張笑添， 張曉延， 黃賽亞， 王 倩， 劉 威

(1山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系， 山西 汾陽 032200； 2山西醫(yī)科大學醫(yī)學影像學系， 山西 太原 030001)

miRNA-101-3p靶向調(diào)控EZH2蛋白抑制胃癌細胞增殖和遷移*

張笑添1△， 張曉延1， 黃賽亞1， 王 倩2， 劉 威1

(1山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系， 山西 汾陽 032200；2山西醫(yī)科大學醫(yī)學影像學系， 山西 太原 030001)

目的研究微小RNA-101-3p (miRNA-101-3p) 對人胃癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響及其可能的調(diào)控機制。方法Real-time PCR檢測2種人胃癌細胞和1種胃黏膜細胞中miRNA-101-3p和zeste增強子同源物2 (EZH2) 的表達水平；采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術過表達miRNA-101-3p;流式細胞術檢測miRNA-101-3p對胃癌細胞周期和凋亡的影響；Transwell實驗、CCK-8法和臺盼藍染色法檢測miRNA-101-3p對胃癌細胞遷移和增殖能力的影響；Western blot法檢測EZH2的表達。結果miRNA-101-3p在胃癌細胞的表達水平顯著低于胃黏膜細胞(P<0.05)；過表達miRNA-101-3p后，流式細胞術結果顯示胃癌細胞的S期比例減少，G0/G1期比例增加，早期凋亡率增加(P<0.05)；CCK-8法、臺盼藍染色法及Transwell實驗結果顯示胃癌細胞的增殖和遷移能力顯著降低(P<0.05)；Western blot結果顯示胃癌細胞中EZH2蛋白的表達明顯下降(P<0.05)。結論miRNA-101-3p可能通過靶向負調(diào)控EZH2蛋白的表達抑制胃癌細胞的增殖和遷移，進而促進胃癌細胞凋亡。

胃癌； 微小RNA； 細胞增殖； 細胞遷移； 細胞凋亡； Zeste增強子同源物2

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，是腫瘤死亡的第2常見的原因，其生存期和預后較差[1-2]。微小RNA (microRNA, miRNA) 作為一種高度保守的小分子內(nèi)源性的非編碼RNA，可以靶向結合mRNA 3’-UTR進而調(diào)控靶基因的表達。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-101-3p在結腸癌[3]、膀胱移行細胞癌[4]、肝癌[5]和乳腺癌[6]等發(fā)揮著抑癌的作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-101-3p在胃癌中表達下降[7]，但是其對胃癌細胞周期及凋亡的研究尚未見報道。

Zeste增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是多梳家族(Polycomb group，PcG)的重要成員之一，在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞周期調(diào)控中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲都密切相關[8-9]?；诖耍狙芯繉⑻接慐ZH2在胃癌中與miRNA-101-3p的相關性，以及miRNA-101-3p對胃癌細胞增殖、遷移以及凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

miRNA反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量試劑盒購于北京天根生化有限公司；miRNA-101-3p mimics以及miRNA陰性對照(negative control, NC)購于廣州銳博生物有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；抗EZH2單克隆抗體購于Abcam；抗GAPDH多克隆抗體購于Bioworld；Transwell小室購自康寧公司；CCK-8以及細胞周期試劑盒購自碧云天生物有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于聯(lián)科生物有限公司；RIPA裂解液以及BCA定量試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胃癌細胞MGC-803和HGC-27的培養(yǎng)條件分別是RPMI-1640加10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM加10% FBS，胃黏膜細胞GES-1的培養(yǎng)條件是DMEM加10% FBS，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d取生長狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板中，每孔細胞數(shù)大約為3×105，次日細胞密度達到60%時進行轉(zhuǎn)染實驗，使用Lipofectamine 2000將miRNA-101-3p mimics或miRNA mimics NC轉(zhuǎn)入胃癌細胞MGC-803中，相應分為miRNA-101-3p mimics組、miRNA NC組及空白(blank)組，轉(zhuǎn)染8 h后，將無血清培養(yǎng)基更換為含10% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后用流式細胞術觀察轉(zhuǎn)染效率，48 h后用熒光定量PCR檢測各組胃癌細胞中miRNA-101-3p和EZH2的表達水平。

2.2Real-time PCR 胰酶消化各組細胞后使用TRIzol試劑提取細胞中的RNA。應用miRNA熒光定量PCR試劑盒檢測miRNA-101-3p的表達，以U6為內(nèi)參照。擴增條件是： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 20 s， 60 ℃ 34 s， 40個循環(huán)。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒檢測EZH2的表達，以GAPDH為內(nèi)參照。EZH2上游引物序列為5’-AAAGAAAGCCGCCCACCT-3’，下游引物序列為5’-GGTCCATCTATGTTGGGGGTA-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-GGATTTGGTGTCGTATTGGGC-3’，下游引物序列為5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。擴增條件是： 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 40個循環(huán)。擴增結束后均進行熔解曲線分析，miRNA-101-3p和EZH2的相對表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

2.3CCK-8比色法和臺盼藍染色法檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染了miRNA-101-3p mimics或miRNA NC的胃癌細胞經(jīng)胰酶消化后重新接種于96孔板中，每孔中的細胞約為3×105個，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，加入CCK-8試劑10 μL，混勻后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中1 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度(A)值，繪制生長曲線，每組設定3個復孔。采用臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)時，轉(zhuǎn)染前一天將細胞按3×108/L接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，使用臺盼藍染色后直接計數(shù)活細胞。

2.4流式細胞術檢測細胞周期和凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后，收集miRNA-101-3p mimics、miRNA NC及空白對照組的細胞，細胞數(shù)大約為1×106個，使用預冷的PBS清洗2次，用70%的乙醇固定后置于4 ℃冰箱中過夜，再用預冷的PBS洗滌細胞2次，每管分別加入PI染色液(20×)和RNase A(50×)，于37 ℃避光溫浴0.5 h后，使用流式細胞術檢測細胞周期。

轉(zhuǎn)染48 h后使用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，用上清培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，PBS清洗細胞2次，收集大約(1～5)×105個細胞，使用500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，相繼加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫避光5 min后使用流式細胞術檢測各組的凋亡率。

2.5Transwell細胞遷移實驗 轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化各組細胞并使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×108/L，取細胞懸液100 μL加在Transwell小室的上層，Transwell小室下層加入500 μL含10%血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗后使用濕棉簽輕輕拭去上室中未遷移的細胞， 4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次后使用0.1%結晶紫染色10 min，PBS清洗后隨機選取5個視野，計數(shù)下室染色細胞。

2.6Western blot實驗 收集細胞后，使用RIPA裂解液(含1% PMSF)提取細胞中的蛋白質(zhì)，使用BCA法測定蛋白濃度。取大約30 μg蛋白行10% SDS-PAGE分離蛋白，使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，抗EZH2(1∶2 000)和GAPDH(1∶5 000)抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，加入HRP標記 II 抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，ECL發(fā)光法顯影曝光，灰度值采用ImageJ軟件掃描并記錄，并分析目的蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PCR檢測結果

PCR結果顯示，miRNA-101-3p在胃癌細胞MGC-803和HGC-27中的表達量顯著低于胃黏膜細胞GES-1(P<0.05)，其中胃癌細胞MGC-803中miRNA-101-3p的表達水平最低，故以胃癌細胞MGC-803作為后續(xù)的研究對象，見圖1。轉(zhuǎn)染48 h后，與miRNA NC組相比，miRNA-101-3p mimics組的miRNA-101-3p表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，而miRNA NC組與空白組之間的差異沒有統(tǒng)計學顯著性，說明轉(zhuǎn)染成功； EZH2在miRNA-101-3p mimics組的水平顯著低于miRNA NC組和空白組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The expression of miRNA-101-3p in gastric mucosal cells and gastric cancer cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsGES-1.

圖1Real-timePCR檢測胃黏膜細胞和胃癌細胞中mi-RNA-101-3p的表達水平

Figure 2. The expression levels of miRNA-101-3p and EZH2 mRNA in MGC-803 cells after transfected with miRNA-101-3p mimics for 48 h were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics group.

圖2Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染48h后miRNA-101-3p和EZH2mRNA的表達水平

2 轉(zhuǎn)染效率的評價

轉(zhuǎn)染24 h后，使用熒光顯微鏡觀察，結果顯示大約90%以上的細胞均呈紅色熒光蛋白Cy3陽性，并進一步使用流式細胞儀進行分選，結果說明轉(zhuǎn)染成功，見圖3。

3 miRNA-101-3p對胃癌細胞增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染后使用CCK-8法測定各組細胞的吸光度(A)值，結果顯示，miRNA-101-3p mimics組在48和72 h時其吸光度值明顯低于miRNA NC組和空白對照組(P<0.05)，而miRNA NC組和空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4A；同時采用臺盼藍染色法計數(shù)轉(zhuǎn)染后活細胞數(shù)量，結果顯示，miRNA-101-3p mimics組的活細胞數(shù)量顯著低于miRNA NC組和空白對照組(P<0.05)，而miRNA NC組和空白對照組之間的活細胞數(shù)量沒有統(tǒng)計學顯著性，見圖4B。此結果說明過表達miRNA-101-3p后胃癌細胞MGC-803的生長受到抑制，細胞活力明顯降低。

Figure 3. The transfection efficiency after transfected with miRNA-101-3p mimics for 24 h (×200). A: the MGC-803 cells under phase-contrast microscope; B: the image of Cy3 positive staining of MGC-803 cells under fluorescence microscope； C: the intensity of red fluorescence in MGC-803 cells analyzed by flow cytometry.

圖3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24h細胞轉(zhuǎn)染效率

Figure 4. The effect of miRNA-101-3p overexpression on the proliferation of gastric cancer cells. A: the viability of gastric cancer MGC-803 cells was dectected by CCK-8 assay； B: the number of gastric cancer cells was counted by trypan blue staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

圖4過表達miRNA-101-3p對胃癌細胞MGC-803增殖的影響

4 miRNA-101-3p對胃癌細胞周期的影響

過表達miRNA-101-3p 48 h后，胃癌細胞的S期比例為(27.39±0.66)%，顯著低于NC組和空白對照組，而細胞分裂處于G0/G1期的胃癌細胞明顯增多(P<0.05)，說明過表達miRNA-101-3p可以導致胃癌細胞出現(xiàn)G1期阻滯，進而抑制細胞的增殖，見圖5。

5 miRNA-101-3p對胃癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，過表達miRNA-101-3p 48 h后，胃癌細胞早期凋亡率為(15.62±1.26)%，明顯高于NC組(6.20±1.07)%和空白對照組(4.54±1.32)%(P<0.05)，說明miRNA-101-3p過表達可以促進胃癌細胞出現(xiàn)凋亡，見圖6。

6 miRNA-101-3p對胃癌細胞遷移能力的影響

Transwell細胞遷移實驗的結果顯示，過表達miRNA-101-3p后，胃癌細胞的遷移能力顯著降低，遷移的細胞數(shù)明顯低于miRNA NC組和空白對照組(P<0.05)，說明過表達miRNA-101-3p可以抑制胃癌細胞遷移，見圖7。

7 miRNA-101-3p對EZH2的影響

利用在線軟件TargetScan進行生物信息學分析，預測結果顯示，EZH2是miRNA-101-3p的潛在靶基因。為了進一步確認miRNA-101-3p對EZH2基因的調(diào)控，Western blot實驗結果顯示，過表達miRNA-101-3p后，EZH2的表達明顯低于NC組和空白對照組(P<0.05)，而NC組和空白對照組之間EZH2的表達沒有顯著變化，說明miRNA-101-3p可以抑制胃癌細胞MGC803中EZH2蛋白的表達；而胃癌細胞MGC-803和HGC-27中EZH2的水平顯著高于胃黏膜細胞GES-1(P<0.05)，見圖8。

Figure 5. The effect of miRNA-101-3p overexpression on the cell cycle distribution of gastric cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

圖5過表達miRNA-101-3p對胃癌細胞周期的影響

Figure 6. The effect of miRNA-101-3p overexpression on the apoptosis of gastric cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

圖6過表達miRNA-101-3p對胃癌細胞凋亡的影響

Figure 7. The effect of miRNA-101-3p on the migration ability of gastric cancer cells detected by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics.

圖7Transwell遷移實驗檢測miRNA-101-3p對胃癌細胞遷移能力的影響

Figure 8. The protein expression of EZH2 in gastric cancer cells and gastric mucosal cells was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiRNA-101-3p mimics；#P<0.05vsGES-1.

圖8Westernblot實驗檢測胃癌細胞和胃黏膜細胞中EZH2的蛋白表達

討 論

miRNA做為一種非編碼RNA，可以調(diào)控機體許多生理和病理過程，大約30%的編碼蛋白基因被miRNA所調(diào)控[10]。miRNA-101-3p在多種腫瘤中表達下調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中下調(diào)的miRNA-101-3p可以靶向調(diào)控髓細胞白血病基因1 (myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖[5]；在乳腺癌中，miRNA-101-3p與生存期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，并且可能通過調(diào)控CXC趨化因子受體7(CXC chemokine receptor, CXCR7)影響體內(nèi)細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、B細胞白血病/淋巴瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloprotein 2,MMP2)、MMP-9和上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)等蛋白的表達，進而抑制乳腺癌細胞的增殖[6]。在本研究中，miRNA-101-3p在胃癌細胞中的表達下調(diào)，為了進一步研究miRNA-101-3p對胃癌細胞增殖、凋亡以及遷移的影響，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術過表達胃癌細胞中miRNA-101-3p的水平，結果顯示上調(diào)miRNA-101-3p的水平后，胃癌細胞的生長和遷移能力明顯受到抑制，細胞S期明顯減少，G0/G1期延長，細胞阻滯于G0/G1期，而細胞的早期凋亡率明顯增加；以上結果說明，miRNA-101-3p在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到了抑癌基因的作用。

EZH2是表觀遺傳調(diào)控因子PcG蛋白的核心組件，在多種腫瘤[11-12]中表達增高，是腫瘤治療的潛在靶點。已有研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，胃癌組織中EZH2的表達明顯增高，而且與生存期密切相關。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)了胃癌細胞中EZH2的表達高于胃黏膜細胞；有學者發(fā)現(xiàn)[15]，沉默胃癌細胞中EZH2的表達后可以誘導P53和組蛋白脫乙酰酶1(histone deacetylase 1, HDAC1)的表達，同時抑制cyclin D1和cyclin E的表達進而調(diào)控細胞的增殖; Bai等[16]也發(fā)現(xiàn)，抑制EZH2的表達后可以抑制胃癌細胞SGC-7901的生長，激活p21和p16的表達，進而調(diào)控細胞周期；吳雪雷等[17]發(fā)現(xiàn) EZH2可以通過核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB) 而抑制胃癌細胞的生長；還有的學者發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA 00152可通過結合EZH2而抑制p15和p21的表達，進而促進胃癌的進展[18]，可見EZH2基因可能成為治療胃癌的重要靶點。在本研究中，通過生物學信息預測EZH2基因可能是miRNA-101-3p的潛在靶基因，也有學者[19]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌和乳腺癌中EZH2基因受到miRNA-101-3p的靶向調(diào)控；而在其它腫瘤如膀胱癌[20]和肝癌[21]中通過雙熒光素報告基因也驗證了miRNA-101-3p對EZH2基因的靶向調(diào)控；本研究中，Western blot實驗顯示胃癌細胞中EZH2的表達顯著高于胃黏膜細胞，同時miRNA-101-3p的表達則低于胃黏膜細胞，而在上調(diào)胃癌細胞中的miRNA-101-3p后，EZH2的表達則明顯下調(diào)。因此我們推斷，在胃癌中EZH2與miRNA-101-3p的水平有可能呈負相關，并由于miRNA-101-3p下調(diào)，使得其對EZH2基因的負調(diào)控作用減弱， EZH2的表達增加，而增高的EZH2蛋白又會影響E-cadherin[22]、整合素2[23]和印跡基因CDKN1C(p57KP12)[24]等的表達，從而最終促進了腫瘤的演進。

綜上所述，miRNA-101-3p可能通過靶向負調(diào)控EZH2基因的表達，進而抑制胃癌細胞的生長和遷移，促進胃癌細胞的凋亡。miRNA-101-3p有望成為治療胃癌的重要靶點。

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miRNA-101-3p inhibits proliferation and migration of gastric cancer cells by targeting EZH2

ZHANG Xiao-tian1, ZHANG Xiao-yan1, HUANG Sai-ya1, WANG Qian2, LIU Wei1

(1DepartmentofMedicalLaboratoryScience,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China；2DepartmentofMedicalImaging,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail: 116048164@qq.com)

AIM: To investigate the role of microRNA-101-3p (miRNA-101-3p) on the proliferation, apoptosis and invasion of gastric cancer cells and the possible regulatory mechanisms.METHODSThe expression of miRNA-101-3p in two kinds of gastric cancer cells and a gastric mucosal cell line was detected by real-time PCR. The miRNA-101-3p was overexpressed by Lipofectamine 2000 transfection with miRNA-101-3p mimics. The effects of miRNA-101-3p on cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The effects of miRNA-101-3p on cell proliferation and migration abilities were detected by CCK-8 assay, trypan blue exclusion test and Transwell assay. The protein expression of enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) was determined by Western blot.RESULTSThe expression of miRNA-101-3p in gastric cancer cells was lower than that in gastric mucosal cells (P<0.05). The gastric cancer cell MGC-803 had the lowest expression level of miRNA-101-3p. The result of flow cytometry showed that the population of S phase was reduced, and the population of G0/G1phase and the early stage apoptotic rate were increased after the expression of miRNA-101-3p was overexpressed (P<0.05). The results of CCK-8 assay, trypan blue exclusion test and Transwell assay showed that overexpression of miRNA-101-3p significantly reduced the proliferation and migration abilities of gastric cancer cells (P<0.05). Overexpression of miRNA-101-3p decreased the protein level of EZH2 (P<0.05).CONCLUSIONmiRNA-101-3p may suppresses the gastric cancer cell proliferation and migration, and promotes the gastric cancer cell apotosis by down-regulation of EZH2.

Gastric cancer; MicroRNA; Cell proliferation; Cell migration; Apotosis; Enhancer of zeste homolog 2

1000- 4718(2017)12- 2143- 08

2017- 07- 17

2017- 11- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81301426)；山西醫(yī)科大學汾陽學院科研項目(No. 2017B05)

△通訊作者 Tel: 0358-2100372； E-mail: 116048164@qq.com

R735.2; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.006

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)