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        基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點編輯小鼠MAD2L1基因及其脫靶效應分析

        2017-12-22 03:40:39陳麗香彭秀華譚丹韓鋮瀟趙銳王超李順周曉輝
        中國實驗動物學報 2017年6期
        關(guān)鍵詞:基因修飾靶點位點

        陳麗香,彭秀華,譚丹,韓鋮瀟,趙銳,王超,李順,周曉輝

        (1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508; 2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院,上海 200240)

        研究報告

        基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點編輯小鼠MAD2L1基因及其脫靶效應分析

        陳麗香1*,彭秀華1*,譚丹1,韓鋮瀟2,趙銳1,王超1,李順1*,周曉輝1*

        (1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508; 2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院,上海 200240)

        目的建立利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠MAD2L1基因第二外顯子基因編輯的方法體系,并分析CRISPR/Cas9對MAD2L1基因編輯的脫靶效應。方法通過CHOPCHOP網(wǎng)站設計位于小鼠MAD2L1基因第二外顯子的靶點序列,并構(gòu)建Cas9-MAD2L1載體,將該載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細胞中,通過嘌呤霉素篩選并結(jié)合熒光顯微鏡觀察GFP后,提取細胞轉(zhuǎn)染后的基因組DNA,利用PCR方法,結(jié)合T7E1分析和桑格爾測序,鑒定對小鼠MAD2L1基因編輯情況,并對轉(zhuǎn)染后的NIH/3T3細胞進行CRISPR/Cas9脫靶效應分析。結(jié)果將Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細胞并進行嘌呤霉素篩選后,熒光顯微鏡下觀察到大量表達GFP的細胞,PCR結(jié)合T7E1結(jié)果顯示,以轉(zhuǎn)染后的細胞DNA為模板擴增出的228 bpMAD2L1 PCR產(chǎn)物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,測序結(jié)果顯示,成功對MAD2L1基因第二外顯子靶點處進行基因編輯,脫靶效應分析未檢測到CRISPR/Cas9有對脫靶位點進行基因編輯。結(jié)論成功建立對小鼠MAD2L1基因第二外顯子進行基因編輯的方法體系,設計的對MAD2L1基因編輯靶點未檢測到脫靶效應的發(fā)生。

        CRISPR/Cas9;小鼠;MAD2L1;脫靶效應

        MAD2L1(有絲分裂阻滯缺陷蛋白2)和MAD1L1(有絲分裂阻滯缺陷蛋白1)是有絲分裂檢查點復合蛋白的重要組成部分,其中,MAD2L1基因在人中位于4號染色體,在小鼠中位于6號染色體上。Chung等[1]報道在有絲分裂前期,MAD1L1可直接招募MAD2L1與染色體著絲粒分離,該過程對實現(xiàn)MAD2L1與有絲分裂后期促進復合體(anaphase promoting complex)正調(diào)節(jié)因子CDC20相互作用是非常重要的。CDC20與MAD2L1和MAD1L1復合體直接作用可抑制有絲分裂后期促進復合體的活性,最終導致在中期—后期轉(zhuǎn)換過程中姐妹染色單體失去粘著力[2,3]。目前研究表明,在哺乳動物細胞中MAD2L1功能的破壞可影響紡錘體檢查點的功能,進而導致細胞非整倍性或腫瘤的發(fā)生。部分缺失MAD2L1的細胞(MAD2L1+/-)伴隨著染色體不穩(wěn)定(chromosome instability,CIN)現(xiàn)象的發(fā)生,在小鼠中最終導致肺癌的形成[4];在小鼠中過表達MAD2L1同樣可導致染色體不穩(wěn)定、細胞的非整倍性和腫瘤的發(fā)生[5],而染色體不穩(wěn)定是腫瘤發(fā)生的主要驅(qū)動力之一[6]。

        在過去的幾十年中,基因打靶技術(shù)(gene targeting)和基因編輯工具得到了長足的發(fā)展(如:ZFN (zinc finger nucleases)[7]、TALENs (transcription activator-like effector nucleases)[8]和CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated endonuclease cas9)[9])。其中,CRISPR/Cas9 是細菌和古細菌在長期選擇壓力中形成的一種適應性免疫防御,可用來有效抵御病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type II已經(jīng)被廣泛用于基因工程,它包含Cas9、crRNA和tracrRNA,其中crRNA含有能夠識別20 bp的靶向互補序列[10]。Cas9、crRNA和tracrRNA組成復合體,識別并結(jié)合crRNA互補的序列,然后解開DNA雙鏈,Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈,RuvC活性位點剪切非互補鏈,最終導致DNA的雙鏈斷裂(DSB),進而實現(xiàn)基因的敲除和插入。目前,CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用于對哺乳動物細胞、細菌、斑馬魚、小鼠、豬、猴的基因編輯[11-13]。

        關(guān)于MAD2L1基因敲除,F(xiàn)loris等[14]近期結(jié)合Cre/loxP系統(tǒng),利用基因打靶載體通過同源重組構(gòu)建出MAD2L1f/f小鼠,該小鼠可與表達Cre小鼠進行雜交,實現(xiàn)條件性敲除MAD2L1基因。但目前尚未見利用CRISPR/Cas9技術(shù)對小鼠MAD2L1基因敲除的報道。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對小鼠MAD2L1基因第二外顯子進行精確修飾,實現(xiàn)對小鼠MAD2L1基因敲除,以期為利用基因編輯工具CRISPR/Cas9建立MAD2L1基因敲除小鼠構(gòu)建相應癌癥模型奠定基礎,最終推動利用基因編輯工具構(gòu)建癌癥模型研究領(lǐng)域的發(fā)展[15]。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        小鼠胚胎成纖維細胞系(NIH/3T3)購買自上海酶研生物科技有限公司,大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α菌株、質(zhì)粒抽提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒、DNA Marker均購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切核酸酶和T7E1酶購買自NEB公司;胎牛血清購買自Gibco公司;pGEM-T載體、Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System購買自Promega公司;引物合成、基因測序均由上海生物工程公司完成。

        1.2 方法

        1.2.1 小鼠MAD2L1基因序列分析和基因敲除靶點序列設計

        NCBI查詢小鼠MAD2L1基因組序列(NC_000072.6)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000072.6?from=66535226&to=66541109 & report=genbank)和MAD2L1基因mRNA序列(NM_019499.4)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_019499.4)并進行序列比對,分析出MAD2L1基因含有5個外顯子。利用CHOPCHOP軟件(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)設計位于MAD2L1基因第二外顯子上20 bp的sgRNA靶點序列,靶點和PAM序列信息為5’GGGGTCAGTAGTTGTAAGCAAGG 3’。對選擇的sgRNA靶點序列設計合成引物oligo, 序列為MAD2L1F1(5’AAACACCGGGGGTCAGTAGTTGTAAGCA 3’)和MAD2L1R1(5’ CTCTAAAACTGCTTACAACTACTGACCCC 3’)。

        1.2.2 用于敲除小鼠MAD2L1的CRISPR/Cas9載體(Cas9-MAD2L1)構(gòu)建

        (1) Oligo二聚體的形成

        oligo二聚體(oligo duplex)反應體系:將合成的oligo分別稀釋成10 μmol/L后,按下列體系進行配置:上游引物1 μL;下游引物1 μL; Solution I 5 μL;補ddH2O至10 μL。反應條件:95℃ 3 min,95~25℃ (0.05℃/s),16℃ (5 min),-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        (2) Oligo二聚體插入到Cas9/gRNA載體中

        反應體系:Cas9/gRNA Vector 1 μL;oligo二聚體2 μL;補ddH2O至10 μL,25℃靜置5 min后,取5 μL連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化,挑取單菌落搖菌,提取質(zhì)粒DNA進行測序,正確插入MAD2L1靶點序列的Cas9/gRNA載體(Cas9-MAD2L1)保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染小鼠NIH/3T3細胞和嘌呤霉素篩選

        NIH/3T3細胞轉(zhuǎn)染前,將細胞鋪板到12孔板中,待細胞生長至完全匯合時,用含有不同濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基(8,7,6,5,4,3,2和1 μg/mL)培養(yǎng)細胞,確定嘌呤霉素對NIH/3T3細胞最適篩選濃度。將NIH/3T3細胞接種到12孔板中,待細胞密度達到80%匯合度時進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。用100 μL DMEM培養(yǎng)基稀釋1.6 μg Cas9-MAD2L1質(zhì)粒,為摸索最佳轉(zhuǎn)染試劑量(TransIntroTMEL),取3.2 μL或4.8 μLTransIntroTMEL分別加入到稀釋好的質(zhì)粒DNA中,輕柔混勻,室溫靜置20 min后將質(zhì)粒TransIntroTMEL復合物加入NIH/3T3細胞中,于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),轉(zhuǎn)染4 h后更換培養(yǎng)基,48 h后用含有1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行細胞陽性篩選,熒光顯微鏡觀察表達GFP的細胞數(shù)量比,待表達GFP的細胞占比較多時提取細胞基因組DNA進行后續(xù)分析(未轉(zhuǎn)染的細胞基因組DNA用于對照)。

        1.2.4 小鼠MAD2L1基因修飾分析

        用位于MAD2L1基因靶點兩側(cè)的引物MAD2L1F2(5’TCAGCGTGGCATTTATCCGT 3’)和MAD2L1R2(5’TCCATTGCTTGCTTCCTCCC 3’),擴增轉(zhuǎn)染后的細胞基因組DNA(未轉(zhuǎn)染的細胞基因組DNA用于對照),PCR反應條件為95℃ 3 min;95℃ 1 min,60℃ 1 min, 72℃ 1 min,38 cycles;72℃ 7 min,2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,如條帶單一進行PCR產(chǎn)物直接純化。分別對純化后的PCR產(chǎn)物進行變性雜交處理:純化后PCR產(chǎn)物8 μL,10× NE buffer2 2 μL,補ddH2O至19 μL,反應條件為95℃ 5 min,95℃以-2℃/s的速率降至85℃,再以-0.1℃/s的速率降至25℃,4℃保存。反應結(jié)束后,每組樣品加入1 μL T7E1酶,37℃酶切1 h,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物送樣至上海生物工程公司測序,同時PCR產(chǎn)物與pGEM-T克隆載體連接,菌落PCR鑒定后將10個單菌落送至上海生物工程公司測序。

        1.2.5 Cas9-MAD2L1脫靶效應分析

        根據(jù)Jine 等[16]報道,鑒定CRISPR/Cas9系統(tǒng)潛在脫靶位點(potential off-target site)通常選取與20 bp靶點序列3’端有10~14 bp以上同源性的位點為潛在脫靶位點。通常,與20 bp靶點序列3’端同源性越高意味著該位點是潛在脫靶位點的可能性越大。在小鼠全基因組水平上進行Cas9-MAD2L1潛在脫靶位點,并用T7E1分析該脫靶位點的潛在脫靶效應,所使用的引物信息如表1。

        表1 脫靶效應分析引物Tab.1 The primers for off-targeted analysis

        2 結(jié)果

        2.1 小鼠MAD2L1基因修飾靶點設計結(jié)果

        NCBI查詢小鼠MAD2L1基因組序列(NC_000072.6)和MAD2L1基因mRNA序列(NM_019499.4)并進行序列比對,分析出MAD2L1基因含有5個外顯子。利用CHOPCHOP軟件(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)設計位于MAD2L1基因第二外顯子上20 bp的sgRNA靶點序列 (圖1)。

        注:MAD2L1基因結(jié)構(gòu)示意圖(方框示意外顯子,橫線示意內(nèi)含子)(上),MAD2L1基因修飾靶點(紅線)和PAM區(qū)域(藍線)。圖1 小鼠MAD2L1基因修飾原理圖Note.The box indicates the exon,the horizontal line indicates the intron (above),MAD2L1 gene editing site (red line) and PAM region (blue line).Fig.1 Gene editing strategy for the mouse MAD2L1

        2.2 用于敲除小鼠MAD2L1的CRISPR/Cas9載體(Cas9-MAD2L1)構(gòu)建結(jié)果

        將連接了MAD2L1靶點序列的Cas9/gRNA質(zhì)粒DNA進行測序分析,測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為Cas9-MAD2L1。質(zhì)粒圖譜如圖2所示。

        圖2 Cas9-MAD2L1質(zhì)粒圖譜Fig.2 Map of Cas9-MAD2L1 plasmid

        2.3 熒光顯微鏡觀察嘌呤霉素篩選Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染后的NIH/3T3細胞

        NIH/3T3細胞在不同濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基(8,7,6,5,4,3,2和1 μg/mL)中培養(yǎng)48 h后,對細胞生長狀態(tài)進行觀察,嘌呤霉素對NIH/3T3細胞最適篩選濃度為1 μg/mL。Cas9-MAD2L1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞48 h后,用含有1 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基對細胞進行篩選,48 h后觀察細胞如圖3所示。

        2.4 MAD2L1基因敲除結(jié)果分析

        對加入4.8 μL或3.2 μL轉(zhuǎn)染試劑(TransIntroTMEL)的Cas9-MAD2L1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞進行嘌呤霉素篩選后,分別提取基因組DNA,命名為DNA- 4.8和DNA- 3.2。用位于MAD2L1基因修飾靶點兩側(cè)的引物擴增該兩基因組DNA,電泳檢測結(jié)果顯示樣品均擴增得到228 bp的目的片段(圖4 A)。對擴增出的228 bp目的片段進行T7E1酶切分析(圖4B),結(jié)果顯示T7E1酶將228 bp片段切割成166 bp和62 bp,而對照樣品228 bp片段沒有被T7E1酶切(圖4B)。DNA- 4.8樣品的T7E1酶切效率約50%,DNA- 3.2樣品的T7E1酶切效率約14%。以MAD2L1基因修飾的基因組DNA樣品為模板擴增出的228 bp目的片段PCR產(chǎn)物測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MAD2L1靶點序列后有雙峰結(jié)構(gòu),而野生型基因組DNA樣品為模板擴增出的228 bp目的片段PCR產(chǎn)物測序結(jié)果為單峰(圖5)。228 bp PCR產(chǎn)物TA克隆后挑選10個單克隆測序,結(jié)果表明MAD2L1基因靶點處有發(fā)生缺失1個、17個、7個、13個堿基和增加1個堿基的情況。(圖6)

        2.5 脫靶效應分析

        在小鼠全基因組水平上,對MAD2L1基因20 bp靶點序列(GGGGTCAGTAGTTGTAAGCAAGG)的脫靶位點進行比對分析,選取其中10個可能性相對較高的脫靶位點,如圖7所示。隨機選取該10個脫靶位點中的3個位點進行T7E1分析,PCR產(chǎn)物均未被T7E1酶切,結(jié)果表明Cas9-MAD2L1載體并未對所檢測的潛在脫靶位點進行基因編輯(圖8),證實Cas9-MAD2L1載體的靶點識別專一性相對較好。

        3 討論

        大量研究表明,MAD2L1基因的缺失可引起染色體不穩(wěn)定(CIN),進而驅(qū)動腫瘤的發(fā)生[17,18]。在小鼠肝臟中缺失MAD2L1基因可引起肝癌、肺癌的發(fā)生[4,14];對小鼠T細胞進行MAD2L1和p53基因敲除可導致T細胞急性淋巴母細胞性淋巴瘤(acute lymphoblastic lymphoma)的發(fā)生,最終小鼠因胸腺過大和呼吸困難于4~5月內(nèi)死亡[14]。本研究首次利用CRISPR/Cas9工具對小鼠MAD2L1基因進行精確編輯,為后續(xù)利用該基因編輯工具建立MAD2L1基因敲除小鼠或直接編輯成年鼠特定組織敲除MAD2L1基因構(gòu)建相應癌癥模型奠定基礎,在利用基因編輯工具建立癌癥小鼠模型領(lǐng)域有重要意義。

        圖3 Cas9-MAD2L1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞后嘌呤霉素篩選結(jié)果Fig.3 Puromycin screening NIH/3T3 cells after Cas9-MAD2L1 plasmid transfection

        注:A:位于MAD2L1基因修飾靶點兩側(cè)的引物擴增得到228 bp的目的片段(M:100 bp DNA marker,1:DNA- 4.8樣品,2:DNA- 3.2樣品,H2O空白對照)。B:PCR產(chǎn)物T7E1酶切分析(M:100 bp DNA marker,1:DNA- 4.8樣品,2: DNA- 3.2樣品,3:野生型DNA對照)。圖4 PCR和T7E1酶切結(jié)果分析Note.A.A pair of primer located in the two sides of MAD2L1 gene editing site was used to amplified a 228 bp fragment.(M: 100 bp DNA marker,1: DNA- 4.8 sample,2: DNA- 3.2 sample,H2O blank control).B.T7E1 analysis (M: 100 bp DNA marker,1: DNA- 4.8 sample,2: DNA- 3.2 sample,3: wild-type DNA control).Fig.4 Results of PCR and T7E1 analysis

        圖5 野生型對照DNA和MAD2L1基因修飾DNA的PCR擴增產(chǎn)物桑格爾測序分析Fig.5 Sanger sequencing analysis of PCR amplification products of wild-type control DNA and MAD2L1 gene-modified DNA

        圖6 MAD2L1基因修飾DNA的PCR擴增產(chǎn)物TA克隆后單克隆測序分析Fig.6 Monoclonal sequencing analysis of MAD2L1 gene-modified DNA PCR amplification products

        圖7 小鼠MAD2L1基因脫靶位點分析Fig.7 Off-target sites analysis for the mouse MAD2L1 gene

        注:M.100 bp DNA marker,4F/4R:脫靶位點4 (361 bp),7F/7R:脫靶位點7 (378 bp),10F/10R:脫靶位點10 (361 bp)。圖8 脫靶位點T7E1分析Note.M.100 bp DNA marker,4F/4R: off-target site 4 (361 bp),7F/7R: off-target site 7 (378 bp),10F/10R: off-target site 10 (361 bp).Fig.8 T7E1 analysis for off-target sites

        CRISPR/Cas9工具相對于傳統(tǒng)的基因打靶、ZFN和TALENs系統(tǒng)具有成本低、操作簡單、基因編輯效率高、可同時編輯多個基因等優(yōu)點,目前已廣泛應用于編輯真菌、植物、動物等物種以及人類疾病治療、新藥開放等生物醫(yī)學研究領(lǐng)域。本研究構(gòu)建的Cas9-MAD2L1質(zhì)粒攜帶有表達Cas9蛋白開放閱讀框、小鼠MAD2L1 sgRNA、GFP基因和嘌呤霉素基因。利用該質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染時,可通過嘌呤霉素抗生素進行細胞篩選,并結(jié)合熒光顯微鏡觀察表達GFP的細胞,從而可直觀初步判定發(fā)生基因編輯的細胞比例。該含有熒光標記和抗生素標記的基因編輯系統(tǒng)比不含熒光標記和抗生素的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在篩選轉(zhuǎn)染后的細胞方面較方便。本研究結(jié)合了T7E1酶切、PCR產(chǎn)物測序和單克隆測序,結(jié)果表明成功在NIH/3T3細胞中對MAD2L1基因進行了精確的編輯,為進一步利用CRISPR/Cas9工具構(gòu)建MAD2L1小鼠奠定了基礎。

        目前已報道利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯有脫靶情況的發(fā)生[19,20],Gao等[21]報道利用Cas9 nikase (Cas9D10A)或Cas9-FokI[22]可降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效率的發(fā)生。此外,利用基因編輯靶點設計軟件設計出低脫靶效率的靶點序列也是可行方法之一。本研究利用CHOPCHOP軟件設計出小鼠MAD2L1基因修飾靶點,獲得了較好的基因編輯效果。對該基因修飾靶點進行預測的脫靶位點分析,結(jié)果提示沒有檢測到該基因修飾靶點脫靶情況的發(fā)生,證實了對小鼠MAD2L1位點基因修飾的特異性。本研究結(jié)果為后續(xù)結(jié)合高壓水動力法運送CRISPR/Cas9系統(tǒng)到成年小鼠體內(nèi)敲除MAD2L1基因構(gòu)建相關(guān)癌癥小鼠模型奠定了基礎,以期最終促進相關(guān)癌癥發(fā)生的分子機制、癌癥信號通路、新型生物標記物、靶向藥物的開發(fā)和癌癥研究成果的轉(zhuǎn)化。

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        MouseMAD2L1geneeditingbyCRISPR/Cas9andanalysisofitsoff-targeteffect

        CHEN Li-xiang1*,PENG Xiu-hua1*,TAN Dan1,HAN Cheng-xiao2,ZHAO Rui1,WANG Chao1,LI Shun1*,ZHOU Xiao-hui1*

        (1.Shanghai Public Health Clinical Center,Shanghai 201508,China;2.School of Agricalture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

        ObjectiveTo establish a method for specific gene editing of the second exon of mouseMAD2L1 gene by CRISPR/Cas9,and analyze its off-target effect.MethodsThe gene editing site forMAD2L1 gene was designed by CHOPCHOP,and the Cas9-MAD2L1 vector was constructed based on the designed editing site.Cas9-MAD2L1 was then transfected into NIH/3T3 cells and screened with puromycin,followed by observing GFP expression using fluorescence microscopy.The genomic DNA from transfected cells was extracted and a partial fragment ofMAD2L1 gene was amplified by PCR.T7E1 analysis and Sangger sequencing were used for gene editing and off-target analysis.ResultsAfter Cas9-MAD2L1 transfection and puromycin screening,a large number of GFP-expressing cells were observed under the fluorescence microscope.Combined the PCR result with TE71 analysis,the amplified 228 bp PCR products can be digested into 166 bp and 62 bp fragments.The sequencing result showed that the second exon ofMAD2L1 gene was successfully edited,and the off-target effect was undetected in our system.ConclusionsThe method for specific gene editing of the second exon of mouseMAD2L1 gene by CRISPR/Cas9 is successfully established,and off-target effect ofMAD2L1 gene is not detected.

        CRISPR/Cas9; Mice;MAD2L1; Off-target effect

        LI Shun.E-mail:lishun86@126.com; ZHOU Xiao-hui.E-mail: zhouxiaohui@shaphc.org

        國家自然科學基金青年基金項目(No.31601908);上海市科技發(fā)展基金實驗動物研究項目(No.15140904000);上海市人才發(fā)展資金(No.2017043);上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題項目(No.20154Y0075);上海市公共衛(wèi)生臨床中心院內(nèi)項目(No.2016-02,KY-GW-2017-04)。

        陳麗香(1988-),女,碩士在讀,從事實驗動物模型構(gòu)建研究。E-mail:xiaripaomo@126.com;

        彭秀華(1973-),女,高級獸醫(yī)師,從事實驗動物模型構(gòu)建研究。E-mail:pengxh1973@sina.com

        李順(1986-),男,博士,助理研究員,E-mail:lishun86@126.com;

        周曉輝(1973-),男,博士,研究員,E-mail:zhouxiaohui@shaphc.org

        Q95-33

        A

        1005-4847(2017) 06-0587-07

        10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.001

        2017-05-22

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