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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001；2.湖南省邵陽學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2016級(jí)卓越醫(yī)師班)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

沙眼衣原體假定蛋白CT389原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

唐翠連1,2，陳浩1，劉玖林3，周洲1*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001；2.湖南省邵陽學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2016級(jí)卓越醫(yī)師班)

目的構(gòu)建能表達(dá)沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)假定蛋白CT389的質(zhì)粒pGEX6P-ct389及預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)。方法設(shè)計(jì)特異性引物，以Ct基因組為模板，PCR法擴(kuò)增ct389基因，構(gòu)建攜帶目的基因的重組質(zhì)粒pGEX6P-ct389；通過PCR鑒定和雙酶切鑒定初篩，測(cè)序鑒定驗(yàn)證結(jié)果；比較ct389和tc0668基因序列及其編碼產(chǎn)物的相似性，采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CT389蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果獲得大小約為1 300 bp的ct389基因片段，并成功得到重組質(zhì)粒pGEX6P-ct389。ct389和tc0668基因及其編碼產(chǎn)物的相似性高達(dá)84%和92%，CT389蛋白α-螺旋、無規(guī)卷曲和β片層的含量分別為27.7%、49.26%和占23.04%。與其三級(jí)結(jié)構(gòu)最接近的是鼠疫耶爾森氏菌的纖溶酶原激活物。結(jié)論Ct389與tc0668基因從DNA到編碼產(chǎn)物具有較高的相似性，ct389可能是重要的沙眼衣原體毒力基因。

沙眼衣原體； 蛋白結(jié)構(gòu)； 假定蛋白； CT389

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，Ct具有獨(dú)特生命周期、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，它能以原體(Elementary body，EB)和網(wǎng)狀體(Reticulate body，RB)兩種基本形態(tài)在感染機(jī)體所形成的生命周期中循環(huán)往復(fù)[1-3]。Ct能夠引起尿道炎、宮頸炎、陰道炎和盆腔炎等多種泌尿生殖道相關(guān)疾病，并能夠促進(jìn)HIV的傳播和提高宮頸癌的發(fā)病率，它也是目前最廣泛的性傳播疾病病原體之一。Ct感染患者的癥狀通常較輕，極易被忽視，難以及時(shí)進(jìn)行治療。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)Ct患者會(huì)反復(fù)感染，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致不孕不育、異位妊娠等并發(fā)癥。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ct的質(zhì)粒蛋白和外膜蛋白等能夠參與衣原體的致病過程[4- 5]，但更多潛在的Ct毒力物質(zhì)有待發(fā)掘并驗(yàn)證。

Ct在研究工作中面臨的問題之一是將Ct經(jīng)生殖道感染小鼠后，Ct會(huì)被小鼠機(jī)體清除，很難通過構(gòu)建動(dòng)物感染模型而進(jìn)行后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。因此，與Ct基因組相似性較高且可以成功構(gòu)建小鼠陰道感染模型的Cm成為研究Ct致病機(jī)制和免疫保護(hù)作用的常規(guī)替代菌株[6-8]。CT389蛋白與鼠衣原體(Chlamydia muridarum，Cm)TC0668蛋白具有很高的同源性，但是具體功能尚不清楚，也從未引起關(guān)注[6-7]。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)Cm tc0668基因與Cm感染小鼠后形成小鼠生殖道病變有關(guān)，其編碼產(chǎn)物是一種與Cm致病有關(guān)的重要毒力因子[7-8]。既然tc0668基因與Cm致病有關(guān)，提示Ct的ct389可能也是Ct潛在的致病基因。本研究構(gòu)建編碼CT389蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX6P-ct389，通過Blast比對(duì)驗(yàn)證其與已公布的Cm tc0668基因序列的相似性，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究CT389蛋白的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料沙眼衣原體Ct D血清型菌株模板、大腸桿菌Top10和表達(dá)質(zhì)粒pGEX6p-1由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶和DNA聚合酶從大連寶生物公司購(gòu)買；DNA marker、蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I自Fermentas公司購(gòu)買；蛋白胨和酵母提取物從英國(guó)Oxiod公司購(gòu)買；氨芐青霉素等化學(xué)試劑都為分析純以上及購(gòu)自上海生工生物公司。

1.2方法

1.2.1 ct389基因的擴(kuò)增 通過NCBI查到ct389基因序列，設(shè)計(jì)上游引物：F：CGCGGATCCATGATGAAACCTCTACGTTTC(BamH 1)和下游引物：R：AAAGCGGCCGCCTAAAAGCCATAACTTAATCG(Not 1)，并由上海生工生物公司合成。用Ct基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；(94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。PCR完成后以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，然后純化ct389 DNA 片段。

1.2.2 重組質(zhì)粒pGEX6P-ct389的構(gòu)建及鑒定 將pGEX6P-1和ct389基因利用BamHI和Not I進(jìn)行雙酶切，然后回收，利用T4 DNA連接酶將它們相連，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10。將其涂布在含氨芐青霉素的平板中37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取單菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 rpm過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定及雙酶切鑒定，初篩陽性克隆者擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 ct389 與Cm tc0668基因及其編碼蛋白的序列比對(duì)分析 利用blast分析ct389基因和tc0668基因及其編碼蛋白的相似性。

1.2.4 CT389蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 采用在線軟件Sopma分析它的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)時(shí)相似性閾值為8，預(yù)測(cè)構(gòu)象為：helix，sheet，Turn和coil四種。采用在線軟件Swiss-model搜索與CT389蛋白結(jié)構(gòu)最為接近的蛋白質(zhì)，然后利用該蛋白為模板，模擬預(yù)測(cè)CT389蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒pGEX6P-Ct389的構(gòu)建與鑒定以Ct基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的片段大小約為1 300 bp，與ct389基因大小相符(圖1)；將其連接到pGEX6P-1獲得重組質(zhì)粒pGEX6P-ct389，PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2泳道1，在DNA Marker的指示下出現(xiàn)了一條大小與預(yù)計(jì)相符，清晰的目的條帶；同時(shí)進(jìn)行的酶切鑒定結(jié)果顯示通過雙酶切作用后，重組質(zhì)粒可形成大小兩條目的條帶，小的基因條帶與PCR鑒定結(jié)果一致(圖2)。將陽性克隆送上海生工生物公司測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，與NCBI公布的ct389基因序列一致，表明成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX6P-ct389。

圖1 利用PCR擴(kuò)增ct389基因M：Marker；1,2：ct389基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 利用PCR和酶切驗(yàn)證pGEX6P-ct389質(zhì)粒M：Marker；1：利用PCR對(duì) pGEX6P-ct389質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證；2：利用雙酶切對(duì)pGEX6P-ct389質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證

2.2 CT389蛋白序列分析將測(cè)序的ct389基因序列與Pubmed上已公布的Cm tc0668基因序列(基因序列號(hào)：NC_002620)進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)他們之間基因序列相似性高達(dá)84%。進(jìn)一步將兩基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)CT389蛋白全長(zhǎng)共409個(gè)氨基酸，與TC0068相同的氨基酸數(shù)目為389個(gè)，與TC0668不同的僅有20個(gè)氨基酸，氨基酸序列的相似性高達(dá)92%(圖3)。通過分析，推測(cè)Ct CT389與Cm TC0668蛋白同源。

圖3 Cm TC0668和Ct CT389蛋白氨基酸序列的相似性分析

2.3 CT389蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Sopma軟件預(yù)測(cè)CT389蛋白α-螺旋(Alpha helix)含量為27.7%，無規(guī)卷曲(Random coil)為49.26%及β片層(Extended strand)占23.04%，分散在整個(gè)蛋白(圖4)。利用Swiss-model分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與其最為接近的是鼠疫耶爾森氏菌的纖溶酶原激活物(PDB：2x56.1.A)，以纖溶酶原激活物進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)得到CT389蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白整體結(jié)構(gòu)呈圓柱形，由7股β片層結(jié)構(gòu)組成側(cè)面，它們通過α-螺旋連接(圖5)。

圖4 CT389蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

圖5 模擬得到的CT389蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

病原菌的毒力是由散在或簇集的基因編碼產(chǎn)物決定的。明確這些與致病相關(guān)的基因是進(jìn)行衣原體致病機(jī)制研究的先決條件。研究證實(shí)，MIP蛋白、分泌性蛋白酶樣活性因子(Chlamydia protease-like activity factor,CPAF)等衣原體蛋白能通過誘生炎癥細(xì)胞因子或免疫逃逸等作用參與衣原體的致病機(jī)制[9-11]。但由于衣原體缺乏操控外源基因表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以往研究都無法在宿主體內(nèi)證明毒力因子的存在和缺失是造成病變差異的直接因素。在前期工作中發(fā)現(xiàn)，與Cm tc0668野生型菌株相比，Cm tc0668突變型菌株在小鼠生殖道的致病率明顯降低，兩者形成統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異[7-8]。首次證實(shí)TC0668是參與Cm感染致小鼠上生殖道病變的重要毒力因子。因此，與Cm TC0668同源的Ct CT389也可能為Ct致人生殖道病變的潛在致病物質(zhì)。

目前已開展了Cm TC0668致病機(jī)制的研究。作為一種新發(fā)現(xiàn)的可能與Ct致病相關(guān)的蛋白，迄今為止還沒有關(guān)于CT389蛋白的功能和相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。本文通過PCR方法獲得了ct389基因，并將其連接到載體pGEX6P-1得到重組質(zhì)粒pGEX6P-ct389，表達(dá)獲得編碼GST與CT389的融合蛋白。通過Blast基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ct389和tc0668基因在DNA序列上可產(chǎn)生高達(dá)84%的相似性。進(jìn)一步通過氨基酸序列的相似性分析，發(fā)現(xiàn)CT389和Cm TC0668蛋白在氨基酸序列的相似性高達(dá)92%，在獲得蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)信息的基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步利用生物信息學(xué)軟件分析了CT389蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CT389蛋白與鼠疫耶爾森氏菌的纖溶酶原激活物蛋白可能具有相似的結(jié)構(gòu)，推測(cè)CT389蛋白可能通過降解纖維蛋白，促進(jìn)衣原體在組織中擴(kuò)散有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為研究CT389蛋白的功能提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為進(jìn)一步尋找防治Ct的對(duì)策提供研究基礎(chǔ)。

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ConstructtheprokaryoticexpressionplasmidencodehypotheticalproteinCT389fromChlamydiatrachomatisandstructureprediction

TANG Cuilian,CHEN Hao,LIU Jiuling,et al

(InstitutionofPathogenicBiology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression plasmid pGEX6P-ct389 which express Chlamydia trachomatis hypothetical protein CT389 and predict its protein structure.MethodThe specific primers were designed and the Ct 389 gene was amplified through PCR by using Ct genome as template to construct prokaryotic expression plasmid pGEX6P-ct389 which contain the ct389 gene.The similarity between ct389 and tc0668 gene and their proteins were compared.The binary and ternary structure were analyzed by bioinformatics.ResultsThe 1300 bp length of Ct389 gene was gained and the recombinant plasmid pGEX6P-Ct389 was constructed successfully.The similarities of ct389 and tc0668 genes and their coding products were up to 84% and 92% respectively.The content of alpha-helix,random coil and beta sheet of CT389 protein are 27.7%,49.26% and 23.04%.The ternary structure of CT389 protein is similar to the structure of Pla protein from Yersinia pestis．ConclusionFrom DNA to coding product,ct389 has high similarities with tc0668 gene,and ct389 gene may be an important Chlamydia trachomatis virulence factor.

Chlamydia trachomatis; Protein structure; Hypothetical protein; CT389

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.002

2017-04-25；

2017-06-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31570179，30901352)；湖南省自然科學(xué)基金(No.13JJ4072)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金(No.12B109)；湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(No.2015-351)；特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(No.2014-5號(hào))；湖南省重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(No.2011-76).

*通訊作者，E-mail:Susiezhou99503@163.com.

R374.1

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蔣湘蓮)