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        MiR-195對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞5-氟尿嘧啶耐藥性的影響

        2017-12-25 01:47:26,,,,
        關(guān)鍵詞:氟尿嘧啶脂質(zhì)體耐藥性

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        (南華大學(xué)藥物藥理研究所,湖南 衡陽(yáng) 421001)

        ·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

        MiR-195對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞5-氟尿嘧啶耐藥性的影響

        楊曉燕,向瓊,殷杰,虞佳,甘潤(rùn)良,雷小勇*

        (南華大學(xué)藥物藥理研究所,湖南 衡陽(yáng) 421001)

        目的探討miR-195對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞5-氟尿嘧啶藥物敏感性的影響。方法采用qRT-PCR檢測(cè)BEL-7402細(xì)胞與BEL-7402/5-FU細(xì)胞中miR-195的表達(dá)水平。將miR-195質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至BEL-7402/5-FU細(xì)胞;MTT檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性的改變。結(jié)果相比于BEL-7402細(xì)胞,miR-195在BEL-7402/5-FU細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào);miR-195轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率較miRNA陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組明顯增高。結(jié)論MiR-195能夠增加BEL-7402/5-FU細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的藥物敏感性,抑制細(xì)胞增殖。

        MiR-195; BEL-7402/5-FU細(xì)胞; 5-氟尿嘧啶; 耐藥性

        原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率高且最為常見的惡性腫瘤之一,其死亡率居全球惡性腫瘤的第二位[1]。目前,化療是原發(fā)性肝癌綜合治療中常用的一種方法。5-氟尿嘧啶對(duì)增殖性細(xì)胞具有殺傷性作用而作為一線藥物。它通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,進(jìn)而阻斷DNA的生物合成而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2]。因此,在肝癌的化療方面如何提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性及增強(qiáng)藥物療效,具有重要意義。miRNA是一類小的非編碼調(diào)節(jié)RNA分子,長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸[3]。最近的研究證實(shí),miRNA參與作用腫瘤細(xì)胞耐藥的過程[4]。MiR-195是miR-15/16/195家族成員之一,作為抑癌基因在腫瘤發(fā)生中起著重要作用,它可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[5]。本研究利用miR-195質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU細(xì)胞中,探討miR-195在肝癌細(xì)胞化療耐藥過程中所發(fā)揮的作用,從而為逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥提供新途徑。

        1 材料與方法

        1.1材料與試劑人肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU 細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物有限公司,1640粉末培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司,胎牛血清為杭州四季青生物公司,質(zhì)粒提取試劑盒為日本TAKARA 公司產(chǎn)品,脂質(zhì)體Lipofectamin2000 為美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品,RT-PCR 試劑盒購(gòu)自Promega公司,PCR 擴(kuò)增體系購(gòu)于上海生物工程公司。5-氟尿嘧啶為天津金耀氨基酸有限公司,MTT為Sigma 公司(將5 mg的MTT溶于0.5 mL)。

        1.2 BEL-7402/5-FU細(xì)胞培養(yǎng)BEL-7402/5-FU細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640溶液中,置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱,在培養(yǎng)液中加入0.15 mmol/L 5-FU維持耐藥性培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)傳代和收集,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.3 qRT-PCR檢測(cè)BEL-7402/5-FU細(xì)胞miR-195表達(dá)水平qRT-PCR檢測(cè)BEL-7402/5-FU細(xì)胞與BEL-7402細(xì)胞中miR-195表達(dá)水平。采用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)流程參照RT-PCR 試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行,PCR 反應(yīng)體系按照說(shuō)明書要求分別加入引物:U6 和hsa-miR-195,反應(yīng)條件均為:95 ℃,10 min;40個(gè)PCR 循環(huán)(95 ℃,15 s;60 ℃,60 s 收集熒光)。為了建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后95 ℃,2 min;60 ℃,20 s;99 ℃,10 s,并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(8 min) 。BEL-7402/5-FU細(xì)胞與BEL-7402細(xì)胞樣品中的miR-195 和內(nèi)參(U6) 分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR 反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        1.4真核質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建與BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建:線性化PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表達(dá)載體含有綠色熒光蛋白(GFP)從上海吉瑪公司購(gòu)得。基于線蟲miR-67(與人源的miRNA無(wú)同源性)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組。

        質(zhì)粒提取:將構(gòu)建好的miR-195質(zhì)粒表達(dá)載體和陰性對(duì)照組表達(dá)載體(載體上含Streptomyces spectabilis耐藥篩選基因),轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)菌株(JM109)進(jìn)行擴(kuò)增,利用質(zhì)粒提取試劑盒(去內(nèi)毒素)提取質(zhì)粒,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染:根據(jù)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行,取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板,6 000個(gè)細(xì)胞/每孔,待細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔面積為80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。棄去舊培養(yǎng)基,用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。制備miRNA質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物,6孔板每孔試劑用量如下:取10 μL脂質(zhì)體至100 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)中充分混勻,室溫靜置5 min;同時(shí)4 μg質(zhì)粒載體至100 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)中混勻,室溫靜置5 min;用移液槍將兩種混合物輕輕混合至均勻,室溫靜置20 min,此即為miRNA/脂質(zhì)體復(fù)合物。用移液槍將miRNA/脂質(zhì)體復(fù)合物輕滴入到孔中,37 ℃培養(yǎng)箱培育6 h后,每孔補(bǔ)加1 000 μL完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,利用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。

        1.5 MTT檢測(cè)BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖變化待細(xì)胞呈指數(shù)式生長(zhǎng),取細(xì)胞接種于96孔板,6.0×103個(gè)細(xì)胞/孔,接種12 h后,進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,96孔板每孔試劑加入量如下:取1 μL脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)至10 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)中,混勻充分,室溫靜置5 min;同時(shí)取0.4 μg 質(zhì)粒 (miR-195或miRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒)至10 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM),混勻充分,室溫放置5 min;然后,將兩種混合物均勻混合,室溫靜置20 min即得到miRNA/脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)復(fù)合物。37 ℃培養(yǎng)箱培育24 h后,每孔分別加入0、0.1、1、10、100 mmol/L 5-氟尿嘧啶的完全培養(yǎng)基150 μL,再培養(yǎng)24 h后加MTT(5 g/L)20 μL/孔,再培養(yǎng)4 h,棄去上清液,加DMSO 150 μL/孔,微量振蕩器振搖10 min后,在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。根據(jù)公式計(jì)算:增殖抑制率=1-(試驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值),并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50值。

        1.6統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),單因素方差分析、方差齊性檢驗(yàn),并經(jīng)LSD 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有顯著性。

        2 結(jié) 果

        2.1 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-195表達(dá)水平在BEL-7402/5-FU細(xì)胞中miR-195表達(dá)較BEL-7402細(xì)胞顯著下調(diào)(比值<0.5)(見圖1)。

        圖1 BEL-7402/5-FU細(xì)胞與BEL-7402細(xì)胞中miR-195的表達(dá) 與BEL-7402細(xì)胞比較,*p<0.05(n=3)

        2.2倒置熒光顯微鏡檢測(cè)miR-195轉(zhuǎn)染BEL-7402/5-FU細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率質(zhì)粒表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果表明miR-195序列位于載體122-140 bp間,確定載體構(gòu)建成功(圖2)。miR-195轉(zhuǎn)染BEL-7402/5-FU細(xì)胞后48 h,通過倒置熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光情況,miR-195轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染率均大于35%(圖3)。

        圖2 miR-195重組PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體測(cè)序圖

        圖3 倒置熒光顯微鏡檢測(cè)miR-195 轉(zhuǎn)染BEL-7402/5-FU細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況(×100) A:未轉(zhuǎn)染組;B:miRNA陰性對(duì)照組;C:miR-195轉(zhuǎn)染組

        2.3 MiR-195聯(lián)合5-FU對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖的影響MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的變化(見圖4);miR-195轉(zhuǎn)染組5-氟尿嘧啶的IC50值7.5±1.43 mmol/L;未轉(zhuǎn)染組的IC5072.67±9.87 mmol/L及陰性對(duì)照組IC5068.84±8.56 mmol/L。與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組比較,miR-195轉(zhuǎn)染組的IC50值顯著降低。

        圖4 miR-195聯(lián)合5-FU 處理對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖的影響 與未轉(zhuǎn)染組&陰性對(duì)照組,*P<0.05(n=3)

        3 討 論

        5-氟尿嘧啶(5-FU)是肝癌及其他腫瘤化療中使用最為廣泛的藥物,然而,由于腫瘤細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)的耐藥性,化療的效果差強(qiáng)人意。其耐藥性涉及細(xì)胞的多種生化改變,包括耐藥相關(guān)基因表達(dá)升高、藥物的蓄積降低、谷胱甘肽(GSH) 或與其代謝有關(guān)酶活性增高、細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白水平升高以及DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)等。因此,臨床上單用5-FU對(duì)耐藥的腫瘤細(xì)胞療效很差。為逆轉(zhuǎn)5-FU的耐藥性,人們進(jìn)行過廣泛的探討,但至今尚未發(fā)現(xiàn)一種在體內(nèi)有良好逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥性的藥物。

        越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA突變或者異常表達(dá)與多種人類癌癥發(fā)生相關(guān),有關(guān)于miRNA的研究工作也成為近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)熱門的研究聚焦點(diǎn)。miRNA的表征有望成為腫瘤診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記。此外,miRNA特異性調(diào)控靶基因的作用方式,可能為抗腫瘤治療提供新的方法[6]。本研究探討miRNA在化療耐藥過程中所發(fā)揮的作用,有望發(fā)現(xiàn)一個(gè)行而有效的化療策略。

        本研究發(fā)現(xiàn)BEL-7402/5-FU細(xì)胞系與BEL-7402細(xì)胞系之間miRNA存在表達(dá)差異。其中某些miRNA變異與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián),如miR-195[7]、miR-122[8]、miR-372[9]、miR-16等[10]miRNAs在腫瘤的生物學(xué)特性中發(fā)揮的重要作用也可能參與腫瘤耐藥。本文以BEL-7402/5-FU 為研究對(duì)象,qRT-PCR結(jié)果顯示,BEL-7402/5-FU 細(xì)胞中miR-195表達(dá)較BEL-7402 細(xì)胞顯著降低,提示miR-195與肝癌的耐藥性密切相關(guān)。本研究利用構(gòu)建的miR-195真核表達(dá)載體,調(diào)整修復(fù)了BEL-7402/5-FU細(xì)胞系中miR-195的表達(dá)水平。結(jié)果表明經(jīng)轉(zhuǎn)染后,miR-195均能增加化療藥物的敏感性,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)BEL-7402/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥。

        這一研究提示,miR-195很可能成為抗腫瘤治療的一個(gè)有效靶點(diǎn),尤其在抗腫瘤治療及腫瘤耐藥方面占據(jù)重要地位,并能夠增強(qiáng)BEL-7402/5-FU對(duì)5-FU化療藥物的敏感性,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,為肝癌的基因治療提供了新的途徑;為了進(jìn)一步明確其逆轉(zhuǎn)耐藥的具體機(jī)制,還需要驗(yàn)證miR-195對(duì)其它多種化療藥物敏感性的影響以及進(jìn)行體內(nèi)成瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn),為miR-195用于臨床打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。如果能夠成功應(yīng)用miRNA作為抗腫瘤治療制劑于臨床上,雖然能夠帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益,但是將面臨miRNA在體內(nèi)的給藥方式等障礙,因此,將基礎(chǔ)研究工作應(yīng)用到臨床的生物治療有待深入探討。

        [1] Josep M Llovet.Focal gains of VEGFA:candidate predictors of sorafenib response in Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Cell,2014,25(5):560-562.

        [2] Seiple L,Jaruga P,Dizdaroglu M,et al.Linking uracil base excision repair and 5-fluorouracil toxicity in yeast[J].Nucleic Acids Research,2006,34(1):140-151.

        [3] Ye C,Rodrigo J,Marina K,et al.CXCR4 downregulation of let-7a driveschemoresistance in acute myeloid leukemia[J].J Clin Invest,2013,123(6):2395-2407.

        [4] Pink RC,Samuel P,Massa D,et al.The passenger strand,miR-21-3p,plays a role in mediating cisplatin resistance in ovarian cancer cells[J].Gynecol Oncol,2015,137(1):143-51.

        [5] Wang M,Zhang J,Tong L,et al.miR-195 is a key negative regulator of hepatocellular carcinoma metastasis by targeting FGF2 and VEGFA[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14110-20.

        [6] De Nigris F.Epigenetic regulators:Polycomb-miRNA circuits in cancer[J].Biochim Biophys Acta,2016,1859(5):697-704.

        [7] He XX,Kuang SZ,Liao JZ,et al.The regulation of microRNA expression by DNA methylation in hepatocellular carcinoma[J].Mol Biosyst,2015,11(2):532-9.

        [8] 虞佳,唐正午,楊曉燕,等.MiRNA-122對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2015,43(2):137-140.

        [9] Gu H,Guo X,Zou L,et al.Upregulation of microRNA-372 associates with tumor progression and prognosis in hepatocellular carcinoma [J].Mol Cell Biochem,2013,375(1-2):23-30.

        [10] Wu WL,Wang WY,Yao WQ,et al.Suppressive effects of microRNA-16 on the proliferation,invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells[J].Int J Mol Med,2015,36(6):1713-1719.

        EffectsofMicroRNA-195on5-FUResistanceinBEL-7402/5-FUCells

        YANG Xiaoyan,XIANG Qiong,YIN Jie,et al

        (InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

        ObjectiveThis study investigated the effect of miR-195 on 5-FU resistance in BEL-7402/5-FU Cells.MethodsqRT-PCR analyzed expression of miR-195 between BEL-7402 and BEL-7402/5-FU cells.MiR-195 was transiently transfected into BEL-7402/5-FU cells.Drug sensitivity of the cells to 5-FU was analyzed by MTT.ResultsThe expression of miR-195 was downregulated in BEL-7402/5-FU cells compared to parental BEL-7402 cells.MTT results showed that miR-195 transfected cells had a higher cell inhibition rate than untreated cells or negative control.ConclusionsMiR-195 could sensitize BEL-7402/5-FU cells to 5-FU and inhibited cell proliferation.

        MiRNA-195; BEL-7402/5-FU cells; 5-FU; drug resistance

        10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.008

        2016-04-10;

        2016-09-21

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助(81372579);湖南省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生資助科研項(xiàng)目(B2014-048);湖南省教育廳一般課題(13C832).

        *通訊作者,E-mai:1622214323@qq.com.

        R735.7

        A

        蔣湘蓮)

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