，，，， ， ， ，，，，*，*

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng)，421000 ；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)部)

·臨床醫(yī)學(xué)·

循環(huán)microRNA-4281對(duì)肝癌的診斷與預(yù)后評(píng)估研究

胡甜1,2，李金成3，陽(yáng)學(xué)風(fēng)1，張楚紅1，李賽1，呂秀1，賀莎1，嚴(yán)漢興1，譚貽兮1，陳榮如1，文美玲1*，左建宏1,2*

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng)，421000 ；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)部)

目的探討循環(huán)miRNA-4281在肝癌患者血清中的表達(dá)情況及對(duì)診斷的臨床意義。方法運(yùn)用QRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)45例肝癌患者(肝癌組)及正常人(對(duì)照組)血清中miRNA-4281的表達(dá)量。結(jié)果與對(duì)照組相比，肝癌患者血清標(biāo)本中miRNA-4281的表達(dá)量明顯高于正常人，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ROC曲線下面積是0.805，microRNA-4281作為肝癌診斷的靈敏度為84.40%，特異度是73.30%。miRNA-4281的表達(dá)與AFP無(wú)明顯相關(guān)性。Kaplan-Meier分析提示miRNA-4281表達(dá)水平高的患者具有較短的生存期限(P<0.05)。結(jié)論檢測(cè)miRNA-4281有利于肝癌的診斷，可作為HCC 潛在的臨床診斷標(biāo)志物，同時(shí)其對(duì)于評(píng)估患者的預(yù)后具有重要作用。

肝癌； miRNA-4281； 診斷； 預(yù)后

原發(fā)性肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，其高居癌癥相關(guān)死亡腫瘤的世界第三位，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)率高及生存率低的流行病學(xué)特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人民生命健康，成為威脅人類公共衛(wèi)生的巨大挑戰(zhàn)[1]。由于肝癌的早期臨床表現(xiàn)隱匿和缺乏有效的早期診斷，大部分患者診斷時(shí)都為晚期肝癌，常伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，其預(yù)后差，生存期短。因此，早期發(fā)現(xiàn)和診斷對(duì)于及時(shí)采取有效的治療手段，改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)生存期具有重要的臨床意義[2]。循環(huán)microRNA(miRNA)是一類單鏈，內(nèi)源性非編碼小分子RNA[3]。研究表明miRNAs參與了疾病的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,miRNA的表達(dá)紊亂是導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)的一系列腫瘤形成的重要因素[4]。目前已有研究證明循環(huán)microRNA在肝癌的診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及預(yù)后中都具有重要的作用[5-6]。例如研究表明miR-20a可以抑制Hep G2細(xì)胞(肝腫瘤細(xì)胞)的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移，因此有望作為肝癌診斷和治療的新分子靶點(diǎn)[7]。但對(duì)于miRNA-4281與肝癌的關(guān)系報(bào)道較少，因此，本文研究miRNA-4281在肝癌患者以及正常人血清中的表達(dá)情況，分析其與肝癌相關(guān)病理生理的關(guān)系，明確miRNA-4281在肝癌診斷和預(yù)后中的作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象45例肝癌患者組來(lái)自于南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院及附屬第一醫(yī)院在2015年9月至2016年1月的肝癌患者?；颊吣挲g為31～80歲，平均年齡為57.64歲。每例肝癌患者至少經(jīng)過(guò)超聲、CT 和組織病理學(xué)中的兩種方法，并結(jié)合相關(guān)病史及血清AFP 水平而確診。所有樣本均在患者進(jìn)行治療前收集。對(duì)照組的45例正常人血清樣本來(lái)自南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院體檢中心，年齡28～72歲，平均年齡45.22歲。所有參與研究者在實(shí)驗(yàn)前均簽署了知情同意書，同時(shí)經(jīng)過(guò)了南華大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。肝癌患者組和健康對(duì)照組均取外周血2 mL，離心后取上層血清，放至-80 ℃環(huán)境中保存。

1.2實(shí)驗(yàn)材料所有實(shí)驗(yàn)耗材均購(gòu)自湖南科泰公司，QIAzol Lysis Reagent 、miScript II RT Kit、miRNeasy Serum/Placma Kit 、Has_miR-4281、Has_miR-6087、 Has_miR-39特異性反轉(zhuǎn)錄引物及qPCR特異性擴(kuò)增引物、miScipt SYBR Green PCR Kit均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取 取上層血清標(biāo)本200ul，加入5倍量的QIAzol試劑并嚴(yán)格按照QIAzol Lysis Reagent試劑盒說(shuō)明書上進(jìn)行操作。

1.3.2 cDNA合成 取3uL上述步驟中提取的RNA做模板，參照miScript II RT Kit試劑盒上要求，分別加入以下試劑：4μL of 5x miScript HISpec Buffer,2 μL of 10x miScript Nucleics Mix,9μL of RNase-free water and 2μL of miScript Reverse Transcriptase Mix。反應(yīng)體系共20μL，放至PCR逆轉(zhuǎn)錄儀中，設(shè)置反應(yīng)條件為37 ℃ 60分鐘，95 ℃ 5分鐘，4 ℃ 30分鐘。最后所得cDNA中加入200μL無(wú)酶水后可放至-20 ℃中長(zhǎng)期保存。

1.3.3 QRT-PCR 反應(yīng)在48孔板中分別加入5 μL of 2× QuantiTect SYBR Green PCR master Mix,1 μL of 10× miScript Universal Primer,1ul of 10× Has_miR-39 miScript Primer Assay or 1μL of Has_miR-miRNA-4281 miScript Primer Assay,2μL of RNase-free water 和 1 μL 上述cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(illuminaEco 48)，反應(yīng)分為兩步，第一步是95 ℃ 15分鐘預(yù)變性1個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)行第二步擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)(95 ℃15秒，55 ℃30秒，70 ℃30秒)。

本次實(shí)驗(yàn)使用2-△△CT法來(lái)進(jìn)行比較，同時(shí)利用miR-39作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，測(cè)出miRNAs的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)為了進(jìn)一步保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置了三個(gè)重復(fù)孔，利用重復(fù)孔的平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用了SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。miRNA-4281的相對(duì)表達(dá)量miRNA-4281在肝癌患者及正常人中表達(dá)量水平的比較使用了t檢驗(yàn)。miRNA-4281的表達(dá)量與肝癌患者臨床特征各參數(shù)間的比較運(yùn)用了單因素變量分析，以P<0.05表示為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-4281在肝癌患者及正常人血清中的表達(dá)水平miRNA-4281在肝癌患者血清中的相對(duì)表達(dá)量是11.87±2.44。正常人血清中miRNA-4281的相對(duì)表達(dá)量分別是8.38±2.11。結(jié)果提示miRNA-4281在肝癌患者血清中的表達(dá)量明顯高于正常人，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見圖1)。通過(guò)繪制受試者工作曲線(ROC)(見圖2)，當(dāng)miRNA的相對(duì)表達(dá)量為10.86時(shí)，其Youden指數(shù)最大，此時(shí)miRNA-4281診斷肝癌的ROC曲線下面積是0.805，并且其靈敏度是84.40%，特異度是73.30%。上述結(jié)果提示檢測(cè)miRNA-4281對(duì)于肝癌診斷具有重要的意義。

2.2 miRNA-4281與AFP的相關(guān)性分析通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)，來(lái)分析miRNA-4281與AFP的之間相關(guān)性。分析結(jié)果得出miRNA-4281與AFP之間相關(guān)性r=0.15，P=0.9，說(shuō)明miRNA-4281與AFP沒(méi)有相關(guān)性，可作為肝癌的獨(dú)立診斷標(biāo)準(zhǔn).

2.3 miRNA-4281與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析不同性別、腫瘤大小、疾病分期、AFP水平、肝功能(轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素)、乙型肝炎表面抗原等臨床特點(diǎn)中，miRNA-4281的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)(見表1)。將實(shí)驗(yàn)中miRNA-4281的表達(dá)量按其平均數(shù)分為高、低兩組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA-4281表達(dá)量高的組別中，其病人的生存期相對(duì)較短，且高、低兩組數(shù)據(jù)的差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

圖1 microRNA-4281在正常人及肝癌患者血清中的表達(dá)情況

圖2 microRNA-4281在肝癌患者血清診斷的ROC曲線

3 討 論

眾所周知，肝癌起病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，同時(shí)由于現(xiàn)有診斷手段的局限，病人確診時(shí)多為晚期。如果能夠早期診斷，在肝癌只有單一腫塊或腫塊大小在2cm以內(nèi)，早期進(jìn)行根治性手術(shù)，患者的5年生存期將大大延長(zhǎng)[8]。因此，需要一種行之有效的診斷方法來(lái)提高早期診斷率。目前臨床上主要是通過(guò)血清AFP檢測(cè)以及影像學(xué)檢查等來(lái)進(jìn)行肝癌的診斷，但是這些診斷手段仍存在一定的局限性，無(wú)法十分有效的進(jìn)行肝癌的早期診斷[9]。與AFP不同的是，miRNAs 更早、更穩(wěn)定的在體液或組織中表達(dá)，即使經(jīng)過(guò)高溫、極酸或極堿性條件下，血漿中miRNAs的含量變化不大，甚至是經(jīng)過(guò)多次凍融循環(huán)，其同樣能保持相對(duì)穩(wěn)定[10]。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs對(duì)于包括肝癌在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生、發(fā)展、增殖及轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程都起到了一定的作用[3，11]。已有研究證明了miR-96可以作為肝癌診斷的新型標(biāo)志物，同時(shí)其表達(dá)水平與腫瘤大小及分期有關(guān)[12]。Ruan T 等發(fā)現(xiàn)了miR186在肝癌患者中是低表達(dá)的，同時(shí)其可抑制肝癌細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移及侵襲[13]。另外研究發(fā)現(xiàn)miR-101可通過(guò)作用于血管內(nèi)皮因子來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這對(duì)于利用microRNA對(duì)肝癌進(jìn)行靶向治療提供了有利證據(jù)[14]。目前已有大量關(guān)于肝癌中循環(huán)microRNA的研究，也證明了其對(duì)于肝癌的診斷、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的關(guān)系。但是目前關(guān)于miRNA-4281在肝癌中的表達(dá)情況并沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。本研究通過(guò)高通量篩查選出在肝癌患者及正常人血清標(biāo)本中表達(dá)水平具有明顯差異的miRNA-4281。結(jié)果顯示肝癌患者血清miRNA-4281的表達(dá)量較正常人明顯升高(P<0.05)，同時(shí)ROC曲線分析得出miRNA-4281檢測(cè)對(duì)于肝癌診斷的靈敏度和特異度均較高，并且其與AFP的表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性，可做為肝癌的獨(dú)立診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]。本研究結(jié)果顯示miRNA-4281的表達(dá)水平與患者的性別、腫瘤大小、疾病分期、肝功能情況以及存在過(guò)乙型肝炎病毒感染等無(wú)明顯差異(P>0.05)，提示miRNA-4281可以用于肝癌的診斷，有可能作為一種新的腫瘤標(biāo)志物。Kaplan-Meier生存曲線分析表明miRNA-4281表達(dá)水平高的患者傾向于有更短的生存期(P<0.05)。

表1 miRNA-4281的表達(dá)量與肝癌患者臨床特征的相關(guān)性分析

圖3 microRNA-4281表達(dá)水平高(黑線)的患者有較低的生存期，淺色線提示miRNA-4281表達(dá)低組具有較高的生存期，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-4281在肝癌患者中明顯升高，說(shuō)明其可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，為肝癌的診斷和預(yù)后評(píng)判提供了新思路，是否能作為評(píng)估患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物還需進(jìn)一步研究。

[1] Gokuladhas K,Jayakumar S,Rajan B,et al.Exploring the potential role of chemopreventive agent,hesperetin conjugated pegylated gold nanoparticles in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in male wistar albino rats[J].Indian J Biochem Biophys,2016,31(2):171-184.

[2] He S,Hu XW,Wang D,et al.Accuracy of microRNAs for the diagnosis of hepatocellular carcinoma:A systematic review and meta-analysis[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2016,3(16):30026-30032.

[3] Garzon R,Calin GA,Croce CM,et al.MicroRNAs in cancer [J].Annu Rev Med,2009,3(60):167-179.

[4] Zuo J,Wen M,Lei M,et al.MiR-210 links hypoxia with cell proliferation regulation in human Laryngocarcinoma cancer [J].J Cell Biochem,2015,116(6):1039-1049.

[5] Mirzaei HR,Sahebkar A,Mohammadi M,et al.Circulating microRNAs in hepatocellular carcinoma potential diagnostic and prognostic biomarkers[J].Curr Pharm Des,2016,22(34):5257-5269.

[6] Fiorino S,Bacchi-Reggiani ML,Visani M,et al.MicroRNAs as possible biomarkers for diagnosis and prognosis of hepatitis B- and C-related- hepatocellular-carcinoma[J].World J Gastroenterol,2016,22(15):3907-3936.

[7] Chen GS,Zhou N,Li JQ,et al.restoration of miR-20a expression suppresses cell proliferation,migration,and invasion in HepG2 cells [J].Onco Targets Ther,2016,9(12):3067-3076.

[8] Chen Y,Chen J,Liu Y,et al.Plasma miR-15b-5p,miR-338-5p,and miR-764 as Biomarkers for Hepatocellular Carcinoma[J].Med Sci Monit,2015,10(21):1864-1871.

[9] Seleem MI,Abdelraouf A,Gerges SS,et al.Laparoscopic assisted per-frequency ablation(Laprfa)as a new modality for treatment of HCC in cirrhotic liver[J].J Egypt Soc Parasitol,2015,45(1):451-456.

[10] Morishita A,Masaki T.MicroRNAs in hepatocellular carcinoma [J].Hepatol Res,2015,3(45):128-141.

[11] Hua HW,Jiang F,Huang Q,et al.MicroRNA-153 promotes Wnt/beta-catenin activation in hepatocellular carcinoma through suppression of WWOX [J].Oncotarget,2015,3(6):3840-3847.

[12] Chen Y,Dong X,Yu D,et al.Serum miR-96 is a promising biomarker for hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus infection [J].Int J Clin Exp Med,2015,8(10):18462-18468.

[13] Ruan T,He X,Yu J,et al.MicroRNA-186 targets Yes-associated protein 1 to inhibit Hippo signaling and tumorigenesis in hepatocellular carcinoma [J].Oncol Lett,2016,11(4):2941-2945.

[14] Liu Z,Wang J,Mao Y，et al.MicroRNA-101 suppresses migration and invasion via targeting vascular endothelial growth factor-C in hepatocellular carcinoma cells [J].Oncol Lett,2016,11(1):433-438.

[15] He S,Zhang J,Lin J,et al.Expression and function of microRNA-27b in hepatocellular carcinoma[J].Mol Med Rep,2016,13(3):2801-2808.

StudyofcirculatingmicroRNA-4281fordiagnosisandprognosticvaluationinhepatocellularcarcinoma

HU Tian,LI Jiancheng,YANG Xuefeng,et al

(TheAffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo measure the expression of the circulating miRNA-4281 in the serum of patients with hepatocellular carcinoma (HCC),and to find out the clinical meaning in diagnosis.MethodsBlood samples from normal healthy (n=45) and HCC patients (n=45) were collected,respectively.Quantitative Real-time PCR was used to detect the expression level of miRNA-4281 in the two groups.ResultsThe expression of miRNA-4281 was significantly higher in the patients compared to that in the control (P<0.05).The area under receiver-operating characteristic curve was 0.805,with the sensitivities of 84.40% and the specificities of 73.30%.The expression level of miRNA-4281 and AFP had no correlation.Kaplan-Meier showed that the patients seemed to live a shorter time with the high expression of miRNA-4281(P<0.05).ConclusionDetecting miRNA-4281 may help to diagnose HCC.MiRNA-4281 may be a potential marker in the diagnosis and the prognosis.

hepatocellular carcinoma; miRNA-4281; diagnosis; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.013

2016-06-18；

2016-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272960)，湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2013WK2010，2014SK2015)，人社部重點(diǎn)項(xiàng)目〔2016〕176號(hào)和天晴肝病研究基金(TQGB20140155).

*通訊作者，E-mail:632138414@qq.com.

R735.7

A

秦旭平)