曾慶飛，韋鑫，蔡一鳴，舒健虹，吳佳海，王小利

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

過表達FaSAMDC基因提高黑麥草屬植物的抗旱性和耐熱性

曾慶飛，韋鑫，蔡一鳴，舒健虹，吳佳海，王小利*

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

主要探討了在黑麥草屬植物中導(dǎo)入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(FaSAMDC)對轉(zhuǎn)基因植株抗旱耐熱性的提高效果，為培育黑麥草抗旱耐熱新品種提供種質(zhì)新材料。選擇黑麥草成熟種子為外植體，采用貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實驗室構(gòu)建的過表達載體以及黑麥草胚性愈傷組織高頻植株再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將克隆自高羊茅的FaSAMDC基因轉(zhuǎn)入貴州地區(qū)主栽品種多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內(nèi)，經(jīng)抗性篩選、PCR檢測和Southern雜交分析驗證，獲得45株特高與44株四季的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化頻率分別為2.93%和2.28%。抗旱耐熱試驗表明，在30 ℃高溫和中度干旱脅迫條件下，特高轉(zhuǎn)基因株系的根冠比比對照組培苗高出7.08%，葉片相對含水量(RWC)比對照高出13.12%，RWC降低幅度比對照少5.49個百分點；四季轉(zhuǎn)基因株系的根冠比比對照組培苗高出6.54%，RWC比對照高出12.54%，RWC降低幅度比對照少6.50個百分點，差異均達到顯著水平(P<0.05)，證明轉(zhuǎn)入FaSAMDC基因的黑麥草陽性株系的抗旱耐熱能力得到了明顯提高。形態(tài)與生長特征觀測結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因組培苗相比，轉(zhuǎn)基因株系的葉長、株高、主莖節(jié)數(shù)減小，葉寬、單株分蘗數(shù)增加，葉色變深，植株形狀趨向于葉片叢生的緊湊型，推測導(dǎo)入的FaSAMDC基因參與了基因表達、細胞分裂等生理功能的調(diào)節(jié)。

黑麥草；根癌農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；FaSAMDC基因；抗旱耐熱性

在世界各國種植的優(yōu)良牧草中，禾本科牧草約占43%的比重，其中黑麥草(Lolium)由于具有生長迅速、莖葉柔嫩光滑、綠色期長、耐牧性強、營養(yǎng)價值高且株型外觀優(yōu)美等優(yōu)點，已成為世界溫帶地區(qū)建立人工草地和補播天然草場的重要冷季型禾草，在草地草坪建植及飼草供給中占有很重要的地位[1]。但是另一方面，黑麥草對于35 ℃以上的高溫、干旱、-15 ℃以下的嚴寒以及土壤鹽堿均表現(xiàn)出較弱的耐受性，從而使其進一步的廣泛栽培和利用受到限制[2]。針對黑麥草存在的不足，對現(xiàn)有品種進行抗逆性改良，定向培育抗旱、耐熱、耐瘠薄的系列黑麥草優(yōu)良品種，對于改善區(qū)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)、促進“三元結(jié)構(gòu)農(nóng)業(yè)”和節(jié)糧型畜牧業(yè)的發(fā)展將起著重要作用。

進行黑麥草耐逆性改良，現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一條有效的重要途徑。在國外，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良黑麥草抗逆性的研究起步較早，選擇分生組織和穎果作為外植體，已建立了多年生黑麥草細胞懸浮系和原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，并獲得了轉(zhuǎn)基因組培苗[3-4]；另外通過碳化硅纖維介導(dǎo)法和基因槍法都獲得了轉(zhuǎn)基因植株[5-6]，只是未見轉(zhuǎn)基因新品種的選育報道。在國內(nèi)，劉萍等[7]應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將克隆自遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensis)的甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)轉(zhuǎn)移進多年生黑麥草，獲得了具有較強耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因株系Gsc-LP5；王奇麗等[8]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將報告基因GUS和抗除草劑基因BAR成功轉(zhuǎn)入多年生黑麥草，共計獲得52株T0代表現(xiàn)為Basra抗性的植株。而對于一年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道相對較少。

在植物的生長發(fā)育過程中，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)是一個與抗逆相關(guān)的重要功能基因。研究表明，當植物體內(nèi)多胺生物合成流量增加時，植株能產(chǎn)生對生物及非生物脅迫的耐受性[9]。而在多胺生物合成途徑中，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)能以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為底物催化形成脫羧S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)，為精氨和亞精氨的合成提供氨丙基，從而成為了亞精胺和精胺合成的關(guān)鍵酶。SAMDC能對多種外界條件的脅迫作出反應(yīng)，會受高鹽、高熱、干旱、寒冷及水分脅迫的誘導(dǎo)[10]。已有試驗證明，轉(zhuǎn)入康乃馨SAMDC的轉(zhuǎn)基因植株能獲得對非生物脅迫的廣譜抗性[11]；SAMDC調(diào)節(jié)合成的精胺積累有助于植物在經(jīng)受干旱后的快速復(fù)蘇[12]；SAMDC在轉(zhuǎn)基因番茄中的組成型表達能同時提高植株對生物及非生物脅迫的耐受性[13]，但還未見在黑麥草中超量表達SAMDC基因的研究報道。本研究利用貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實驗室構(gòu)建的過表達載體以及黑麥草組培再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將克隆自高羊茅的SAMDC基因?qū)攵嗷ê邴湶萏馗吆投嗄晟邴湶菟募镜幕蚪M內(nèi)，經(jīng)抗性篩選、PCR檢測、Southern雜交和抗旱耐熱性鑒定，獲得了一批耐逆性增強的轉(zhuǎn)基因植株。

1 材料與方法

1.1 材料

黑麥草外植體選用在貴州地區(qū)種植較為普遍的品種的成熟種子，一年生黑麥草特高于2014年購于貴陽霖卉園林綠化有限公司，多年生黑麥草四季由貴州省草業(yè)研究所保存。2013至2014年構(gòu)建的過表達載體是由經(jīng)貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實驗室改造過的植物表達載體pCAMBIA 1300與克隆自高羊茅黔草1號的SAMDC基因(FaSAMDC)所形成的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1300-FaSAMDC。該載體具有潮霉素(hygromycin，Hyg)和卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性，在FaSAMDC片段的兩側(cè)各具有一個CaMV 35S啟動子，主要表達框架如圖1所示。通過凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和GV3101中，經(jīng)PCR和酶切驗證獲得陽性克隆[14]。

圖1 構(gòu)建的過表達載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Schematicic diagram of constructed recombinant plasmid LB：左邊界 Left border；CaMV poly(A)：來自花椰菜花葉病毒35S啟動子的多聚腺苷酸尾 Polyadenylation from 35S promoter of cauliflower mosaic virus；HYG：抗潮霉素序列 Hygromycin resistant sequence；XhoI：限制性內(nèi)切酶XhoI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme XhoI；CaMV 35S promoter 1：來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子1 35S promoter 1 from cauliflower mosaic virus；EcoRI：限制性內(nèi)切酶EcoRI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme EcoRI；NsiI：限制性內(nèi)切酶NsiI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme NsiI；SphI：限制性內(nèi)切酶SphI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme SphI；PstI：限制性內(nèi)切酶PstI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme PstI；FaSAMDC：插入的高羊茅腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因 Inserted S-adenosylmethionine decarboxylase gene from Festuca arundinacea；KpnI：限制性內(nèi)切酶KpnI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme KpnI；SacI：限制性內(nèi)切酶SacI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme SacI；NrVI：限制性內(nèi)切酶NrVI識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme NrVI；CaMV 35S promoter 2：來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子2 35S promoter 2 from cauliflower mosaic virus；HindⅢ：限制性內(nèi)切酶HindⅢ識別序列 Sequence recognized by restriction enzyme HindⅢ；LacZa：β-半乳糖苷酶a基因 Gene A of beta-galactosidase；RB：右邊界 Right border.

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：特高的愈傷組織誘導(dǎo)采用CC+7 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA，四季采用CC+5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA；愈傷組織繼代培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.25 mg/L CuSO4+1.0 g/L CH； 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基采用YEB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨+1 g/L酵母抽提物+5 g/L蔗糖+0.5 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0；農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基：AA+1.0 mg/L 2,4-D+100 μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.2；預(yù)培養(yǎng)基：MS+10 g/L葡萄糖+3 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+100 μmol/L乙酰丁香酮+0.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3+8 g/L瓊脂粉；液體預(yù)培養(yǎng)基：MS+30 g/L麥芽糖+10 g/L葡萄糖+3 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+100 μmol/L乙酰丁香酮+0.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3；共培養(yǎng)基：MS+5 mg/L 2,4-D+0.05 mg/L 6-BA+100 μmol/L乙酰丁香酮+0.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3+8 g/L瓊脂粉；選擇培養(yǎng)基：MS+10 g/L葡萄糖+3 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+150 mg/L特美汀+40 mg/L潮霉素+8 g/L瓊脂粉；分化篩選培養(yǎng)基：特高轉(zhuǎn)化苗采用 MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ+40 mg/L潮霉素+8 g/L瓊脂粉，四季轉(zhuǎn)化苗采用 MS+6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+5 mg/L KT+40 mg/L潮霉素+8 g/L瓊脂粉；生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+8 g/L瓊脂粉。

1.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑麥草

遺傳轉(zhuǎn)化試驗于2015年進行。2個品種均以剝?nèi)シf殼后切除1/3胚乳端的種子作為外植體，分別接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在(26±1) ℃黑暗條件下培養(yǎng)40 d形成愈傷組織，接著轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基上，每次培養(yǎng)25 d，通過2次繼代培養(yǎng)后獲得胚性愈傷組織，然后按下列步驟進行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.1受體愈傷組織預(yù)培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接至預(yù)培養(yǎng)基上，(25±1) ℃無光照條件下預(yù)培養(yǎng)3 d后在液體預(yù)培養(yǎng)基中振蕩預(yù)培養(yǎng)2 d，以促進愈傷組織的活化并使之處于感受狀態(tài)。

1.2.2農(nóng)桿菌感染與共培養(yǎng) 在YEB平板上挑取活化的已導(dǎo)入過表達載體pCAMBIA 1300-FaSAMDC的根癌農(nóng)桿菌EHA105的單菌落，接種于含Hyg和Kan各50 mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為1.0，5000 r/min離心10 min收集菌體，用農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基重懸成OD600為0.7的懸浮液。將預(yù)培養(yǎng)的胚性愈傷組織浸入懸浮液30 min，用無菌濾紙吸干菌液，轉(zhuǎn)接至共培養(yǎng)基上，(25±1) ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d。

1.2.3抗性愈傷組織篩選 共培養(yǎng)后的愈傷組織先用0.1 mol/L甘露醇無菌液振蕩清洗，再用含200 mg/L特美汀的無菌水洗滌3～5次，吸干水分后轉(zhuǎn)移到Hyg濃度為40 mg/L的選擇培養(yǎng)基上，(25±1) ℃暗培養(yǎng)4周。將長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接至新的含相同濃度Hyg的選擇培養(yǎng)基上，連續(xù)進行2輪繼代篩選，每20 d轉(zhuǎn)接一次。

1.2.4抗性植株再生 將3輪篩選后的抗性愈傷組織分別轉(zhuǎn)移至特高與四季各自的篩選分化培養(yǎng)基上，在(25±1) ℃、光照時間12 h/d、光強2000 lx的培養(yǎng)室中進行分化培養(yǎng)。當分化形成的不定芽長至2 cm左右時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，待幼根長出且再生苗株高達到6～8 cm時，在15～25 ℃室溫條件下揭開瓶蓋煉苗2～3 d后，將再生苗從瓶內(nèi)小心取出，清水洗凈瓊脂，移栽至盛有營養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1)的花缽中。

1.3 抗性植株的PCR檢測

轉(zhuǎn)化苗的PCR檢測、Southern blot 分析和抗旱耐熱鑒定試驗于2016年開展進行。

采用常用的CTAB法提取轉(zhuǎn)化植株及對照非轉(zhuǎn)化組培苗的葉片總DNA，根據(jù)潮霉素B基因的片段序列設(shè)計一對特異引物，正向引物F1：TTCTGCGGGCGATTTGTG，反向引物R1：AGCGTCTCCGACC TGATG。以提取的基因組DNA為模板，每個反應(yīng)體系總體積20 μL，采用Touch down PCR方法進行擴增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度減1 ℃；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用1.2%凝膠電泳檢測。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交分析

在特高和四季的T0轉(zhuǎn)基因植株中分別隨機選擇4株轉(zhuǎn)化苗和1株非轉(zhuǎn)化對照組培苗，CTAB法大量提取基因組DNA。經(jīng)分光光度法檢測合格后各取30 μg基因組DNA，用EcoR I酶切完全后在0.8%瓊脂糖凝膠中4 ℃條件下電泳(100 V，5 min，接著70 V約5 h)，再轉(zhuǎn)移到HybondTM-N+尼龍膜上。以潮霉素抗性標記基因HYG片段(877 bp)作為探針，探針標記、分子雜交和信號檢測采用“DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit”試劑盒(上海浩洋生物科技有限公司)說明書中的操作步驟進行。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱耐熱性鑒定

采用根冠比測定法[15]以及苗期葉片相對含水量測定法[16]，以組培產(chǎn)生的非轉(zhuǎn)基因苗為對照，對陽性株系的抗旱耐熱性進行鑒定。

根冠比測定：隨機選取特高轉(zhuǎn)基因株系、四季轉(zhuǎn)基因株系以及特高與四季非轉(zhuǎn)基因組培苗各3株，移栽于花缽中后轉(zhuǎn)入30 ℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。正常澆水12 d后接著作連續(xù)斷水12 d的中度干旱脅迫處理。將連同根系的整個植株帶土取出，沖凈后用吸水紙吸取根表面的水分，將地上、地下部分分離，于105 ℃殺青30 min，在恒溫85 ℃下烘干12 h至恒重后采用萬分之一電子天平稱重。

根冠比(R/S)=地下根系干重(root)/地上部干重(shoot)

葉片相對含水量(RWC)的測定：在盆栽苗中選擇苗高、生長狀況一致的特高和四季轉(zhuǎn)基因苗以及組培產(chǎn)生的非轉(zhuǎn)基因的特高和四季苗各6株，轉(zhuǎn)入30 ℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。正常澆水12 d后各選3株測定其葉片相對含水量，計算平均值；剩下3株作連續(xù)斷水12 d的中度干旱脅迫處理后再分別測定葉片相對含水量，計算各株系葉片相對含水量變化值的平均值。

RWC數(shù)值測定采用鮮重法：剪取整株黑麥草葉片，稱出鮮重(Wf)；再將葉樣浸入蒸餾水中24 h，取出后用吸水紙擦干樣品表面水分，稱出飽和重(Wt)；最后將葉樣放入已升溫至105 ℃的烘箱中殺青15 min，然后于80 ℃下烘至恒重，采用萬分之一電子天平稱出干重(Wd)。

葉片相對含水量 RWC=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100%

1.6 轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)與生長觀察

將組培形成的非轉(zhuǎn)化對照植株和轉(zhuǎn)基因株系首先移植于花缽中，2周后移栽至溫室大棚內(nèi)，25 ℃條件下控溫生長。60 d后每組各選擇5個植株，觀察記錄它們的生長、分蘗、葉色、株型等形態(tài)特征，分別測定各類株系的株高、葉片長度、葉片寬度、節(jié)數(shù)與單株分蘗數(shù)，計算各測定項目的平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

對各試驗處理的數(shù)據(jù)，采用Excel統(tǒng)計分析軟件、SPSS數(shù)據(jù)處理軟件分別進行統(tǒng)計分析和顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

利用優(yōu)化建立的多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的高頻組培再生體系，分別以2個品種的成熟種子為外植體，將外植體經(jīng)過前處理后分別接種于各自的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，40 d后選擇生長狀態(tài)良好、致密均一的愈傷組織轉(zhuǎn)接至統(tǒng)一的繼代培養(yǎng)基中，通過2次共50 d的繼代培養(yǎng)后，挑選顏色鮮黃、生長旺盛且結(jié)構(gòu)密實的Ⅱ型胚性愈傷組織(圖2A)進行3 d的預(yù)培養(yǎng)和2 d的振蕩培養(yǎng)，接著與已導(dǎo)入過表達載體pCAMBIA 1300-FaSAMDC的根癌農(nóng)桿菌EHA105共培養(yǎng)(圖2B)，經(jīng)Hyg篩選6周后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選分化培養(yǎng)基上，待形成不定芽后(圖2C)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中(圖2D)，3周后移栽至盛有營養(yǎng)土的花缽中(圖2E、F)，最終獲得131棵抗性植株。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

選取移栽成活的131棵抗性植株，提取葉片總DNA，以EHA105-p1300菌作陽性對照，非轉(zhuǎn)化的特高和四季苗的葉片總DNA為陰性對照，用設(shè)計的引物對擴增抗潮霉素B基因的部分片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，其中有45株特高轉(zhuǎn)基因抗性植株和44株四季轉(zhuǎn)基因株系擴增出了與預(yù)期長度相吻合的877 bp的目的片段，非轉(zhuǎn)化對照植株均未出現(xiàn)相應(yīng)擴增帶(圖3)，表明FaSAMDC基因已經(jīng)整合進入到2個品種的黑麥草基因組中。特高和四季的轉(zhuǎn)化頻率分別為2.93%和2.28%(表1)。

2.3 轉(zhuǎn)基因株系的Southern blot分析

在經(jīng)PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株中，為進一步確證外源的FaSAMDC基因已整合到黑麥草基因組中，分別隨機選擇4株特高轉(zhuǎn)化苗(編號FT1～FT4)和4株四季轉(zhuǎn)化苗(編號FS1～FS4)，提取葉片總DNA，并以非轉(zhuǎn)化的特高和四季苗的葉片總DNA為對照，經(jīng)EcoR I酶切后用含抗潮霉素B基因部分片段的探針進行Southern雜交，結(jié)果見圖4和圖5。雜交結(jié)果顯示，多花黑麥草特高的4個35S:SAMDC轉(zhuǎn)化子(FT1～FT4)均出現(xiàn)了明顯的單一雜交條帶，對照沒有雜交帶，推測4個35S:SAMDC轉(zhuǎn)化子均為單拷貝HYG陽性植株；而多年生黑麥草四季的4個35S:SAMDC轉(zhuǎn)化子中(FS1～FS4)，F(xiàn)S1和FS4兩個轉(zhuǎn)化子的雜交條帶較為明顯，F(xiàn)S2與FS3的條帶較弱，對照也沒有條帶；其中FS1、FS3和FS4為單一條帶，推測它們?yōu)閱慰截惖腍YG陽性植株，而FS2號出現(xiàn)了微弱的2個條帶，推測其可能為雙拷貝的HYG陽性株系。

2.4 轉(zhuǎn)基因陽性株系的抗旱耐熱能力鑒定

2.4.1根冠比測定結(jié)果 當轉(zhuǎn)基因陽性株系與非轉(zhuǎn)化的組培對照苗在設(shè)定的高溫干旱脅迫環(huán)境中生長24 d以后，分別分離地上部與地下部，烘干稱重，測定每一植株的根冠比，并計算每一材料根冠比3個重復(fù)的平均值，結(jié)果見表2。從表中看出，2個品種的轉(zhuǎn)基因陽性株系經(jīng)高溫干旱脅迫后其根冠比值均高于相應(yīng)的對照株系，其中特高轉(zhuǎn)基因株系比對照苗高出7.08%，四季轉(zhuǎn)基因株系比對照高出6.54%，差異均達到顯著水平(P<0.05)。

圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生Fig.2 Agrobacterium-mediated transformation of ryegrass and regeneration of the transformed plantlets A：誘導(dǎo)出的特高胚性愈傷組織；B：特高胚性愈傷組織與根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)；C：四季抗性愈傷組織不定芽的分化；D：生根培養(yǎng)基中特高和四季抗性植株生根；E：特高和四季抗性植株移栽至花缽并成活；F：特高和四季抗性植株在人工氣候室內(nèi)生長。 A: Induced embryogenic callus of Tetragold; B: Co-culture of embryogenic callus of Tetragold and Agrobacterium tumefaciens; C: Differentiation of adventitious buds from resistant callus of Four seasons; D: Hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons growing in rooting medium; E: Hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons potted in soil successfully; F: Hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons growing in climatic laboratory.

圖3 轉(zhuǎn)基因黑麥草抗性植株潮霉素B基因的PCR檢測Fig.3 PCR analysis of B gene of hygromycin in putative transgenic plants of ryegrass M：DNA分子量；+：EHA105-p1300菌(陽性對照)；-：非轉(zhuǎn)化植株(陰性對照)；1～9：特高和四季轉(zhuǎn)基因抗性植株。 M: DNA marker; +: Strain EHA105-p1300 as positive control; -: Non-transformed plant as negative control; 1-9: Transgenic hygromycin-resistant plants of Tetragold and Four seasons.

表1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)2個黑麥草品種的轉(zhuǎn)化頻率Table 1 Transgenic frequency of two ryegrass cultivars by Agrobacterium tumefaciens

圖4 特高轉(zhuǎn)基因植株潮霉素B基因的Southern雜交分析Fig.4 Southern analysis of B gene of hygromycin in putative transgenic plants of Tetragold

圖5 四季轉(zhuǎn)基因植株潮霉素B基因的Southern雜交分析Fig.5 Southern analysis of B gene of hygromycin in putative transgenic plants of Four seasons

CK-T：特高非轉(zhuǎn)化植株(陰性對照)；FT1～FT4：特高轉(zhuǎn)基因植株。CK-T: Non-transformed Tetragold plant as negative control; FT1-FT4: Transgenic hygromycin-resistant plants of Tetragold.

CK-S：四季非轉(zhuǎn)化植株(陰性對照)；FS1～FS4：四季轉(zhuǎn)基因植株。CK-S: Non-transformed Four seasons plant as negative control; FS1-FS4: Transgenic hygromycin-resistant plants of Four seasons.

表2 特高、四季轉(zhuǎn)基因株系與對照苗根冠比測定Table 2 The root to shoot ratios of transgenic lines of Tetragold and Four seasons and control seedlings

較CK高：Increase rate compared with CK.同行不同大寫字母表示轉(zhuǎn)基因株系與對照苗之間差異達極顯著水平(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different capital letters after data in the same row indicate the significant difference between transgenic lines and control seedlings atP<0.01 level, different lowercase letters indicate significant differences atP<0.05 level. The same below.

2.4.2葉片相對含水量(RWC)測定 經(jīng)設(shè)置的30 ℃高溫以及正常澆水和中度干旱脅迫處理后，先后對轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因組培對照苗3個重復(fù)的葉片相對含水量進行了測定，計算平均值(表3)。結(jié)果顯示，在高溫及正常澆水條件下，特高轉(zhuǎn)基因株系的葉片相對含水量比對照高出7.63%，四季轉(zhuǎn)基因株系比對照高出6.04%，2個品種轉(zhuǎn)基因株系與對照組培苗的RWC差異均達顯著水平(P<0.05)；而在高溫和連續(xù)斷水12 d的中度干旱脅迫處理以后，特高轉(zhuǎn)基因株系的葉片相對含水量比對照要高出13.12%，四季轉(zhuǎn)基因株系比對照高出12.54%，RWC差異都達到極顯著水平(P<0.01)；同時，在經(jīng)受中度干旱脅迫后，特高與四季2個品種轉(zhuǎn)基因株系的RWC降低幅度分別比對照少5.49和6.50個百分點，說明所獲得的轉(zhuǎn)基因株系比對照組培苗具有更強的抗旱耐熱能力。

表3 特高、四季轉(zhuǎn)基因株系與對照苗葉片相對含水量測定Table 3 The leaf relative water content of transgenic lines of Tetragold and Four seasons and control seedlings %

較CK高或低：Increase or decrease rate compared with CK.

2.5 轉(zhuǎn)基因陽性株系的形態(tài)與生長特征

對轉(zhuǎn)基因陽性株系與同批次的非轉(zhuǎn)基因組培苗在移栽60 d后苗期的形態(tài)特征考察結(jié)果見表4。觀測結(jié)果顯示，與對照相比，特高和四季轉(zhuǎn)基因株系的株高與節(jié)數(shù)均有所降低，葉片寬度增加而長度略有減小，單株分蘗數(shù)增加，葉色變深，株型更趨向于葉片叢生的緊湊型。說明2個品種轉(zhuǎn)基因株系的形態(tài)與生長特征與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M培苗存在著差異，F(xiàn)aSAMDC基因的過量表達對轉(zhuǎn)基因植株的垂直生長具有一定的抑制作用，但能增加株系的單株分蘗數(shù)，且葉色、株型的變化更有利于植株抵抗干熱的環(huán)境條件。

表4 轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)化對照植株的形態(tài)與生長特征Table 4 Morphological and growth characteristics of transgenic lines of Tetragold and Four seasons and control plants

3 討論

國內(nèi)外關(guān)于黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的研究始于20世紀80年代，前期采用的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要是硅碳纖維轉(zhuǎn)導(dǎo)法、原生質(zhì)體直接轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA法和基因槍法等，并獲得了少量的轉(zhuǎn)基因多花黑麥草植株[17-18]。不過這些方法普遍存在著受基因型限制較大、轉(zhuǎn)化頻率較低、外源基因易于多拷貝插入、存在基因沉默與共抑制現(xiàn)象、后代株系呈非孟德爾遺傳、再生植株不育等系列問題，后來建立起來的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法在一定程度上克服了這些缺點[19]，并已逐漸成為作物遺傳轉(zhuǎn)化的主要途徑之一[20]。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是以愈傷組織再生體系作為受體系統(tǒng)的，黑麥草作為禾本科牧草對愈傷誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化再生都不敏感，被稱為組織培養(yǎng)頑固種類[21]。為獲得較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率，在轉(zhuǎn)化實驗開展前，課題組專門針對多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季2個貴州地區(qū)的黑麥草主栽品種，先后進行了種子外植體的預(yù)處理、愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基組分、抗生素的臨界濃度、愈傷組織分化培養(yǎng)基組分、預(yù)培養(yǎng)與共培養(yǎng)基組分、菌液濃度、浸染方式、農(nóng)桿菌菌株與胚性愈傷組織的共培養(yǎng)時間、抑菌處理等內(nèi)容的系統(tǒng)對比試驗，優(yōu)化建立了2個黑麥草品種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，保證了本研究中FaSAMDC基因轉(zhuǎn)化實驗的順利進行。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，由于絕大多數(shù)單子葉植物都不能積累足夠的酚類物質(zhì)，難以激活農(nóng)桿菌的侵染能力，從而不能成為農(nóng)桿菌的天然寄主[22]。乙酰丁香酮作為一種酚類化合物具有潛在的誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的作用，已被證明是一種能夠提高單子葉植物和部分雙子葉植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的有效誘導(dǎo)物[23]。甘露醇作為一種中性單糖，也是一種農(nóng)桿菌vir區(qū)基因的誘導(dǎo)劑，同時還可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透壓而有助于遺傳轉(zhuǎn)化。另外，在單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌浸染后極易造成愈傷組織的褐化壞死，而硝酸銀作為一種強還原劑，能夠降低愈傷組織的氧化率、弱化甘露醇的高滲透作用并抑制農(nóng)桿菌的過度生長，在不影響T-DNA轉(zhuǎn)移和整合的同時，還能促進愈傷組織不定芽的分化，從而顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[24]。因此，本研究在預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)基中分別添加了100 μmol/L乙酰丁香酮、30 g/L甘露醇和5 mg/L的硝酸銀，并獲得了較為理想的轉(zhuǎn)化效果，轉(zhuǎn)化效率分別達到2.93%和2.28%?？偦蚪M單酶切的Southern雜交結(jié)果顯示，在隨機挑選的多花黑麥草特高的4個35S:SAMDC轉(zhuǎn)化子中，F(xiàn)aSAMDC基因都是以單拷貝形式進入黑麥草基因組中的，而在隨機選取的多年生黑麥草四季的4個轉(zhuǎn)化子中，其中1個株系的FaSAMDC基因則以雙拷貝數(shù)整合進入到了染色體中。在轉(zhuǎn)基因株系中，外源基因無論以單拷貝或雙拷貝形式存在都能正常表達[25]，因此可以預(yù)見，轉(zhuǎn)入FaSAMDC基因的黑麥草其抗逆性都會得到不同程度的增強。

試驗轉(zhuǎn)入FaSAMDC基因的目的是為了獲得適合在貴州地區(qū)廣泛種植的抗旱耐熱性增強的黑麥草種質(zhì)新材料。為了檢測所獲材料的抗旱耐熱能力，本研究對2個品種的轉(zhuǎn)基因株系分別進行了經(jīng)高溫干旱脅迫處理后根冠比和葉片相對含水量的對比測定。根冠比是衡量作物地上部分與地下部分生長發(fā)育協(xié)調(diào)程度的重要指標，高溫干旱條件下，根冠比較高的植株具有更強的供應(yīng)地上部生長所需養(yǎng)分的能力，有利于作物抵御高溫干旱并保持較好的生長狀況。在一定范圍內(nèi)，根冠比越大，抗旱耐熱能力越強[26]。由于根冠比的測定會耗費整個植株，因而本研究只在每個品種的陽性轉(zhuǎn)化株系中隨機選擇3個株系用于測定。測定結(jié)果顯示，2個品種轉(zhuǎn)基因株系的根冠比與非轉(zhuǎn)基因組培苗的差異均達到顯著水平。說明SAMDC基因的過量表達，一方面能通過增加植株體內(nèi)亞精胺、精胺和內(nèi)源腐胺的合成含量而提高植物的抗逆性[27]，同時也還會通過增加植株的根冠比值來提高其對高溫干旱的耐受性。葉片相對含水量是反映植物水分狀況以及保水能力的另一個重要指標，它能夠密切反映出水分狀況與蒸騰作用之間的平衡關(guān)系以及植物對高熱干旱環(huán)境脅迫的抵御能力[16]。相對含水量較高的葉片具有較高的滲透調(diào)節(jié)功能和較強的抗旱耐熱性，葉片相對含水量與植物的抗旱耐熱能力呈正相關(guān)關(guān)系[28]；經(jīng)過高熱和水分脅迫處理后，葉片相對含水量的降低幅度愈小，植株的抗旱耐熱能力愈強[29]。本研究獲得的2個品種的轉(zhuǎn)基因株系，無論是在高溫及正常水分條件下，還是在高溫及水分脅迫處理后，其葉片相對含水量都要顯著高于對照組培苗，而且經(jīng)中度干旱脅迫后，葉片相對含水量的降幅也明顯低于對照。這進一步證實，轉(zhuǎn)入FaSAMDC基因的黑麥草種質(zhì)新材料，其抗旱耐熱能力確信得到了有效的提高。

SAMDC基因的超量表達，不僅能提高植株的抗旱耐熱性能，同時還能增強對于鹽及其他滲透脅迫的適應(yīng)能力，并具有控制基因表達、細胞分裂等多種生理功能[30]，因此在一定程度上可以改變植株的形態(tài)與生長特征。本研究中轉(zhuǎn)入了FaSAMDC基因的黑麥草株系，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰缦啾?，葉長株高略有減小，葉片寬度與單株分蘗數(shù)有所增加，葉色變深，植株形狀更趨向于葉片叢生的緊湊型。這種形態(tài)與生長特征的變化，應(yīng)該是外源SAMDC基因多種耐逆性機制共同作用的結(jié)果，而且可能更有利于提高植株對非生物脅迫的廣譜抗性。

4 結(jié)論

在前期優(yōu)化建立的多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季2個品種高效組培再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，以2個黑麥草貴州主栽品種的成熟種子為外植體，通過胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)與根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，克隆自高羊茅與抗逆功能相關(guān)的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(FaSAMDC)被導(dǎo)入多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內(nèi)。經(jīng)抗性篩選、PCR檢測和Southern blot分析，確證獲得45株特高和44株四季轉(zhuǎn)基因陽性株系，轉(zhuǎn)化頻率分別達到2.93%和2.28%。在30 ℃高溫和中度干旱脅迫條件下，2個品種轉(zhuǎn)基因植株的根冠比與非轉(zhuǎn)基因組培對照苗的差異達到顯著水平(P<0.05)，葉片相對含水量則呈現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)；經(jīng)高溫干旱脅迫后，特高與四季轉(zhuǎn)基因株系葉片相對含水量的降低幅度比對照植株分別少出5.49%和6.50%，證明轉(zhuǎn)入FaSAMDC基因陽性株系的抗旱耐熱能力在出發(fā)材料的基礎(chǔ)上得到了明顯提高。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晗啾?，轉(zhuǎn)基因株系的葉長、葉寬、葉片顏色、主莖節(jié)數(shù)、株高、單株分蘗數(shù)及植株形狀均有所變化，推測導(dǎo)入的FaSAMDC基因參與了植株體內(nèi)基因表達、細胞分裂等生理功能的調(diào)節(jié)。性狀改良試驗達到了通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗旱耐熱性增強的黑麥草種質(zhì)新材料的研究目的。

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EnhancingdroughtandheattoleranceinLoliumspp.throughoverexpressionoftheFaSAMDCgene

ZENG Qing-Fei, WEI Xin, CAI Yi-Ming, SHU Jian-Hong, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li*

GuizhouInstituteofPrataculture,GuizhouAcademyofAgriculturalSciences,Guiyang550006,China

To obtain new ryegrass germplasm with enhanced drought and heat tolerance a genetic transformation experiment using plants from the genusLoliumwas conducted. By using mature seeds of ryegrass as explants and adoption of the overexpression vector,tissue culture and regeneration system of ryegrass, and genetic transformation mediated byAgrobacteriumtumefaciens, the S-adenosylmethionine decarboxylase gene cloned fromFestucaarundinacea(FaSAMDC) was introduced into the genome of ‘Tetragold’ annual ryegrass and ‘Four Seasons’ perennial ryegrass. Eighty-nine transgenic plants (45 Tetragold and 44 Four Seasons) were regenerated from independent resistant calli, which were confirmed by antibiotic resistance screening, PCR assay and southern hybridization analysis; the transgenic frequency was 2.93% and 2.28%, respectively. Drought and heat resistant tests under high temperature (30 ℃) and moderate drought stress showed that in Tetragold, the root to shoot ratio was 7.1% higher, leaf relative water content (RWC) 13.1% higher and the RWC descent scope 5.5% lower than the controls; for transgenic Four Seasons plants the root to shoot ratio was 6.5% higher, RWC 12.5% higher and the RWC descent scope 6.5% lower than the control; differences between transgenic plants and controls were all statistically significant (P<0.05), indicating that drought and heat resistance in transgenic plants was significantly improved. Observations of morphological and growth characteristics showed that, compared with non-transgenic plants, leaf length, plant height and main stalk pitch number of transgenic plants were lower but leaf width and tiller number per plant were higher. Leaves of transgenic plants were darker in colour and plants tended to become compact with tufted leaves suggesting that the insertedFaSAMDCgene was involved in the regulation of physiological function, such as gene expression and cell division. The transgenic material developed in the study could be used as foundation for the cultivation of new ryegrass varieties with enhanced drought and heat resistance.

ryegrass;Agrobacteriumtumefaciens; genetic transformation;FaSAMDCgene; drought and heat tolerance

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2017-05-02；改回日期：2017-07-03

貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(黔科合NY[2013]3060號)，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動基金(2013-06)，黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項[(2014)010號]，貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目(黔科合人才[2016]4024)和貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設(shè)項目(黔科合平臺人才[2016]5617)資助。

曾慶飛(1969-)，男，貴州德江人，副研究員，博士。E-mail:zengqingfei2008@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:wangxiaolizhenyuan@126.com