曾武清，陳柳嬋，曾瑞珍，易懋升，宿慶連，郭和蓉，黎揚(yáng)輝，謝 利

（1.廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

麗影和紅韻蝴蝶蘭快速繁殖試驗(yàn)

曾武清1，陳柳嬋2，曾瑞珍2，易懋升1，宿慶連1，郭和蓉2，黎揚(yáng)輝1，謝 利2

（1.廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

以花梗腋芽為材料，研究了蝴蝶蘭新品種麗影和紅韻的快速繁殖技術(shù)。結(jié)果表明，消毒時間對營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率有顯著影響，0.1%HgCl2消毒8 min的紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率最高，激素對營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率影響不顯著。6-BA濃度、有機(jī)附加物和芽數(shù)對叢生芽增殖影響顯著，當(dāng)6-BA濃度為8.0 mg/L時，麗影和紅韻芽增殖系數(shù)最高，分別為2.31和2.22；添加椰汁更有利于減輕褐變，提高增殖系數(shù)；單芽接入的增殖系數(shù)最高。激素對生根率無顯著影響，但對平均根數(shù)和苗高有顯著影響，在含6-BA 0.1 mg/L＋NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基上試管苗株高最高，平均根數(shù)最多。以松樹皮為基質(zhì)，麗影和紅韻蝴蝶蘭試管苗移栽成活率分別為91.58%和87.27%。

蝴蝶蘭；新品種；組織培養(yǎng)；快速繁殖；叢生芽

蝴蝶蘭是蘭科蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis Blume）植物，市場前景廣闊，其產(chǎn)業(yè)被稱為“農(nóng)業(yè)中的IT產(chǎn)業(yè)”［1］。在我國，蝴蝶蘭已列入植物新品種保護(hù)名錄，但目前商業(yè)化生產(chǎn)的蝴蝶蘭品種主要是臺灣或國外選育的品種，因此加快蝴蝶蘭新品種選育和推廣對我國蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

種苗生產(chǎn)是新品種推廣的基礎(chǔ)，蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)主要采用組織培養(yǎng)快速繁殖方法［2-3］。對蝴蝶蘭種苗工廠化生產(chǎn)技術(shù)研究的結(jié)果表明，不同蝴蝶蘭品種工廠化繁殖效率、適宜的快繁途徑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不完全相同［4-19］。因此，研究蝴蝶蘭新品種組培快繁技術(shù)，建立新品種種苗工廠化生產(chǎn)技術(shù)體系對加快新品種推廣至關(guān)重要。

麗影蝴蝶蘭是采用幸福鷹蝴蝶蘭和臺大夢幻蝴蝶蘭雜交選育的大紅花條紋盆栽蝴蝶蘭新品種，紅韻蝴蝶蘭是采用五唇蘭和臺大夢幻蝴蝶蘭雜交選育的中小型紫紅花盆栽蝴蝶蘭新品種，分別于2013年和2015年通過廣東省農(nóng)作物品種審定，市場前景廣闊。通過對麗影和紅韻蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)進(jìn)行研究，旨在建立這兩個品種種苗工廠化生產(chǎn)技術(shù)體系，為新品種推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣州花卉研究中心和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)合作選育的麗影與紅韻蝴蝶蘭新品種，種植于廣州花卉研究中心從化基地，常規(guī)方法管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 剪取麗影與紅韻蝴蝶蘭帶有休眠芽的花梗，流水清洗表面后把休眠芽的苞片輕輕剝?nèi)?，將花梗剪?～3 cm帶1個休眠芽的小段，洗潔精溶液浸泡5 min，流水沖洗干凈后用0.1%HgCl2溶液消毒8～15 min，再用無菌水沖洗5次。接種時用無菌解剖刀將花梗兩端分別切去0.3～0.5 cm，用無菌鑷子將花?；肯蛳虏迦胝T導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 營養(yǎng)芽誘導(dǎo) （1）HgCl2消毒時間對營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響：設(shè)8、10、15 min 3個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接30個外植體。按1.2.1方法對紅韻蝴蝶蘭花梗進(jìn)行消毒后，接種到1/2MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L培養(yǎng)基中，每瓶接1個。

（2）激素對營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響：將消毒10 min的紅韻蝴蝶蘭花梗腋芽接種到含不同濃度6-BA和NAA的1/2MS+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L+椰子汁150 mL/L培養(yǎng)基中，每瓶接1個。激素設(shè)3個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接30個外植體。

培養(yǎng)50 d后記錄外植體污染數(shù)、褐化死亡數(shù)和形成營養(yǎng)芽數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率、污染率和褐化死亡率：

1.2.3 叢生芽誘導(dǎo) 將誘導(dǎo)出來的營養(yǎng)芽切下并接種到1/2MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，50 d后將長出的叢芽切去小葉，再次接種到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)以獲得較多的叢生芽。

1.2.4 叢生芽增殖 （1）6-BA濃度對叢生芽增殖的影響：選取大小一致的營養(yǎng)芽切去葉片后以單芽接入含不同濃度6-BA的1/2MS+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L+椰子汁150 mL/L培養(yǎng)基中，每瓶接6芽。6-BA濃度設(shè)6.0、8.0、10.0 mg/L 3個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)30個芽。

（2）附加物對叢生芽增殖的影響：選取大小一致的營養(yǎng)芽切去葉片后以單芽接入含不同附加物的1/2MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L培養(yǎng)基中，每瓶接6芽。附加物為土豆（30 g/L）、椰汁（150 mL/L）和香蕉（80 g/L），以不加附加物為對照，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)30個芽。

（3）芽數(shù)對叢生芽增殖的影響：以1/2MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L+椰汁150 mL/L為基本培養(yǎng)基，設(shè)單芽、雙芽、三芽、四芽4個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)30個（叢）芽。培養(yǎng)40 d后記錄芽數(shù)（芽長≥0.5 cm）和褐化死亡的芽數(shù)，計(jì)算褐化死亡率和增殖系數(shù)：

1.2.5 生根培養(yǎng) 將生長健康的無根苗（約2 cm高）接種于添加不同濃度6-BA和NAA的1/2MS+蔗糖30 g/L+卡拉粉7.5 g/L+椰汁150 mL/L培養(yǎng)基中，每瓶接6苗。激素設(shè)3個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)30苗。培養(yǎng)40 d后記錄生根的苗數(shù)、根數(shù)（根長≥0.5cm），測量苗高，計(jì)算生根率：

試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基的pH值為5.8，接種后均置于溫度26（±1）℃、光照時間12 h/d、光強(qiáng)1 500～1 800 lx的培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2.6 移栽 將再生植株帶瓶置于室溫下煉苗1周，然后洗去根部培養(yǎng)基，用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡10 min，晾干后植入6號松樹皮（0.6～0.9 cm）基質(zhì)中，常規(guī)管理，2個月后統(tǒng)計(jì)成活數(shù)，計(jì)算成活率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽的誘導(dǎo)

2.1.1 消毒時間對紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響 消毒時間對紅韻蝴蝶蘭外植體污染率、褐化死亡率和營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率有顯著影響（表1）。在8～15 min內(nèi)，消毒時間越長，污染率越低，褐化死亡率越高，營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率越低。消毒8、10 min的褐化死亡率和營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率沒有顯著差異，但誘導(dǎo)率顯著高于消毒15 min的處理。因此紅韻蝴蝶蘭外植體適宜的消毒時間為8～10 min。

表1 消毒時間對紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響

2.1.2 激素對紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響 激素對紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)沒有顯著影響（表2）。當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L、NAA為0.2 mg/L時，營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率最高，褐化死亡率最低；當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時，營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加而略有增加，但污染率和褐化死亡率隨6-BA濃度的增加而略有下降。因此，適合紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的激素濃度為6-BA2.0 mg/L和NAA0.2 mg/L。

表2 激素濃度對紅韻蝴蝶蘭營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響

2.2 麗影和紅韻蝴蝶蘭叢生芽的增殖

2.2.1 6-BA濃度對蝴蝶蘭叢生芽增殖的影響 6-BA濃度對紅韻蝴蝶蘭和麗影蝴蝶蘭叢生芽的增殖和褐化死亡影響顯著（表3），6-BA濃度過高或過低均不利于紅韻和麗影蝴蝶蘭的芽增殖。當(dāng)6-BA濃度為8.0 mg/L，紅韻和麗影蝴蝶蘭的增殖系數(shù)最高，分別為2.31和2.22；6-BA濃度越高，叢生芽的褐化死亡率越高。適合紅韻和麗影蝴蝶蘭叢生芽增殖的6-BA濃度為8.0 mg/L。

表3 6-BA濃度對麗影和紅韻蝴蝶蘭叢生芽增殖的影響

2.2.2 附加物對蝴蝶蘭叢生芽增殖的影響 有機(jī)附加物對蝴蝶蘭叢生芽增殖影響顯著（表4）。添加30 g/L土豆汁、150 mL/L椰汁和80 g/L香蕉汁均有利于蝴蝶蘭增殖，并有一定的防褐化效果。添加150 mL/L椰汁時芽增殖系數(shù)最高，紅韻和麗影蝴蝶蘭的芽增殖系數(shù)分別是2.40和2.15，其次是添加土豆汁，添加香蕉汁的效果最差。因此，適合紅韻和麗影蝴蝶蘭芽增殖的有機(jī)附加物為150 mL/L椰汁。

表4 附加物對紅韻和麗影蝴蝶蘭叢生芽增殖的影響

2.2.3 芽數(shù)對蝴蝶蘭叢生芽增殖的影響 接種芽數(shù)對蝴蝶蘭叢生芽增殖和褐化死亡影響顯著（表5）。以單芽接入時，紅韻和麗影蝴蝶蘭的芽增殖系數(shù)最高，分別為2.21和2.29；同時褐化死亡率最低。隨著接種芽數(shù)的增加，芽增殖系數(shù)明顯降低，褐化死亡率顯著升高。因此以單芽接入培養(yǎng)基更有利于紅韻和麗影蝴蝶蘭叢生芽的增殖。

表5 芽數(shù)對蝴蝶蘭叢生芽增殖的影響

表6 激素對蝴蝶蘭叢生芽生根的影響

2.3 紅韻和麗影蝴蝶蘭的生根培養(yǎng)

將生長良好、大小一致的無根苗接種于添加不同濃度6-BA和NAA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d，結(jié)果表明，激素對紅韻和麗影蝴蝶蘭生根率沒有影響，但對生根數(shù)和株高有顯著影響（表6）。當(dāng)培養(yǎng)基中NAA濃度為1.0 mg/L、6-BA濃度為0.1 mg/L時，紅韻和麗影蝴蝶蘭試管苗的平均根數(shù)最多，分別為3.28和3.23條；平均株高最高，分別為5.96 cm和4.15 cm。

2.4 移栽

以6號松樹皮為基質(zhì)，分別移栽432株麗影和285株紅韻蝴蝶蘭試管苗，2個月后移栽成活率分別為91.58%和87.27%。

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)快速繁殖是蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)的主要方法。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅韻蝴蝶蘭花梗采用0.1%HgCl2消毒8 min，營養(yǎng)芽誘導(dǎo)率最高，麗影和紅韻蝴蝶蘭叢生芽增殖適宜的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+椰汁150 mL/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L，生根壯苗適宜的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA1.0 mg/L+椰汁150 mL/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉8.0 g/L，采用松樹皮移栽試管苗，成活率分別為91.58%和87.27%。上述結(jié)果為麗影和紅韻蝴蝶蘭新品種的種苗工廠化生產(chǎn)和推廣奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

無菌外植體獲得是種苗工廠化生產(chǎn)的首要環(huán)節(jié)。曾德華等［10］的研究表明，蝴蝶蘭花梗用0.1%升汞消毒15 min效果最好，許忠秋［8］認(rèn)為用0.1%升汞消毒12 min效果最好，沈周高等［9］對V31花梗采用0.1%升汞消毒15 min的方案。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅韻蝴蝶蘭花梗適宜消毒方案為0.1% HgCl2消毒8 min，這可能與材料及其預(yù)處理不同有關(guān)。激素對紅韻蝴蝶蘭花梗營養(yǎng)芽誘導(dǎo)無顯著影響，這與曾德華等［10］的研究結(jié)果一致。

叢生芽增殖是影響蝴蝶蘭工廠化繁殖效率的關(guān)鍵。潘學(xué)峰等［5］研究表明，滿天紅蝴蝶蘭叢生芽發(fā)生有群體效應(yīng)，采用雙芽接比單芽接的增殖效果好。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以單芽接入更有利于紅韻和麗影蝴蝶蘭叢生芽增殖，顯著提高增殖系數(shù)。激素是影響蝴蝶蘭叢生芽增殖效率的關(guān)鍵因素。潘學(xué)峰等［5］研究表明，采用6-BA12.5 mg/L+NAA0.05 mg/L，滿天紅蝴蝶蘭叢生芽增殖最好。沈周高等［9］研究表明，V31蝴蝶蘭最佳叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+KT10 mg/L+NAA0.6 mg/L+2，4-D0.2 mg/L，增殖系數(shù)為7.94。武愛龍等［11］發(fā)現(xiàn)大辣椒蝴蝶蘭不定芽增殖和分化的最佳培養(yǎng)基為花寶1號+6-BA6 mg/L+NAA0.2 mg/L，增殖系數(shù)最高達(dá)到5.53。許忠秋［8］研究表明，蝴蝶蘭叢生芽增殖的激素配方為MS+BA5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖率為2.07%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激素濃度為6-BA8 mg/L+NAA0.5 mg/L時，麗影和紅韻蝴蝶蘭叢生芽增殖最快，說明不同蝴蝶蘭品種增殖培養(yǎng)適宜的激素種類和濃度不完全相同。

褐化是蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)中常見的問題［19］。培養(yǎng)基中添加活性炭［20-22］、PVP［20-22］、檸檬酸［20，23］、半胱氨酸［20］、谷胱甘肽［20］、維生素C［20，23］、硫代硫酸鈉［20］以及熱擊處理［24］、暗培養(yǎng)［21-22］等均能有效減輕褐變。本試驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)基中加入150 mL/L椰子汁可防止褐變并促進(jìn)增殖，這與汪金萍等［19］報道的結(jié)果一致。

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Micropropagation of Phalaenopsis ‘Liying’and ‘Hongyun’

ZENG Wu-qing1，CHEN Liu-chan2，ZENG Rui-zhen2，YI Mao-sheng1，SU Qing-lian1，GUO He-rong2，LI Yang-hui1，XIE Li2
（1.Guangzhou Flower Research Center，Guangzhou 510360，China；2.College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Micropropagation of new cultivars of Phalaenopsis ‘Liying’ and Phalaenopsis ‘Hongyun’ was investigated by using of peduncle as explant. The results indicated that disinfection time had significant effect on the induction rate of vegetative shoot，after disinfected with 0.1% HgCl2for 8 minutes，the induction rate of vegetative bud was the highest，while exogenous hormones had no significant effect on the induction rate of Phalaenopsis‘Hongyun’. The concentration of 6-BA，organic additives and the number of bud in an inoculums had significant influence on bud proliferation. At the concentration of 6-BA being 8 mg/L，the proliferation coefficients of Phalaenopsis ‘Liying’ and Phalaenopsis ‘Hongyun’ were the highest，accounting for 2.31 and 2.22，respectively.Supplying coconut milk in proliferation medium was more beneficial for alleviating the browning and enhancing the proliferation coefficient compared with adding potato or banana. Single bud as an inoculum favored bud proliferation and enhanced the multiplication coefficient. Exogenous hormone had little effect on the root induction rate，but had significant effect on the mean number of root and height of plantlet. Seedling height of Phalaenopsis ‘Hongyun’ and Phalaenopsis ‘Liying’ was the highest and the mean number of root was the most on modified 1/2MS medium with 6-BA 0.1 mg/L + NAA 1 mg/L. By using pine bark as culture substrate，the survival rates of Phalaenopsis ‘Liying’and Phalaenopsis ‘Hongyun’ were 91.58% and 87.27%，respectively.

Phalaenopsis；new cultivar；tissue cutire；micropropagation ；clump shoot

S682.31

A

1004-874X（2017）08-0055-06

曾武清，陳柳嬋，曾瑞珍，等. 麗影和紅韻蝴蝶蘭快速繁殖試驗(yàn)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：55-60.

2017-05-19

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014Y2-00125）；廣州市農(nóng)業(yè)財(cái)政專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1510170，穗財(cái)農(nóng)[2016]26號）

曾武清（1968-），男，碩士，高級農(nóng)藝師，E-mail：zwq0308@126.com

謝利（1974-），女，博士，副教授，E-mail：xieli@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯 楊賢智）