張金倩，陳洪

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

ACLY在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義

張金倩1，陳洪2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

目的探索ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)在結(jié)腸癌組織中的表達情況及其臨床病理學(xué)意義，為結(jié)腸癌的診治提供新思路。方法以50例結(jié)腸癌患者為研究對象，用免疫組織化學(xué)染色方法觀察結(jié)腸癌患者的癌組織及對應(yīng)的癌旁組織標本中ACLY的表達，并研究ACLY表達的臨床病理學(xué)意義。結(jié)果在結(jié)腸癌組織中ACLY表達顯著高于對應(yīng)的癌旁組織(P=0)；ACLY高表達與結(jié)腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P值分別為0、0.005及0.007)；與年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論ACLY在結(jié)腸腺癌組織中高表達,且與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；ACLY有望成為結(jié)腸癌診治的一個新靶點。

結(jié)腸癌； ATP檸檬酸裂解酶； 免疫組織化學(xué)； 臨床病理學(xué)； 相關(guān)性

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2015年8月至2016年6月期間在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院手術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實的50例結(jié)腸癌患者為研究對象。取其結(jié)腸癌組織標本，在4 ℃下以10%福爾馬林固定24 h，PBS沖洗，進行石蠟包埋。結(jié)腸癌標本取自腫瘤組織非壞死區(qū)，相應(yīng)癌旁組織取自距離癌組織邊緣5 cm以上的區(qū)域。結(jié)合臨床資料對結(jié)腸腺癌標本進行TNM分期,并行免疫組織化學(xué)染色[7]。人抗兔單克隆ATP檸檬酸裂解酶為英國Abcam公司產(chǎn)品(ab207504)，工作濃度為1∶150(用抗體稀釋液稀釋)。

1.2 入組與排除標準

入組標準:(1)因結(jié)腸癌首次就診；(2)病例資料完整；(3)未經(jīng)過特殊治療。排除標準:(1)非首次就診的病例；(2)有其他結(jié)腸疾病，例如炎癥性腸病、結(jié)腸結(jié)核等；(3)結(jié)腸多部位病變；(4)術(shù)前行新輔助放化療者；(5)患有其他部位惡性腫瘤。

1.3 組織免疫化學(xué)操作步驟

將石蠟切片，烤片，梯度脫蠟，自來水沖洗后抗原微波修復(fù)，PBS液浸泡。每張片子加50 μl稀釋好的ACLY抗體(一抗)，置冰箱4 ℃孵育過夜， PBS沖洗；每張片加50 μl稀釋好的二抗，室溫孵育25 min，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡下觀察染色的深淺，中止染色。蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，吹風(fēng)機吹干，中性樹膠封片后在鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判斷

實驗結(jié)果判定以正常山羊血清為陰性對照,空白對照為磷酸鹽緩沖液。用已知陽性組織作為陽性對照,應(yīng)用免疫組化法測定ACLY相對表達，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。對ACLY染色陽性部位采用免疫組化半定量分析方法進行陽性細胞計數(shù)。參照Fromowitz[8]方法，在200倍顯微鏡下觀察評分:陽性細胞數(shù)<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分；陽性強度分別以0、1、2、3分對應(yīng)于無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色。兩項記分相加[7]，總分<4分為低表達，≥4分為高表達。在雙盲法下由兩名病理醫(yī)師分別對每張切片進行計數(shù)，如果結(jié)果相差大于10%則重新計數(shù)[9]。

1.5 觀察指標

記錄患者姓名、年齡、術(shù)前診治經(jīng)過、手術(shù)時間、病理號碼、病理資料(分期分型均參照WHO分類方法進行)、ACLY水平等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ACLY在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，ACLY主要表達于細胞質(zhì)中，在細胞核中較少表達。ACLY在癌組織中高表達，而在癌旁組織中呈低表達或不表達(圖1)。ACLY在結(jié)腸癌組織的表達水平顯著高于癌旁組織(P=0)，見表1。

A.ACLY在癌旁正常組織中低表達；B.在TNM分期Ⅱ期中較高表達；C、D.在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中高表達

圖1結(jié)腸癌組織及癌旁組織中ACLY的表達二步法染色×200

表1 ACLY在結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中的表達情況例

2.2 ACLY在結(jié)腸癌中表達的臨床病理學(xué)意義

對結(jié)腸癌組織中ACLY的表達情況與臨床病理學(xué)參數(shù)進行評估結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACLY的高表達與結(jié)腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P值分別為0、0.005及0.007)，但與年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度之間無顯著相關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2結(jié)腸癌組織中ACLY表達情況與患者臨床病理資料的比較

臨床指標nACLY高表達低表達p值性別1 男25205 女25205年齡/歲0．765 ≤6017143 >6033267腫瘤大小/cm0．619 ≤639327 >61183分化程度0．139 高+中382810 低660淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0．005 有25241 無25169侵襲深度0 T1+T2615 T3+T444395TNM分期0．007 Ⅰ+Ⅱ26179 Ⅲ+Ⅳ24231

3 討 論

本研究通過免疫組化方法檢測并比較了50例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中ACLY表達情況，結(jié)果表明，ACLY在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)(P<0.05)。ACLY主要是細胞質(zhì)酶，集中存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但在細胞核中也發(fā)現(xiàn)過ACLY的存在。本研究也顯示，ACLY主要位于細胞質(zhì)中，與ACLY主要是胞質(zhì)酶的這一結(jié)論吻合。本研究從組織學(xué)水平發(fā)現(xiàn)ACLY在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)。近年Christensen等[18]從細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，抑制體外細胞株中ACLY能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡，研究表明，snoRNA宿主基因16 (SNHG16)在結(jié)腸癌患者中表達上調(diào)，SNHG16影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因。在臨床實踐中可以觀察到SNHG16及腫瘤脂質(zhì)代謝相關(guān)基因之間的關(guān)系，也可以觀察到癌組織中異常的從頭脂質(zhì)合成過程。敲除SNHG16可以抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)通路，如ACLY相關(guān)代謝途徑。

大量的研究已經(jīng)表明，遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織浸潤是結(jié)腸癌臨床病理分期最重要的自變量，結(jié)腸癌進展需要一個精確的階段評估。TMN分期是影響結(jié)腸癌進展及預(yù)后最重要的變量。在本研究中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲深度和TMN分期被確定為獨立的ACLY表達相關(guān)變量，故可以推測ACLY表達水平與結(jié)腸癌進展相關(guān)，檢測結(jié)腸癌組織中ACLY的表達情況可能為結(jié)腸癌臨床病理分期提供新的依據(jù)。

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