陳寧南, 萬 強
(1江西省人民醫(yī)院急診科, 2江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管病科, 江西 南昌 330006)
小檗堿減輕幽門螺桿菌誘導的人胃黏膜上皮細胞損傷*
陳寧南1, 萬 強2△
(1江西省人民醫(yī)院急診科,2江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管病科, 江西 南昌 330006)
目的探討小檗堿(Ber)對幽門螺桿菌(Hp)誘導的人胃黏膜上皮細胞GES-1損傷的保護作用及機制。方法采用Hp感染GES-1細胞,加入小檗堿(5,10和20 μmol/L)和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)抑制劑PD98059(20 μmol/L)共培養(yǎng)。MTT法檢測細胞活力,流式細胞術檢測細胞凋亡,ELISA法檢測細胞白細胞介素(IL)-1β及IL-8的水平,比色法檢測細胞乳酸脫氫酶(LDH)活性并以Western blot法檢測細胞Bax、Bcl-2、p-ERK1/2的蛋白水平。結果與對照組比較,Hp可抑制GES-1細胞活力、促進GES-1細胞凋亡、誘導GES-1細胞分泌IL-1β和IL-8、增加LDH活性、增加GES-1細胞內(nèi)p-ERK1/2及Bax蛋白水平并降低Bcl-2蛋白水平,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與Hp感染組比較,中、高劑量小檗堿均可逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細胞活力、細胞凋亡、細胞IL-1β及IL-8分泌、LDH活性和GES-1細胞內(nèi)p-ERK1/2、Bax及Bcl-2蛋白水平的影響,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與高劑量小檗堿組比較,PD98059聯(lián)合小檗堿可進一步逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細胞上述指標的影響,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。結論小檗堿可通過抗炎、增加細胞活力和抗凋亡來減輕Hp誘導的GES-1細胞損傷,其機制可能與抑制ERK1/2通路有關。
小檗堿; 幽門螺桿菌; 細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2; 人胃黏膜上皮細胞
幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是革蘭陰性微需氧菌,生存于胃和十二指腸內(nèi),感染后誘發(fā)的胃黏膜慢性炎癥可損傷胃黏膜上皮細胞,發(fā)展為慢性活動性胃炎、胃和十二指腸潰瘍,甚至參與胃淋巴瘤與胃癌的形成[1]。臨床上多使用2種抗生素加質(zhì)子泵抑制劑的三聯(lián)療法治療Hp感染,但長期使用可顯著增加Hp耐藥,導致Hp根除率下降[2]。中醫(yī)藥對于慢性胃炎的療效確切且副作用低,因此,積極研究并開發(fā)抑制Hp的中藥或單體具有重要的醫(yī)學價值。小檗堿(berberine,Ber)又名黃連素,是從黃連、黃柏和伏?;ǖ戎兴幹参镏刑崛〉漠愢飰A,體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具顯著的抑菌作用,臨床廣泛用于治療胃腸感染和細菌性痢疾等消化性疾病[3]。研究表明,小檗堿可顯著抑制由Hp感染導致的慢性胃炎的形成[4],但具體分子機制有待進一步研究。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)信號通路參與了調(diào)控炎癥反應、細胞增殖及細胞凋亡等多種生理及病理進程[5]。為進一步探討小檗堿在慢性胃炎中的可能作用靶點,本研究采用Hp感染人胃黏膜上皮GES-1細胞,加入小檗堿及ERK1/2選擇性阻滯劑PD98059干預,探討小檗堿對Hp誘導GES-1細胞損傷的影響及可能機制,為小檗堿的臨床應用提供實驗依據(jù)。
GES-1細胞株購于上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司;鹽酸小檗堿(HPLC≥98%)和MTT干粉均購自Sigma;Hp菌株購自ATCC細胞庫;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Invitrogen;PD98059購自Tocris Bioscience;胎牛血清購自Gibco;抗Bax、Bcl-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2及β-actin抗體均購自Abcam;白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-8 ELISA試劑盒均購自eBioscience;乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自Beyotime。ST16型冷凍高速離心機購自Thermo;MK3型酶標儀、164-5050型電泳儀和2401型CO2細胞培養(yǎng)箱均購自Bio-Rad;FACSCalibur型流式細胞儀購自BD;DMI3000B型熒光倒置顯微鏡購自Leica。
2.1Hp與GES-1細胞共培養(yǎng)及實驗分組 將GES-1細胞接種至培養(yǎng)皿,置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細胞融合80%時傳代。以無菌PBS液重懸Hp,2 000 r/min離心5 min,棄上清液后加含2% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,調(diào)整Hp菌液濃度為1×1012CFU/L。GES-1細胞分為6組:(1)對照(control)組:只加RPMI-1640培養(yǎng)基;(2)Hp感染(Hp)組:加Hp菌液,以細菌∶細胞為200∶1的比例共培養(yǎng)24 h;(3)~(5)分別為小檗堿低劑量(Hp+Ber 5 μmol/L)、小檗堿中劑量(Hp+Ber 10 μmol/L)和小檗堿高劑量(Hp+Ber 20 μmol/L)組:分別以小檗堿(5、10和20 μmol/L)[6]預處理GES-1細胞30 min后,再加Hp菌液,以細菌∶細胞為200∶1的比例(預實驗結果)共培養(yǎng)24 h;(6)PD98059組:以小檗堿20 μmol/L預處理GES-1細胞30 min后,加20 μmol/L PD98059[7]處理細胞30 min,再加Hp菌液以細菌∶細胞為200∶1的比例共培養(yǎng)24 h。
2.2MTT法檢測細胞活力 將GES-1細胞按每孔1×104個接種至96孔板,每組設6個復孔,24 h后撤去血清,加入5 g/L的MTT液20 μL,培養(yǎng)4 h,棄上清液后,每孔加DMSO 150 μL,振蕩溶解10 min,以570 nm為測定波長檢測吸光度(A)值。細胞活力抑制率(%)=[1-(實驗組A值/對照組A值)]×100%。
2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 將GES-1細胞按每孔2×105個接種至12孔板,24 h后換無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,1 000 r/min離心5 min,加Annexin V-FITC及PI按說明書方法孵育,1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測GES-1細胞的凋亡率。
2.4LDH活性及IL-1β和IL-8水平的測定 將GES-1細胞以1×104個接種至培養(yǎng)皿,收集上清液,用比色法測LDH活性,ELISA檢測IL-1β及IL-8水平,檢測按照試劑盒說明書操作。
2.5Western blot檢測Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白的表達 提取GES-1細胞總蛋白,BCA法測蛋白濃度,100 ℃變性蛋白5 min,凝膠電泳,蛋白半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加相應 I 抗(1∶1 000)于4 ℃孵育后,再加 II 抗(1∶2 000)于室溫下孵育,ECL顯影并拍照。Quantity One軟件條帶分析灰度,以β-actin作內(nèi)參照。
采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩組間比較用Bonferroni法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
與對照組比較,Hp可顯著抑制GES-1細胞活力,差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與Hp感染組比較,小檗堿中、高劑量干預均可逆轉(zhuǎn)Hp抑制GES-1細胞活力的作用,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與小檗堿高劑量組比較,加入PD98059干預可進一步逆轉(zhuǎn)Hp抑制GES-1細胞活力的作用,差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見表 1。
與對照組比較,Hp可顯著誘導GES-1細胞凋亡,差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01);與Hp感染組比較,小檗堿中、高劑量干預均可逆轉(zhuǎn)Hp誘導的GES-1細胞凋亡,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與小檗堿高劑量組比較,加入PD98059干預可進一步逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細胞凋亡的影響,差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見表1。
表1小檗堿及PD98059對GES-1細胞活力及凋亡的影響
Table 1. The effects of berberine and PD98059 on the viability and apoptotic rate of GES-1 cells (Mean±SD.n=3)
GroupInhibitoryrateofcellactivity(%)Apoptoticrate(%)Control-10.53±2.18Hp41.63±6.14*36.47±5.52**Hp+Ber5μmol/L40.55±6.0235.91±5.97Hp+Ber10μmol/L28.13±5.19#28.13±4.48#Hp+Ber20μmol/L21.69±4.52#22.63±4.71#PD9805915.34±4.27#▲14.12±3.29#▲
*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.
與對照組比較,Hp可增加GES-1細胞上清中IL-1β和IL-8水平并增加LDH活性,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與Hp感染組比較,小檗堿中、高劑量干預均可逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細胞上清中IL-1β及IL-8水平及LDH活性的影響,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與小檗堿高劑量組比較,加入PD98059干預可進一步增強小檗堿的作用,IL-1β、IL-8水平及LDH活性進一步降低,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見表2。
表2小檗堿及PD98059對GES-1細胞LDH活性及IL-1β、IL-8水平的影響
Table 2. The effects of berberine and PD98059 on LDH activity, IL-1β and IL-8 levels of GES-1 cells (Mean±SD.n=3)
GroupLDH(U/L)IL-1β(ng/L)IL-8(ng/L)Control462.73±51.534.47±1.3620.76±6.61 Hp1481.27±130.62*90.13±9.04*215.88±23.73*Hp+Ber5μmol/L1476.52±137.8388.78±9.32212.50±21.85Hp+Ber10μmol/L1206.18±125.23#61.27±8.52#168.03±17.63#Hp+Ber20μmol/L871.86±103.24#37.38±7.98#104.74±12.47#PD98059609.54±82.13#▲20.42±5.59#▲59.36±10.71#▲
*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.
與對照組比較,Hp可增加GES-1細胞中Bax及p-ERK1/2的蛋白水平,并降低Bcl-2的蛋白水平,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與Hp感染組比較,小檗堿中、高劑量干預均可逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細胞中Bax、p-ERK1/2和Bcl-2蛋白水平的影響,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05);與小檗堿高劑量組比較,加入PD98059干預可進一步增強小檗堿的作用,差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖1。
1983年,Marshall等[8]利用螺桿菌培養(yǎng)技術從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜組織中首次成功分離Hp。Hp是目前所知唯一能在人胃中生存的微生物種類[9]。Hp感染后產(chǎn)生的尿素酶、黏液酶、脂多糖、磷脂酶、蛋白酶和過氧化物歧化酶等致病因子,可降低正常胃黏膜分泌的黏液中黏蛋白含量, 破壞黏液完整性,從而破壞胃黏膜屏障,導致慢性胃炎的發(fā)生[10]。
Hp還可破壞胃黏膜上皮的完整性。Hp感染后導致胃黏膜上皮細胞增殖與凋亡的平衡紊亂,可引起慢性胃炎和消化性潰瘍等相關疾病的發(fā)生。Bax和Bcl-2是bcl-2基因家族中對于細胞凋亡起了調(diào)控作用的重要成員。bax是促凋亡基因,位于細胞質(zhì),可直接結合到線粒體膜上,改變細胞膜通透性,引起細胞色素C釋放并激活caspases家族,從而促進細胞凋亡;bcl-2是抑凋亡基因,可通過抑制細胞線粒體膜電位的下降,減少細胞色素C釋放進入細胞質(zhì),從而抑制細胞凋亡[11-13]。本研究中MTT檢測結果顯示,Hp可顯著抑制GES-1細胞活力;流式細胞術檢測結果顯示Hp可增加GES-1細胞凋亡;Western blot檢測結果顯示Hp可增加GES-1細胞內(nèi)Bax蛋白水平并減少Bcl-2蛋白水平,證實Hp可抑制GES-1細胞生長,并通過調(diào)控Bax及Bcl-2水平而促進GES-1細胞凋亡。
Figure 1. The effects of berberine and PD98059 on the protein levels of Bax, Bcl-2 and p-ERK1/2 in the GES-1 cells. A: control group; B: Hp group; C: Hp+Ber 5 μmol/L group; D: Hp+Ber 10 μmol/L group; E: Hp+Ber 20 μmol/L group; F: PD98059 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.
圖1小檗堿及PD98059對GES-1細胞Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白水平的影響
Hp感染可誘導胃黏膜上皮炎癥細胞的浸潤,釋放IL-1β和IL-8等前炎癥介質(zhì),IL-1β和IL-8觸發(fā)的級聯(lián)反應可進一步導致細胞間黏附分子1和上皮細胞黏附分子過度活化,引起胃黏膜固有層中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞等聚集從而促進慢性胃炎的發(fā)生[14]。LDH是一種存在于機體所有組織細胞的細胞質(zhì)內(nèi)的糖酵解酶,當細胞受到損傷時細胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶及細胞膜結構均發(fā)生改變,增加細胞膜通透性,使細胞外液LDH漏出量增加,因此LDH活性的高低可反映細胞損傷的程度[15]。本研究中ELISA法及比色法檢測結果顯示,Hp可增加GES-1細胞IL-1β及IL-8水平并增加LDH活性,證實Hp可誘導炎癥導致GES-1細胞損傷。
既往研究表明,小檗堿在體內(nèi)及體外均具有較強的抗Hp感染作用[4]。隨著抗生素在Hp根除治療中廣泛應用,Hp多重耐藥的發(fā)生率日益上升。主動外排系統(tǒng)hefA基因的高表達可導致體外人工誘導Hp多重耐藥的發(fā)生[16],小檗堿可通過下調(diào)hefA mRNA的表達,顯著減輕四環(huán)素和阿莫西林等抗生素引起的Hp多重耐藥的發(fā)生[17]。ERK1/2信號通路是細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路家族的重要成員,可以被生長因子、離子射線和過氧化氫等激活,參與了調(diào)控炎癥反應、細胞增殖及凋亡等多種生理及病理進程[5]。PD98059是常用的ERK1/2高效選擇性阻滯劑,能特異地抑制MAPK激酶介導的MAPK活化,不會直接抑制ERK1/2[18]。本研究結果表明,Hp可顯著增加GES-1細胞中p-ERK1/2的蛋白水平;小檗堿干預后可顯著逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細胞的影響;加入PD98059干預可進一步增強小檗堿的藥理作用,提示小檗堿減輕Hp誘導的GES-1細胞損傷的機制可能與抑制ERK1/2通路有關。
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Effect of berberine on Helicobacter pylori-induced human gastric epithe-lial cells injury
CHEN Ning-nan1, WAN Qiang2
(1EmergencyDepartment,JiangxiProvincialPeople’sHospital,2DepartmentofMedicalCardiology,TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.E-mail:wanqiang109559140@163.com)
AIM: To investigate the effect of berberine (Ber) onHelicobacterpylori(Hp)-induced human gastric epithelial cells (GES-1) injury and the underlying mechanism.METHODSBerberine (5, 10 and 20 μmol/L) and PD98059 (20 μmol/L), a selective inhibitor of extracellular regulated protein kinases (ERK)1/2 signaling pathway, were added to Hp-infected GES-1 cells. The cell activity and apoptosis, the levels of interleukin (IL)-1β and IL-8, lactic dehydrogenase (LDH) activity and the protein levels of Bax, Bcl-2 and p-ERK1/2 in the GES-1 cells were determined by MTT assay, flow cytometry, ELISA, colorimetry and Western blot, respectively.RESULTSCompared with control group, Hp significantly inhibited the cell activity, increased the apoptotic rate, LDH activity, IL-1β and IL-8 levels, the Bax and p-ERK1/2 protein levels but decreased the Bcl-2 protein level in GES-1 cells (P<0.05). However, these effects of Hp were reversed by berberine at medium-dose and high-dose, as compared with the Hp-infected GES-1 cells (P<0.05). Moreover, the protective effects of berberine were significantly enhanced by the co-incubation of berberine with PD98059, as compared with the berberine at higher dose (P<0.05).CONCLUSIONBerberine may attenuate Hp-induced human gastric epithelial GES-1 cells injury by anti-inflammation, promoting cell growth and anti-apoptosis via the inhibition of ERK1/2 signaling pathway.
Berberine;Helicobacterpylori; Extracellular regulated protein kinase 1/2; Human gastric epithelial cells
1000- 4718(2017)12- 2283- 04
2017- 06- 21
2017- 08- 02
國家自然科學基金資助項目(No. 81660770);江西省自然科學基金資助項目(No. 20161BAB215256);江西省衛(wèi)生計生委科技計劃(No. 20171105);江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研課題(No. 2016A083)
△通訊作者 Tel: 0791-86360490; E-mail: wanqiang109559140@163.com
R285.5; R363
A
10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.028
(責任編輯: 盧 萍, 余小慧)