劉建坤 王洪武 陳剛 陳東進 鄒珩 張潔莉 周云芝 張楠

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基因芯片技術在煤工塵肺合并肺結核中的應用價值

劉建坤1王洪武1陳剛2陳東進3鄒珩1張潔莉1周云芝1張楠1

目的 研究基因芯片技術在煤工塵肺合并結核診斷中的應用。方法 所有病人均留取合格痰液，通過基因芯片技術做分枝桿菌菌種鑒定，如為結核分枝桿菌，則做耐藥基因檢測。結果 結果顯示，結核分枝桿菌陽性病人共15人，陽性率為60%，非結核分枝桿菌病人共10人，陽性率為40%，結核分枝桿菌中有1例對異煙肼耐藥，耐藥率為6.7%。在10例非結核分枝桿菌中，胞內分枝桿菌6例，占60%，結核分枝桿菌復合群1例，占10%，龜膿或膿腫分枝桿菌1例，占10%。結論 胞內分枝桿菌為非結核分枝桿菌主要致病菌種；基因芯片技術具有簡便、快速等特點，可準確區(qū)分結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌，并可鑒定至種或群，可做耐藥監(jiān)測，可為臨床診斷、治療提供有力的支持。

煤工塵肺；肺結核；基因芯片

資料與方法

一、一般資料

共入選了既往曾接受或正在接受正規(guī)抗結核治療的煤工塵肺病人116人為研究對象，年齡41歲至90歲之間，平均70.1歲，均為男性病人。所有病人晨起留取合格痰液通過基因芯片技術做分枝桿菌菌種鑒定，如為結核分枝桿菌，則做結核分枝桿菌耐藥基因檢測。

二、煤工塵肺的診斷標準

1986-2002年的病人采用GB5906— 86診斷標準,2002年后的病人采用GBZ70— 2002診斷標準。

三、煤工塵肺合并肺結核的入選條件

已明確診斷煤工塵肺的病人，凡符合一下條件之一者,均可入選:①既往曾行痰涂片或痰培養(yǎng)找到結核分枝桿菌者；②既往痰查結核陰性，但是有活動性肺結核典型胸部X射線表現(xiàn)者；③既往病理學檢查，診斷為肺結核者。

四、痰樣本采集及處理

以清晨第一口痰為宜。先用清水漱口，囑患者用力咳出深部的痰液于無菌樣本保存容器1份，密封，由博奧生物有限公司技術人員通過基因芯片技術做分枝桿菌菌種鑒定，如為結核分枝桿菌，則做結核分枝桿菌耐藥基因檢測。

五、基因芯片檢測方法：首先將痰液標本加入1-2倍4%NaOH，振蕩混勻，15-20分鐘后加入pH 6.8磷酸緩沖液混勻，離心后去上清，沉淀再加入0.5-1ml磷酸緩沖液混勻，接種。吸取等于或大于1個麥氏濁度的菌懸液10-20 μl于含核酸提取液的核酸提取管中，使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5分鐘，95℃水浴5分鐘，5000 rpm離心1分鐘，得到核酸。然后配制PCR反應體系，進行PCR擴增反應。將雜交緩沖液于50℃加熱使其完全融化，充分混勻后，在微量離心機中瞬時離心，按9 μl/管分裝。每管加入6 μl相應的PCR產物。將雜交反應混合物加熱至95℃(置于PCR儀或水浴鍋中)變性5 分鐘。雜交反應混合物變性完畢取出后，立即浸入冰水混合物中冰浴3分鐘。將雜交反應混合物從冰浴中取出，用微量移液器吹吸2次混勻，待白色絮狀沉淀(如有)消失后，經(jīng)蓋片的加樣孔加入13.5 μl雜交反應混合物，迅速蓋上雜交盒并密封。每個微陣列限加一份樣品，記錄芯片編號、微陣列位置及對應的樣品編號。立即將密封好的雜交盒水平放入50℃預熱的恒溫水浴鍋中。待雜交盒全部放入后計時120分鐘。雜交反應結束后，將雜交盒水平取出拆開，將芯片取出，進行芯片洗滌。然后于離心機中800 rpm離心5分鐘，甩干后掃描。最后使用LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀和相應軟件進行信號的讀取及結果判讀。

結 果

共入組116人，檢測出結核分枝桿菌為15人，占所有陽性人數(shù)的60%，非結核分枝桿菌共10人，占所有陽性人數(shù)的40%，總體陽性率為21.6%。結核耐藥情況：共做耐藥檢測15人次，其中有1人對異煙肼耐藥，其余對異煙肼及利福平均敏感，耐藥率為6.7%。(耐藥檢測結果)。

表1 基因芯片檢測分枝桿菌病原菌分布

表2 耐藥菌檢測結果

表3 基因芯片技術檢測非結核分枝桿菌病原菌情況

有2例未判，是因為低于測序靈敏度。

討 論

在臨床上，肺結核患者痰查結核分枝桿菌的陽性率偏低，而煤工塵肺并發(fā)肺結核的患者,痰查結核分枝桿菌陽性率更低。如何能提高痰查結核分枝桿菌的陽性率已成為臨床亟須解決的課題之一。該研究利用基因芯片技術檢測煤工塵肺合并肺結核患者，陽性率達21.6%。這與既往的研究結果相一致。Jeda A等[2]發(fā)現(xiàn)基因芯片檢測靈敏度比PCR電泳法高10倍。該研究使用博奧生物有限公司提供的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)，檢測靈敏度為1×103個菌/PCR反應。這與唐曙明等[3]的研究結果相一致，提高了結核分枝桿菌檢測的靈敏度。

該研究同時發(fā)現(xiàn)非結核分枝桿菌的發(fā)病率較高，占所有陽性人數(shù)的40%。這與既往研究成果相一致，我國結核病流行病學調查資料顯示非結核分枝桿菌分離率2010年高達22. 9%[1]，李昕潔等[4]也發(fā)現(xiàn)在臨床上非結核分枝桿菌的分離率較高，反映出我國當前非結核分枝桿菌感染率呈明顯上升的趨勢。

該研究結構顯示，在現(xiàn)有的煤工塵肺合并非結核分枝桿菌感染的病人中，胞內分枝桿菌所占比例為60%。這與Herndndez—Gardufio[5]、黃明翔等[6]的研究結果相一致。非結核分枝桿菌菌種快速、準確鑒定對于臨床疾病的診斷和治療具有重要意義，美國2007年“非結核分枝桿菌病診斷、治療與預防的指南”[7]中明確指出臨床分離的非結核分枝桿菌必須鑒定到菌種水平。因此如何能夠快速、準確地對致病性分枝桿菌做出診斷，是有效預防分枝桿菌病的發(fā)生、有效控制病情傳播的重要手段。傳統(tǒng)的結核分枝桿菌檢測方法主要有涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法和結核抗體金標法，其中抗酸染色涂片法簡便、快捷、價格低廉，但是敏感性低，不能區(qū)分結核分枝桿菌及非結核分枝桿菌；羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法耗時(2-8周)；結核抗體金標法則只能檢測結核分枝桿菌，而不能檢測非結核分枝桿菌檢測。

該研究所采用的博奧生物有限公司提供的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)則能同時檢測結核分枝桿菌及非結核分枝桿菌，是針對臨床常見的分枝桿菌設計特異性的PCR擴增引物及種屬特異性寡核苷酸探針，可鑒定出被測細菌的種類。除痰液外，膿液、分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液(包括腦脊液、胸腹水、心包液、關節(jié)液、膽汁等)、尿液等標本均可使用該試劑盒檢測，另外該試劑盒檢測耗時短，只需6-8小時即可出結果。

隨著一線藥物的使用，耐多藥結核分枝桿菌的感染有日益增多的趨勢。據(jù)WHO統(tǒng)計，肺結核位于傳染病死亡原因的第一位，耐藥菌株流行是結核病控制難度增加的主要原因[8-9]。耐多藥結核分枝桿菌是指患者感染的結核分枝桿菌在體外對異煙肼和利福平耐藥。煤工塵肺患者是肺結核的好發(fā)人群，全國塵肺流行病學調查結果報告塵肺結核合并率為19.35%[10]。因為煤塵對巨噬細胞的細胞毒作用，使大量巨噬細胞變性、壞死、崩解，加之外周血中T淋巴細胞減少，對結核分枝桿菌的吞噬、清除能力下降； 另外煤工塵肺病人晚期可出現(xiàn)肺間質纖維化，導致循環(huán)血容量不足，抗結核藥物不易達到病灶部位，難以達到有效殺菌濃度，以上各種原因綜合起來導致耐多藥結核分枝桿菌感染率日益增高。該研究因入選病人較少，15人次中共有1例對異煙肼耐藥，陽性率為6.7%，結果不具有代表性，但是也提示耐藥的嚴重性。

該研究所采用的博奧生物有限公司提供結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)，該試劑盒可檢測利福平及異煙肼的3個耐藥相關基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動子的野生型及不同突變型，檢測靈敏度為1×103個菌/PCR反應，該試劑盒檢同樣只需6-8小時即可出結果。

綜上所述，煤工塵肺病人是肺結核的高發(fā)人群，同時肺結核分枝桿菌的發(fā)病率逐年升高，在現(xiàn)有的煤工塵肺合并非結核分枝桿菌感染的病人中，胞內分枝桿菌所占比例為60%，為人類主要的非結核分枝桿菌致病性菌種；耐藥菌株流行是結核病疫情日趨嚴重的主要原因。基因芯片技術用于分枝桿菌的檢測具有簡便、快速、靈敏度高等特點，可準確區(qū)分結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌，并可鑒定至種或群，可做耐藥監(jiān)測，可為臨床診斷、治療提供有力的支持。

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Diagnostic value of gene clip for coal workers’ pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis

LIUJian-kun,WANGHong-wu,CHENGang,CHENDong-jin,ZOUHeng,ZHANGJie-li,ZHOUYun-zhi,ZHANGNan

ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China

Objective To explore the diagnostic value of gene clip for coal workers’ pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis. Methods All the patients were used to detect Mycobacterium tuberculosis by gene clip. Mycobacterium strains isolated from all the patients were identified by drug-resistant genes. Results 15 strains of Mycobaterium isolated were M.tuberculosis, accounting for 60%. 10 strains were non-tuberculosis Mycoberium, accounting for 40%. In the 15 strains of M.tuberculosis, 1 strain was resistant to isoniazid (6.7%). 6 strains were M. intracellulare of all the non-tuberculosis Mycobacterium (60%). 1 strain was M.tuberculosis complex group, accounting for 10%. 1 strain was M. chelonae (10%). 2 strains were non-tuberculosis Mycobacterium, but they couldn’t be identified. Conclusion Of all the coal workers’ pneumoconiosis complicated with non-tuberculosis Mycobacterium, the main strain is M. Intracellulare. The gene clip is simple, rapid, sensitive and specific for detecting tuberculosis. It could diagnose M.tuberculosis and non-tuberculosis Mycoberium and monitor drug resistance, which could be taken as a helpful method for diagnosis and treatment of pulmonary tuberculosis.

coal workers’ pneumoconiosis; pulmonary tuberculosis; gene clip

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.009

1. 100028 北京 煤炭總醫(yī)院呼吸內科 2. 066000 河北 秦皇島 國家煤礦安全監(jiān)察局塵肺病康復中心塵肺科 3. 102300 北京 北京京煤集團總醫(yī)院結核病科

煤工塵肺在我國已經(jīng)成為嚴重威脅煤礦工人健康的一種主要職業(yè)病。煤工塵肺患者是肺結核的好發(fā)人群，但是由于煤工塵肺結核在臨床表現(xiàn)上無特異性，且非結核分枝桿菌的感染率逐年提高[1]，所以早期診斷與治療煤工塵肺結核，已經(jīng)成為延緩煤工塵肺病情進展為一種重要手段。我們入選了既往曾接受或正在接受正規(guī)抗結核治療的煤工塵肺病人116人為研究對象，通過相關研究,了解基因芯片技術及其在煤工塵肺合并肺結核中的應用價值，為制定有效的防治措施提供依據(jù)。

2016-05-19]