status of PTOV1 and clinical parameters was statistically analyzed.ResultsThe expression of PTOV1 was increased and promotermethylation status was decreased in typeIendometrial cancer tissues.There was no correlation between PTOV1 expression and age,tumor size,differentiation degree,lymph node metastasis.But PTOV1 expression was positively related to invasion depth.Hypomethylation of PTOV1 promoter was positively related to its expression in type I endometrial cancer.ConclusionPTOV1 expression was correlated with typeIendometrial cancer invasion depth.The mechanism of PTOV1 expression may be promoter hypomethylation.

prostate tumor overexpressed 1; type Iendometrial cancer; hypomethylation; invasion

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.007

2017-03-08；

2017-06-10

本項目由中山市科技計劃項目(2015B1173)和中山市衛(wèi)生與計劃生育局醫(yī)學項目(2016J103)資助.

*通訊作者，E-mail：44926307@qq.com.

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蔣湘蓮)