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(1首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京100069；2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點實驗室)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

Tyr163和Tyr223硝基化修飾參與同型半胱氨酸誘導的胱硫醚β-合酶失活

王環(huán)愿1,2，徐嘉惠1,2，周藝1,2，孫琪1,2，董玉1,2，王雯1,2*

(1首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京100069；2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點實驗室)

目的探討酪氨酸(tyrosine,Tyr,Y)殘基(Tyr163,Tyr223)硝基化修飾與同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)誘導的胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase,CBS)活性降低之間的關(guān)系。方法運用體外基因突變的方法，將CBS可能發(fā)生硝基化修飾的酪氨酸殘基替換為苯丙氨酸(phenylalanine,F)或丙氨酸(alanine,A)，構(gòu)建野生型(WT)和突變型(Y163F,Y223A)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293H工具細胞，誘導重組基因表達；利用Hcy刺激后，提取細胞蛋白，分析硝基化CBS的含量及其酶活性。結(jié)果WT,Y163A和Y223F質(zhì)粒均能正常表達CBS并且具有活性；Hcy(500μmol/L,24h)誘導WT CBS發(fā)生硝基化修飾，但是Y163A和Y223F突變使CBS的硝基化程度明顯下降(P<0.05,P<0.01)；WT +Hcy組CBS活性明顯低于WT組(P<0.01)；Y163A+Hcy組和Y223F+Hcy組CBS活性高于WT+Hcy(P<0.01,P<0.05)。結(jié)論Hcy可以導致CBS活性降低，與Hcy誘導CBS酪氨酸殘基(Tyr163,Tyr223)發(fā)生硝基化修飾有關(guān)。

胱硫醚β-合酶； 硝基化修飾； 同型半胱氨酸

1 材料與方法

1.1材料與試劑HEK293H細胞株購自ATCC細胞庫；以pEGFP-C3為載體的WT、Y163A和Y223F質(zhì)粒由北京利科麗生物科技有限公司構(gòu)建。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；Lipofectamine 2000 試劑和OptiMEM(Invitrogen公司，美國)；Hcy試劑(Sigma-Aldrich公司，美國)；細胞CBS活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒(GENMED公司，美國)；3-NT抗體(Millipore 公司，美國)；CBS抗體、GAPDH抗體、Protein A/G磁珠、山羊抗兔IgG/生物素標記和山羊抗小鼠IgG/生物素標記(Santa Cruz公司，美國)；小鼠超敏二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司；酶標儀(Molecular Devices公司，美國)；Western Blot電泳儀，Western Blot電轉(zhuǎn)儀，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)；BLItz單樣本分子相互作用儀(ForteBio，美國)。

1.2細胞培養(yǎng)及給藥含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293H細胞，置于37°C，95%混合氣(含氧)和5% CO2培養(yǎng)箱，待細胞貼壁(24～48 h)后，隔天換液，待細胞密度達80%可進行傳代6孔板繼續(xù)培養(yǎng)；待6孔板細胞融合達70%～80%后，換用1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h同步化后，分別設(shè)轉(zhuǎn)染W(wǎng)T、Y163A和Y223F質(zhì)粒組以及Hcy刺激組(以500μmol/L Hcy作用24h來刺激3組轉(zhuǎn)染細胞組[6])。

1.3免疫細胞化學染色將HEK293H細胞爬片用4%的多聚甲醛，4 ℃固定20 min后，用PBS室溫漂洗；5%BSA室溫封閉20 min之后，甩掉封閉液，加入CBS抗體，4 ℃孵育過夜；次日，取出載玻片，PBS沖洗，使用小鼠超敏二步法檢測試劑盒，37 ℃孵育聚合物輔助劑、辣根酶標記抗小鼠IgG聚合物各15 min。DAB混合液顯色1 min，蘇木精染液染色1 min使細胞核著色，使用含有1%(體積分數(shù))鹽酸的乙醇脫去非特異性染色。梯度乙醇二甲苯脫水，樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.4細胞轉(zhuǎn)染使用6孔板培養(yǎng)細胞，轉(zhuǎn)染前用PBS洗滌3次，排除血清干擾，換成1 mL的Opti-MEM2000培養(yǎng)基；將3.75 μL的lipofectamine 2000加入50 μL的Opti-MEM2000培養(yǎng)基中，孵育5 min；將3 μg的質(zhì)粒加入50 μL Opti-MEM2000培養(yǎng)基；將上述配制的轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒液體混合，孵育20 min后，加入待轉(zhuǎn)染的細胞，培養(yǎng)5 h；細胞換液，換成10%血清高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，可用于隨后實驗。

1.5細胞CBS活性檢測具體方法按細胞CBS活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒(GMS50546.1 v.A)產(chǎn)品說明書進行。測定原理：基于底物絲氨酸和半胱氨，受到胱硫醚 β-合成酶的水解，進而通過賴氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)中，由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，所產(chǎn)生的峰值變化(340 nm)，來定量分析胱硫醚 β-合成酶的活性。

1.6分子之間相互作用檢測利用 BLItz系統(tǒng)觀察蛋白與蛋白之間的結(jié)合，具體步驟如下：首先將CBS抗體結(jié)合到ProteinA/G探針上；然后加入轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后的HEK293H細胞裂解上清液，使裂解液中CBS蛋白與抗體結(jié)合；最后加入3-NT抗體，使其與發(fā)生硝基化修飾的CBS蛋白結(jié)合；每加一次樣品，要用樣品稀釋液清洗并致結(jié)合平衡狀態(tài)。

1.7 CBS蛋白表達和硝基化程度檢測常規(guī)提取HEK293H細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。Western Blot檢測，直接在蛋白樣品中加入5×SDS-PAGE Loading buffer，99 ℃，煮沸10 min。免疫沉淀檢測，在樣品中加入CBS抗體3μL，4 ℃搖床孵育4 h后，加入proteinA/G 40μL,4 ℃搖床孵育過夜。10 000 rpm/min， 4 ℃離心1 min，棄上清，取沉淀，即為CBS抗體結(jié)合的蛋白，同樣加入5×SDS-PAGE Loading buffer，99 ℃，煮沸10 min。各組蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，250 mA，90 min蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上， 5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。一抗CBS(1:1000)、3-NT(1∶1 000)和 GAPDH (1∶500)分別4 ℃孵育過夜。次日取出，TBST洗膜3次。加入山羊抗小鼠IgG/生物素標記的二抗(1∶4 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。用Bio-rad凝膠成像分析儀發(fā)光及分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 HEK293H細胞中CBS表達情況HEK293H細胞是一種常用的表達外源基因的細胞(圖1A)。本研究中，為了排除內(nèi)源性CBS的影響，利用免疫細胞化學染色檢測HEK293H細胞中CBS表達情況。結(jié)果顯示，HEK293H細胞本身沒有內(nèi)源性CBS的表達，可以用于后續(xù)實驗(圖1B)。

圖1 HEK293H細胞形態(tài)以及CBS表達情況A：HEK293H細胞形態(tài)圖(200×)；B：免疫細胞化學染色(400×)

2.2 WT、Y163A和Y223F CBS蛋白表達和活性檢測HEK293H細胞轉(zhuǎn)染 WT、Y163A和Y223F三種質(zhì)粒48 h后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白含量，以此確定三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示三種質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染進入HEK293H細胞，轉(zhuǎn)染效率可以達到80%(圖 2A)。Western Blot顯示HEK293H細胞本身沒有CBS表達，而轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒均能正常表達(圖2B)。連續(xù)循環(huán)光譜法檢測三種質(zhì)粒表達蛋白的活性，與HEK293H組相比，三種質(zhì)粒蛋白均具有活性(圖 2C)。

圖2 WT、Y163A和Y223F質(zhì)粒蛋白表達和活性A：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率(100×)；B：質(zhì)粒表達情況(n=3)；C：質(zhì)粒表達蛋白活性

2.3 Hcy對WT、Y163A和Y223F CBS蛋白硝基化程度和活性的影響為了探究Hcy對轉(zhuǎn)染 WT、Y163A和Y223F質(zhì)粒HEK293H細胞中CBS硝基化和活性的影響，本研究采用BLItz系統(tǒng)分析三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293H細胞裂解上清液中硝基化CBS與3-NT的結(jié)合。結(jié)果顯示，230 s時，CBS抗體結(jié)合到BLItz系統(tǒng)上的Protein A/G探針，當反應(yīng)平衡后，加入的三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293H細胞裂解上清液均可以結(jié)合到CBS抗體而不容易洗脫下來(470 s)。570 s時，WT、Y163A和Y223F CBS蛋白結(jié)合值分別為0.15、0.6和0.4 nm，給予3-NT抗體后，三種蛋白結(jié)合值上升為0.85、0.8和0.6nm，這提示給予Hcy刺激后，三種CBS蛋白均發(fā)生硝基化修飾，其中WT CBS硝基化程度最強，而且Y163A和Y223F突變均能減輕CBS的硝基化(圖 3A)，免疫沉淀檢測得到同樣結(jié)果(圖 3B)。CBS活性檢測表明：WT +Hcy組CBS活性明顯低于WT組(P<0.01)；與此同時，Y163A+Hcy組和Y223F+Hcy組CBS活性均高于WT+Hcy組(P<0.01,P<0.05,圖 3C)。

3 討 論

研究表明，Hcy代謝關(guān)鍵酶CBS活性降低是導致HHcy發(fā)生的重要原因[7]，而且其活性降低可能與HHcy過程中硝化應(yīng)激增強有關(guān)[8]，但具體機制尚不十分清楚。本研究利用細胞實驗研究Hcy誘導的硝化應(yīng)激增強與CBS活性降低之間的關(guān)系，并通過CBS酪氨酸殘基的突變探討可能的硝基化修飾位點。

圖3 Hcy對WT、Y163A和Y223F CBS蛋白硝基化程度和活性的影響A：BLItz檢測分子間相互作用；B：免疫沉淀檢測CBS硝基化程度(**:P<0.01 VS.WT,#:P<0.05 VS.WT,n=5)；C：Hcy刺激后蛋白活性(##:P<0.01 VS.WT,*:P<0.05,**:P<0.01 VS.WT+Hcy,n=5)

CBS 是由4個相同亞基構(gòu)成的同型四聚體[9]，每個亞基由551個氨基酸組成，該酶由三部分組成:氨基端的血紅素(heme)結(jié)合域、催化域(catalytic region)及羧基端的調(diào)控域(regulatory region)。CBS催化域(71～413 aa)是輔酶磷酸吡哆醛(PLP)以及底物同型半胱氨酸和絲氨酸的結(jié)合區(qū)，是調(diào)節(jié)CBS活性的重要區(qū)域[5]，而蛋白質(zhì)硝基化修飾主要發(fā)生在酪氨酸殘基。其中，Tyr163和Tyr223均位于催化域，這兩個酪氨酸殘基改變可以影響CBS活性[10]。為此，本研究選取文獻報道的CBS可能發(fā)生硝基化修飾的223位酪氨酸殘基(Tyr223)和另一個位于CBS催化區(qū)域的163酪氨酸位點(Tyr163)，在保證其正常表達和具有活性的前提下，分別突變?yōu)楸奖彼?phenylalanine,F)或丙氨酸(alanine,A)，構(gòu)建三個CBS表達質(zhì)粒：野生型(WT)及突變型(Y163A和Y223F)。為了保證質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)染并且良好表達，本研究選取工具細胞HEK293H。經(jīng)過檢測，HEK293H細胞沒有內(nèi)源性CBS表達，這樣可以排除內(nèi)源性CBS對后續(xù)實驗的影響。將構(gòu)建的三個CBS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HEK293H細胞后，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)染效率高，而且能夠表出具有活性的CBS蛋白，可以進行后續(xù)的Hcy刺激實驗研究。

硝化應(yīng)激(nitrative stress)是指由一氧化氮(nitric oxide,NO)或由NO衍生的活性氮與活性氧共同聯(lián)合發(fā)生的生物化學作用，使蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)，從而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用[11]。本研究中，在HEK293H細胞表達WT、Y163A和Y223F CBS蛋白后給予Hcy刺激，利用BLItz系統(tǒng)檢測硝基化CBS和3-NT抗體之間的相互作用。高濃度Hcy自身氧化產(chǎn)生的過量ONOO-使CBS發(fā)生硝基化修飾，當給予3-NT抗體，其不同的表達水平就表示三種CBS的硝基化程度。結(jié)果顯示Hcy使WT CBS發(fā)生硝基化修飾，而且Y163A和Y223F的突變減輕了CBS的硝基化。免疫沉淀實驗也得到同樣結(jié)果，這進一步驗證Tyr163和Tyr223可能是CBS發(fā)生硝基化修飾的位點。然而這些突變只有改善Hcy刺激的CBS活性降低才具有意義，因此本研究進一步檢測三種質(zhì)粒對于Hcy刺激的CBS活性影響。結(jié)果顯示，Y163A和Y223F的突變同樣改善Hcy刺激的CBS活性降低。由于Tyr163和Tyr223均位于CBS催化域，其調(diào)節(jié)酶活性與結(jié)合底物的能力有關(guān)。兩個酪氨酸殘基發(fā)生硝基化修飾會降低與底物的結(jié)合能力，進而影響CBS活性。

以上實驗表明HHcy過程中，高濃度的Hcy使CBS發(fā)生硝基化修飾而活性降低，其中酪氨酸殘基(Tyr163和Tyr223)可能是其發(fā)生硝基化修飾的位點。本研究提示在臨床上可以通過清除體內(nèi)過高的ONOO-以及降低硝化應(yīng)激水平來防治高同型半胱氨酸血癥的發(fā)生發(fā)展。

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Nitrationoftyr163andtyr223involvedinhomocysteine-mediatedcystathionineβ-synthaseinactivation

WANG Huanyuan,Xu Jiahui,ZHOU Yi,et al

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo explore the role of Tyr163 and Tyr223 nitration in homocysteine (Hcy) -mediated CBS inactivation.MethodsConstruct three CBS mutant plasmids (WT,Y163A and Y223F),by replacing two possible nitrated tyrosine residues to phenylalanine or alanine.HEK293H cells were transfected with three plasmids to induce the expression of reconstructed genes.After the stimulation of Hcy (500 μmol/L,24h),both the level of nitrated CBS and activity of CBS were determined in transfected cells.ResultsWT,Y163A and Y223F plasmids were all expressed successfully and the mutant CBS could have activities.Hcy induced high nitration of WT CBS,meanwhile,nitration of Y163A and Y223F CBS was decreased significantly (P<0.05,P<0.01).Compared with WT group,the CBS activity was decreased significantly (P<0.01) in WT +Hcy group.Compared with WT +Hcy group,the CBS activities were both increased in Y163A+Hcy and Y223F+Hcy group (P<0.01,P<0.05).ConclusionStimulation with homocysteine can lead to the decreased bioactivity of CBS,which is related with the CBS nitration at Tyr163,Tyr223 induced by the enhanced nitrative stress.

cystathionine β-synthase; nitration; homocysteine

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.007

2016-10-09；

2016-11-

國家自然科學基金(編號81370450).

*通訊作者，E-mail:wangwen@ccmu.edu.cn.

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秦旭平)